小豆五出復(fù)葉pcl突變基因的精細(xì)定位和轉(zhuǎn)錄分析

劉 震 鄧 勇 趙超綺 星君宜 萬 平 楊 凱

（北京農(nóng)學(xué)院，植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

小豆［Vigna angularis（Willd）Ohwi &Ohashi］，別名紅小豆、赤豆等，為一年生草本植物［1］，隸屬豆科（Leguminosae）豇豆屬（Vigna）［2］。小豆是我國主要的食用豆類之一，已有上千年的栽培歷史［3］，種質(zhì)資源極為豐富，但對(duì)小豆農(nóng)藝性狀的研究卻很薄弱。2015年，Yang 等［4］完成了小豆全基因組測(cè)序，從基因組層次加快了對(duì)小豆農(nóng)藝性狀的研究分析。

葉片是小豆進(jìn)行光合作用的重要器官，其在產(chǎn)量和品質(zhì)的形成中發(fā)揮著重要作用［5］。多數(shù)豆科作物為復(fù)葉植物，其復(fù)葉形態(tài)能夠直接影響光合特性和生物量積累。前人研究表明，綠豆多小葉復(fù)葉種質(zhì)增加了葉面積指數(shù)，能更有效地吸收光能，同時(shí)綠豆七小葉復(fù)葉品系促進(jìn)了產(chǎn)量提高［6］；宗春美等［7-8］研究發(fā)現(xiàn)，大豆五小葉復(fù)葉品系牡5796-3具有較好的豐產(chǎn)性能。

突變體是開展作物遺傳研究和育種的基礎(chǔ)，具有優(yōu)良性狀的突變體可以為育種、科研和生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。宗春美等［8］創(chuàng)制了一個(gè)多小葉大豆品系牡5796-3，初步得到了多小葉性狀的遺傳規(guī)律。Chontira 等［9］也通過輻射獲得了綠豆多小葉性狀的突變體。Wang 等［10］發(fā)現(xiàn)了一種起源于野生大豆的多小葉突變體，可創(chuàng)制抗病材料［11］。這些研究豐富了豆科多小葉突變體的種質(zhì)資源，為探究豆科植物復(fù)葉調(diào)控模式提供了優(yōu)質(zhì)材料。

目前在豌豆（Pisum sativum）突變體中發(fā)現(xiàn)了uni單葉突變體［12］、cri異位小葉突變體［13］以及能夠降低葉片復(fù)雜程度的stp突變體［14］。在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中發(fā)現(xiàn)了sgl1單葉突變體［15］、palm1五出復(fù)葉突變體［16］、pinna1五出復(fù)葉突變體［17］。在綠豆（Vigna radiata）中發(fā)現(xiàn)了un單葉突變體［18］。在百脈根（Lotus japonicus）中發(fā)現(xiàn)了能夠?qū)е? 片小葉有不同程度融合，嚴(yán)重時(shí)5片小葉融合為1片葉的uml突變體［19］。但目前與小豆復(fù)葉發(fā)育相關(guān)的突變體研究還鮮有報(bào)道。

因此，北京農(nóng)學(xué)院小豆課題組（本課題組）前期通過使用電子束射線在北京輻射中心對(duì)京農(nóng)6 號(hào)供試種子進(jìn)行輻射，在其輻射后代中篩選出一株五小葉復(fù)葉個(gè)體。該突變體較常規(guī)三小葉復(fù)葉小豆品種多了2 個(gè)小葉，經(jīng)多代自交，獲得了可穩(wěn)定遺傳的五出復(fù)葉葉型材料。本研究以小豆五出復(fù)葉突變體為材料，對(duì)小豆復(fù)葉發(fā)育調(diào)控基因進(jìn)行遺傳分析與圖位克隆，確定五出復(fù)葉發(fā)育調(diào)控候選基因，并對(duì)野生型和突變體小豆進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析突變性狀關(guān)鍵候選基因可能的調(diào)控途徑與功能，以期對(duì)小豆復(fù)葉發(fā)育的遺傳調(diào)控提供研究方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

三出復(fù)葉小豆栽培品種GM635 與五出復(fù)葉突變體EB601 由北京農(nóng)學(xué)院小豆課題組提供：使用300 Gy計(jì)量電子束處理小豆栽培品種京農(nóng)6號(hào)，在后代中發(fā)現(xiàn)一株五出復(fù)葉突變體（圖1），經(jīng)過5 代自交獲得遺傳穩(wěn)定的五出復(fù)葉材料（EB601），復(fù)葉性狀基因暫定名為pcl（pentafoliate compound leaf）。

