基于PD-1/PD-L1通路探討補(bǔ)腎解毒散結(jié)方對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者免疫微環(huán)境的影響

張言言,韓 剛,曹 羽,張 云,張 旭,胡 建,龔航軍

0 引言

目前,晚期結(jié)腸癌主要采用手術(shù)、化療、放療等綜合治療模式,但療效并不理想,且復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,導(dǎo)致晚期結(jié)腸癌的治療更為棘手[1-2]。近年來,免疫療法取得巨大進(jìn)展,腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用,T淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子直接影響抗瘤免疫作用及免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效[3-4]。細(xì)胞程序性死亡受體1(Programmed death receptor-1,PD-1)/細(xì)胞程序性死亡受體-配體1(Programmed death receptor ligand-1,PD-L1)信號(hào)通路介導(dǎo)的免疫逃逸與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),以PD-1、PD-L1為分子靶點(diǎn)的免疫療法有望為晚期結(jié)直腸癌治療開辟新的道路[5]。補(bǔ)腎解毒散結(jié)方經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院驗(yàn)方,具有補(bǔ)腎解毒、消腫散結(jié)之功,在控制結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面療效顯著,但其免疫相關(guān)機(jī)制尚不完全明確[6]。本研究基于PD-1/PD-L1通路,探討補(bǔ)腎解毒散結(jié)方對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者免疫微環(huán)境的影響,從而為晚期結(jié)直腸癌的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年12月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院胃腸外科收治的50例晚期結(jié)直腸癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①參照《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2020版)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn),TNM臨床分期為Ⅳ期,且無法手術(shù)切除;②年齡≤80歲,預(yù)計(jì)生存期超過3個(gè)月;③近期未接受其他臨床研究。其中,男28例,女22例,年齡48～79歲,平均(57.4±6.9)歲;體重指數(shù)(Body mass index,BMI)：21.4～23.8 kg/m2,平均(22.5±2.3)kg/m2;病灶部位：升結(jié)腸18例,橫結(jié)腸8例,降結(jié)腸7例,乙狀結(jié)腸7例,直腸10例;分化程度：高分化9例,中分化18例,低分化23例;病理類型：腺癌29例,黏液腺癌9例,其他12例。按照隨機(jī)數(shù)字表法,將所有患者分為研究組和對(duì)照組,各25例。兩組年齡、性別構(gòu)成比、病灶部位、BMI、病理類型、分化程度等基本臨床特征比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究組年齡(56.9±7.6)歲;BMI(