圖1 三出復(fù)葉和五出復(fù)葉的表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics of ternately and pentafoliate leaf

構(gòu)建EB601×GM635 雜交組合，F(xiàn)1均為三出復(fù)葉表型，F(xiàn)2出現(xiàn)性狀分離，收獲F2單株，選用F2∶3株系用于遺傳分析和基因初定位，F(xiàn)3∶4分離群體用于基因精細(xì)定位。

1.2 農(nóng)藝性狀分析

小豆農(nóng)藝性狀調(diào)查按照《小豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［20］進(jìn)行。

1.3 突變體遺傳分析與基因定位

1.3.1 突變體遺傳分析 構(gòu)建EB601×GM635雜交組合，調(diào)查F2∶3株系農(nóng)藝性狀并記錄三出復(fù)葉和五出復(fù)葉表型，進(jìn)行突變體遺傳分析。

1.3.2 小豆基因組DNA 提取 采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法［21］提取小豆基因組DNA。

1.3.3pcl的初步定位 利用自主開發(fā)的小豆1 572對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記，對(duì)親本和F2∶3株系差異性狀個(gè)體基因組DNA 分別混池，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增篩選。找出與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記，再通過F2∶3家系對(duì)標(biāo)記進(jìn)行群體驗(yàn)證。PCR 反應(yīng)體系共15 μL：5 U·μL-1TaKaRa Taq 0.25 μL，10 μmol·L-1正反引物各1 μL，1 mmol·L-1dNTPs 1.5 μL，1.5 mmol·L-1Mg2+1 μL，50 ng 小豆基因組DNA 2 μL，10×PCR Buffer 1.5 μL，ddH2O 6.75 μL；PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃終延伸10 min，35個(gè)循環(huán)。

1.3.4pcl的精細(xì)定位 提取F3∶4家系中個(gè)體和親本的基因組DNA；三出復(fù)葉親本和五出復(fù)葉親本各取5 株DNA 樣本分別等量混池，F(xiàn)3∶4家系中三出復(fù)葉個(gè)體和五出復(fù)葉個(gè)體各取50 株DNA 樣本分別等量混池。通過高通量測(cè)序技術(shù)（“next-generation” sequencing technology，NGS）和集群分離分析法（super bulked segregant analysis，Super BSA）以及特異位點(diǎn)擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)（specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq）對(duì)親本混池和差異個(gè)體混池進(jìn)行測(cè)序分析，開發(fā)差異位點(diǎn)?；跀?shù)據(jù)結(jié)果使用Oligo 7.0 軟件開發(fā)SSR 與單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）標(biāo)記，構(gòu)建三出復(fù)葉個(gè)體基因組DNA混池（10株）和五出復(fù)葉個(gè)體基因組DNA混池（10株），對(duì)親本和2個(gè)差異性狀個(gè)體基因組DNA混池進(jìn)行引物篩選。反應(yīng)體系與初定位相同，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。通過SSR和SNP標(biāo)記對(duì)初定位區(qū)間進(jìn)行加密，縮小定位區(qū)間。

1.4 染色體步行

參考小豆基因組序列［4］，對(duì)定位區(qū)間進(jìn)行染色體步行。使用Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)克隆引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。使用2×Phanta?Max Master Mix（諾唯贊，南京）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR 產(chǎn)物，由深圳華大基因科技有限公司完成測(cè)序，使用啟動(dòng)區(qū)域元件分析網(wǎng)（http：//bioinforma-tics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）分析克隆結(jié)果中啟動(dòng)區(qū)域產(chǎn)生的突變位點(diǎn)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組分析

1.5.1 RNA 提取和質(zhì)量檢測(cè) 采用TRIzol 試劑盒（賽默飛，美國）提取小豆三出復(fù)葉和小豆五出復(fù)葉幼葉樣品的總RNA。通過Agilent 2100 Biognlyzer生物分析儀（安捷倫，美國）和NanoDrop 紫外分光光度計(jì)（賽默飛，美國）檢測(cè)提取RNA 樣品的質(zhì)量、純度及完整性，OD260/280在2.0～2.2 之間，RNA 分子完整數(shù)在6.6～8.5之間，可用于建庫和測(cè)序。

1.5.2 cDNA文庫構(gòu)建、測(cè)序 選取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)材料構(gòu)建RNA-seq 文庫。質(zhì)量檢測(cè)合格后，用Oligo（dT）磁珠富集樣品中mRNA。加入打斷試劑（fragmentation buffer）將mRNA 打斷成短片段，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。利用AMPure XP beads 磁珠純化雙鏈cDNA，末端修復(fù)加A尾并連接測(cè)序接頭。最后PCR擴(kuò)增構(gòu)建cDNA 文庫。用Agilent 2100 Biognlyzer 生物分析儀和ABI StepOnePlus RealTime PCR System（賽默飛，美國）對(duì)文庫的插入片段范圍進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)文庫濃度進(jìn)行定量，質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeq 測(cè)序儀（Illumina，美國）進(jìn)行測(cè)序。

1.5.3 原始數(shù)據(jù)組裝 對(duì)測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，去除包含測(cè)序接頭的reads；去除未知堿基N含量大于10%的reads；去除低質(zhì)量堿基（Q＜5）含量大于50%的reads。統(tǒng)計(jì)clean reads 的數(shù)量、總長(zhǎng)度、Q20、Q30、GC%等。將過濾后數(shù)據(jù)與Yang 等［4］的小豆參考基因組進(jìn)行比對(duì)。

1.5.4 差異表達(dá)基因的篩選和功能注釋 采用基于負(fù)二項(xiàng)分布模型的算法（DEGseq）進(jìn)行差異表達(dá)分析。對(duì)差異基因進(jìn)行篩選的閾值一般為L(zhǎng)og2（Fold Change）＞1 且P＜0.05。通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析，統(tǒng)計(jì)每個(gè)通路中包含的差異表達(dá)基因的個(gè)數(shù)，通過超幾何檢驗(yàn)找出顯著富集的通路。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）驗(yàn)證 采用TB Green?Premix Ex Taq? II試劑盒（TaKaRa，日本），采用CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）進(jìn)行qRT-PCR 分析，qRTPCR 總體積為20 μL：TB Green Premix Ex Taq II（2X）9 μL，10 μmol·L-1正反引物各1 μL，100 ng cDNA 2 μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，39 個(gè)循環(huán)；溶解曲線72 ℃ 30 s。以小豆β-Actin基因（Va03G001640）作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品分別設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，以2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算三出復(fù)葉野生型和五出復(fù)葉突變體之間的差異倍數(shù)Log2（Fold Change）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 農(nóng)藝性狀分析 使用SPSS 19.0 和Excel 2007軟件，對(duì)調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.2 定位區(qū)間連鎖圖 使用Mapmaker 3.0 軟件［22］構(gòu)建基因連鎖圖，設(shè)置LOD=3.0，最大圖距50.00 cM。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀分析

對(duì)EB601×GM635組合F2：3株系個(gè)體的株高、莖粗、主莖節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)、莢長(zhǎng)、莢寬、單莢粒數(shù)、單株產(chǎn)量、百粒重共9 個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示。與三出復(fù)葉個(gè)體相比，五出復(fù)葉個(gè)體株高變高，莖變粗，主莖節(jié)數(shù)增多，豆莢和籽粒變大，單株莢數(shù)和單莢粒數(shù)增多，單株產(chǎn)量和百粒重提高；其中株高、莖粗、莢寬、單莢粒數(shù)和百粒重呈顯著性差異（P＜0.05），單株產(chǎn)量呈極顯著性差異（P＜0.01）。

表1 EB601×GM635 F2∶3株系農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of interesting agronomic traits of EB601×GM635 F2∶3 segregating population

對(duì)EB601×GM635 組合F2：3株系間9 個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，在三出復(fù)葉和五出復(fù)葉表型之間，株高、莖粗、主莖節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)之間的相關(guān)性顯現(xiàn)出較好的一致性，均為極顯著相關(guān)；而株高與莢長(zhǎng)、單莢粒數(shù)、百粒重之間，單株莢數(shù)與莢長(zhǎng)之間，單株產(chǎn)量與莢寬、百粒重之間，均未表現(xiàn)出共同的一致性。單株產(chǎn)量與各農(nóng)藝性狀之間，只有五出復(fù)葉個(gè)體在莢寬上表現(xiàn)為極顯著相關(guān)（表2）。

表2 EB601×GM635 F2∶3各農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of agronomic traits in EB601×GM635 F2∶3 segregating population

綜上，五出復(fù)葉突變基因?qū)r(nóng)藝性狀有較大的影響，且會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性發(fā)生變化。

2.2 小豆五出復(fù)葉調(diào)控基因的遺傳分析

2016年種植的EB601×GM635 雜交組合F2群體單株收獲，調(diào)查F2中三出復(fù)葉和五出復(fù)葉表型情況。2017年共種植了12 個(gè)EB601×GM635 雜交組合F2三出復(fù)葉個(gè)體的F2：3株系和3個(gè)F2五出復(fù)葉個(gè)體的F2∶3株系。3 個(gè)F2五出復(fù)葉個(gè)體的F3株系中個(gè)體沒有復(fù)葉性狀分離，均為五出復(fù)葉；12個(gè)F2三出復(fù)葉個(gè)體的F3株系中有7個(gè)株系出現(xiàn)復(fù)葉性狀分離，對(duì)分離株系群體中個(gè)體復(fù)葉性狀分離比（三出復(fù)葉個(gè)體數(shù)：五出復(fù)葉個(gè)體數(shù)）進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，均符合3∶1的假設(shè)（表3）。

表3 EB601×GM635雜交組合F2∶3株系個(gè)體復(fù)葉性狀分離統(tǒng)計(jì)Table 3 Segregation of pentafoliate and trifoliolate among F2∶3 family of EB601×GM635 populatuon

F2五出復(fù)葉個(gè)體的F2∶3株系中個(gè)體沒有復(fù)葉性狀分離，F(xiàn)2三出復(fù)葉個(gè)體的F2∶3株系中個(gè)體出現(xiàn)復(fù)葉性狀分離現(xiàn)象，且三出復(fù)葉個(gè)體和五出復(fù)葉個(gè)體的分離比符合3∶1，表明小豆五出復(fù)葉個(gè)體由一對(duì)隱性基因控制，且符合孟德爾遺傳。

2.3 五出復(fù)葉調(diào)控候選基因定位

隨機(jī)選取GM635×EB601 F2：3株系三出復(fù)葉和五出復(fù)葉個(gè)體各10 株，將DNA 等量混合為三出復(fù)葉DNA混池和五出復(fù)葉DNA 混池。利用本課題組自主開發(fā)的1 572 對(duì)小豆基因組SSR 標(biāo)記，篩選親本和F2∶3差異個(gè)體DNA 混池間的差異標(biāo)記，僅有BAgs369、BAgs802、BAgs1061這3對(duì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶型滿足pcl基因標(biāo)記特征。使用這3 個(gè)SSR 標(biāo)記進(jìn)行群體驗(yàn)證，確定這3 個(gè)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增位點(diǎn)與pcl基因存在連鎖關(guān)系，標(biāo)記均位于小豆參考基因組第5 號(hào)染色體的末端。根據(jù)參考基因組序列在定位區(qū)間內(nèi)的SSR位點(diǎn)，開發(fā)了86 個(gè)SSR 標(biāo)記。pcl基因定位在標(biāo)記C5S207-5 和標(biāo)記BAgs1061 之間13.4 cM 的候選區(qū)域內(nèi)（表4、圖2），標(biāo)記C5S207-5 和BAgs1061 分別距pcl基因距離9.6和3.8 cM。

使用NGS 和Super-BSA 對(duì)GM635×EB601 F3∶4株系的三出復(fù)葉和五出復(fù)葉DNA 混池和親本混池進(jìn)行測(cè)序分析。獲得的原始數(shù)據(jù)產(chǎn)量（Raw reads）平均值為15 500 821，過濾后有效數(shù)據(jù)量（Clean base）平均值為4.64 Gb，Clean reads 平均值為15 454 177，有效堿基率（Effective rate）平均值為99.70%，樣品Q20 平均值為96.93%，GC 含量占比平均值為35.70%（表5）。上述結(jié)果表明，本研究測(cè)序質(zhì)量符合要求?；赟LAF-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，連鎖區(qū)域內(nèi)共有132 個(gè)SNP 位點(diǎn)，等距開發(fā)設(shè)計(jì)了23對(duì)SNP引物，并對(duì)親本和F3：4群體254個(gè)單株進(jìn)行驗(yàn)證，最終篩選出3 個(gè)SNP 標(biāo)記88601FWR、15106FRM 和89739FMR 與pcl基因連鎖（表4、圖2）。進(jìn)而將調(diào)控五小葉復(fù)葉的基因pcl定位到SNP 標(biāo)記89739FMR 和SNP 標(biāo)記15106FRM 之間，標(biāo)記88601FWR、15106FRM 和89739FMR 距pcl基因距離分別為1.0、1.2和0.4 cM（圖3）。

表5 Super-BSA 重測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 5 Basic date for samples by super-BSA

圖2 部分EB601×GM635家系分離群體個(gè)體開發(fā)引物擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 Electrophoretic map of developed primer amplification for EB601×GM635 segregating populations individuals

表4 開發(fā)的部分標(biāo)記和復(fù)葉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)分析引物Table 4 Some developed markers and quantitative primers of compound leaf development related genes

2.4 五出復(fù)葉定位區(qū)間染色體步行

依據(jù)京農(nóng)6號(hào)參考基因組，對(duì)基因定位區(qū)間1.6 cM內(nèi)的基因進(jìn)行分析。連鎖標(biāo)記的遺傳與物理位置排列順序一致，對(duì)應(yīng)小豆參考基因組5號(hào)染色體上約500 kb的區(qū)間，共有27個(gè)基因（表6）。通過染色體步行發(fā)現(xiàn)，定位區(qū)間內(nèi)距VaTMK3基因前960 bp 位置的啟動(dòng)區(qū)存在一個(gè)突變堿基（A 變C）位于TATA-box 元件上，該突變位點(diǎn)分析與性狀共分離（圖3）。VaTMK3編碼TMK類蛋白，參與細(xì)胞擴(kuò)張、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)。葉片細(xì)胞的增殖擴(kuò)張與TMKs密切相關(guān)，TMKs通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素來控制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

表6 500 kb定位區(qū)間基因注釋Table 6 Gene annotation in 500 kb localized interval

2.5 轉(zhuǎn)錄組分析

2.5.1 基因表達(dá)量分析 三出復(fù)葉和五出復(fù)葉幼葉樣本中檢測(cè)到基因數(shù)量在24 800～25 529個(gè)之間，對(duì)樣本中基因表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示每個(gè)樣本中有2 116（8.44%）～4 552（18.63%）個(gè)基因的FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）＞30，8 999（36.89%）～10 166（40.47%）個(gè)基因的FPKM 在5～30之間，占比最高。三出復(fù)葉和五出復(fù)葉在幼葉中有5 260個(gè)差異表達(dá)基因，相對(duì)于三出復(fù)葉幼葉，五出復(fù)葉幼葉中有3 411個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，有1 849個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖4）。

圖4 差異表達(dá)基因分析Fig.4 Analysis of differentially expressed genes

2.5.2 差異表達(dá)基因Pathway 富集分析 KEGG 富集結(jié)果顯示，在幼葉中差異表達(dá)基因被富集到133條通路中，其中顯著富集的有14 條（P＜0.05），主要包括植物MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway-plant，ko04016）、植物病原互作（plant-pathogen interaction，ko04626）（表7）。植物MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，與植物激素的生物合成、運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間存在緊密聯(lián)系。說明小豆五出復(fù)葉調(diào)控模式與植物激素合成運(yùn)輸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

表7 差異表達(dá)基因KEGG富集Table 7 KEGG enrichment of differentially expressed genes

2.5.3 五出復(fù)葉中相關(guān)生長(zhǎng)素調(diào)控基因差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與qRT-PCR 數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于三出復(fù)葉中的表達(dá)情況，生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因在五出復(fù)葉中顯著或極顯著差異表達(dá)，如VaTMK3在幼葉中表達(dá)極顯著上調(diào)；參與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)與介導(dǎo)生長(zhǎng)素梯度形成的VaPIN1a（auxin efflux carrier component 1-like）和VaPIN1b（auxin efflux carrier component 1-like）基因在五出復(fù)葉幼葉中均極顯著上調(diào)表達(dá)；同時(shí)在五出復(fù)葉幼葉中參與質(zhì)子驅(qū)動(dòng)的生長(zhǎng)素流入的載體蛋白編碼基因VaLAX1（auxin transporter-like protein 1）、VaLAX3（auxin transporter-like protein 3）和VaLAX5（auxin transporter-like protein 5）均上調(diào)表達(dá)，這類基因可介導(dǎo)從發(fā)育中的葉片（生長(zhǎng)素生物合成部位）到尖端的生長(zhǎng)素梯度的形成；編碼生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制蛋白（transport inhibitor response 1-like protein）的基因Va07G049160和Va03G081560也呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)（圖5）。說明生長(zhǎng)素濃度與梯度分布可能參與小豆五出復(fù)葉突變體發(fā)育調(diào)控。

圖5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與qRT-PCR分析基因相對(duì)表達(dá)Fig.5 The relative expression of key genes by transcriptome sequencing and qRT-PCR analysis

2.5.4 五出復(fù)葉中葉片極性調(diào)控相關(guān)基因差異表達(dá) 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與qRT-PCR 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在五出復(fù)葉幼葉中能夠調(diào)節(jié)葉片極性的YABBY 基因家族成員VaYAB5（axial regulator YABBY5）、VaYAB1（axial regulator YABBY1）和VaYAB4（axial regulator YABBY4）基因表達(dá)量顯著上調(diào)（圖5）。說明小豆YABBY基因家族基因過表達(dá)可能參與五出復(fù)葉突變體葉片極性調(diào)控。

3 討論

本研究通過小豆五出復(fù)葉性狀遺傳分析發(fā)現(xiàn)，三出復(fù)葉性狀為顯性性狀。五出復(fù)葉小豆較三出復(fù)葉小豆生長(zhǎng)速度快，植株高，生長(zhǎng)茂盛，說明pcl基因?qū)χ仓甑纳L(zhǎng)影響程度較大。在小豆五出復(fù)葉pcl的作用下，株高變高，莖變粗，而且主莖節(jié)數(shù)增多，說明小豆五出復(fù)葉突變體對(duì)小豆生長(zhǎng)發(fā)育具有積極作用。由上述結(jié)果可知，研究小豆五出復(fù)葉突變體對(duì)闡述小豆復(fù)葉發(fā)育機(jī)理和小豆葉型遺傳改良具有重要意義。

前人研究發(fā)現(xiàn)TMKs 基因家族通過調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)張和細(xì)胞增殖來協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)［23］。同時(shí)TMKs還參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控途徑TMK1-IAA32/34-ARFs 和TMK1/ABP1-ROP2/6-PINs。擬南芥中，TMKs的功能與在葉片起始和發(fā)育的早期增殖階段直接調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)［23］；TMKs 家族基因表達(dá)下降導(dǎo)致擬南芥對(duì)生長(zhǎng)素的敏感性下降，所以TMKs 家族似乎通過調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)張和增殖來參與植物葉片的生長(zhǎng)，并作為生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的一個(gè)組成部分影響植物中的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)［23］。本研究對(duì)小豆復(fù)葉發(fā)育調(diào)控基因進(jìn)行遺傳分析與圖位克隆，確定五出復(fù)葉發(fā)育調(diào)控候選基因?yàn)閂aTMK3。VaTMK3屬于TMKs 家族，編碼的TMK 蛋白與生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)［23］。故推測(cè)五出復(fù)葉突變體VaTMK3表達(dá)的上調(diào)可能會(huì)影響生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，五出復(fù)葉突變體幼葉中參與質(zhì)子驅(qū)動(dòng)的生長(zhǎng)素流入的載體蛋白基因VaLAX1、VaLAX3、VaLAX5表達(dá)均上調(diào)；同時(shí)編碼生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制蛋白的基因Va07G049160和Va03G081560基因也都上調(diào)表達(dá)，說明VaTMK3基因表達(dá)量的改變可能對(duì)調(diào)控生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)基因產(chǎn)生影響。

前人對(duì)番茄、碎米芥的復(fù)葉研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)葉原基的葉邊緣分裂區(qū)域中，存在高濃度生長(zhǎng)素，其對(duì)小葉生長(zhǎng)、葉原基發(fā)生均產(chǎn)生了影響，且單葉和復(fù)葉里生長(zhǎng)素濃度變化與PIN（PIN-FORMED）基因密切相關(guān)［24］。已報(bào)道發(fā)現(xiàn)百脈根中PIN1同源基因UML的突變體會(huì)導(dǎo)致小葉原基融合，頂葉出現(xiàn)“杯子”、“雨傘”形態(tài)［19］。TMKs能夠通過調(diào)控參與介導(dǎo)植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)幕騊IN（PIN-FORMED）來影響生長(zhǎng)素的分布［25］。本研究在五出復(fù)葉突變體小豆幼葉中發(fā)現(xiàn)VaPIN1a、VaPIN1b均上調(diào)表達(dá)，表明五出復(fù)葉中VaTMK3表達(dá)量的上調(diào)可能調(diào)控了VaPIN1a和VaPIN1b的表達(dá)，從而影響了小豆復(fù)葉形態(tài)。

當(dāng)前研究還發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素外排轉(zhuǎn)運(yùn)體PIN3 和生長(zhǎng)素內(nèi)流載體LAX3 的連續(xù)作用能夠間接激活MAPK 信號(hào)通路中MPK3/MPK6 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)CWR基因的表達(dá)，導(dǎo)致側(cè)根的產(chǎn)生［26］。而小豆五出復(fù)葉中MAPK 信號(hào)通路差異顯著，推測(cè)小豆額外小葉的產(chǎn)生可能與側(cè)根產(chǎn)生的模式相似，生長(zhǎng)素的積聚可能起到關(guān)鍵作用。

在五出復(fù)葉突變體幼葉中，YABBY 家族基因VaYAB1、VaYAB4和VaYAB5表達(dá)量明顯上調(diào)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)YAB1能夠參與器官發(fā)生過程中遠(yuǎn)軸細(xì)胞形態(tài)的建立并調(diào)節(jié)胚胎芽頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）發(fā)育的起始［27］，且轉(zhuǎn)錄因子YAB1在擬南芥中影響葉發(fā)育；YAB4對(duì)胚珠外珠被的形成和背面-正面不對(duì)稱生長(zhǎng)至關(guān)重要，同時(shí)促進(jìn)近軸細(xì)胞特性［28］；YAB5調(diào)節(jié)胚芽頂端分生組織的起始發(fā)育［29］。在葉器官發(fā)育起始時(shí)YAB1和YAB5在葉片遠(yuǎn)軸面表達(dá)，促進(jìn)葉極性的確立［30］。在大豆（Glycine max）中，YAB1類基因GmFILa在擬南芥中過表達(dá)引起葉片近軸端表現(xiàn)為部分遠(yuǎn)軸化，導(dǎo)致葉片卷曲，生育期延長(zhǎng)，同時(shí)影響自由態(tài)生長(zhǎng)素含量［31］。由于生長(zhǎng)素活性在葉片的近遠(yuǎn)軸間的差異對(duì)葉片形態(tài)發(fā)育產(chǎn)生影響［32］，推測(cè)VaYAB1、VaYAB4和VaYAB5基因表達(dá)可能參與生長(zhǎng)素濃度梯度分布的變化，進(jìn)而影響小豆復(fù)葉發(fā)育過程，但YABBY 家族基因是否直接參與小豆復(fù)葉發(fā)育還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，小豆復(fù)葉發(fā)育調(diào)控可能是由候選基因VaTMK3通過影響生長(zhǎng)素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因VaPIN1a、VaPIN1b、VaLAX1、VaLAX3、VaLAX5，調(diào)控小豆葉片中生長(zhǎng)素濃度梯度，導(dǎo)致分裂帶發(fā)生生長(zhǎng)素積累，從而調(diào)控異位小葉起始發(fā)育；同時(shí)，生長(zhǎng)素濃度改變會(huì)導(dǎo)致YABBY 基因家族中VaYAB1、VaYAB4 和VaYAB5表達(dá)上調(diào)，致使小豆葉片遠(yuǎn)軸極性發(fā)生變化，即在YaTMK3和YABBY家族基因共同作用下導(dǎo)致五出復(fù)葉產(chǎn)生。

4 結(jié)論

本研究通過輻射誘變獲得小豆五出復(fù)葉突變體pcl，相比于野生型小豆，其農(nóng)藝性狀均有所提高。遺傳分析結(jié)果表明，五出復(fù)葉突變體pcl受一對(duì)隱性基因控制，定位區(qū)間內(nèi)確定候選基因?yàn)閂aTMK3，該基因參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其在突變體pcl幼葉中顯著上調(diào)表達(dá)。突變體pcl幼葉中參與生長(zhǎng)素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白基因VaPIN1a、VaPIN1b、VaLAX1、VaLAX3、VaLAX5均上調(diào)表達(dá)。由此推測(cè)VaTMK3可能是通過影響生長(zhǎng)素濃度梯度導(dǎo)致小豆復(fù)葉的產(chǎn)生改變，以及YABBY家族可能參與了小豆復(fù)葉的發(fā)育過程。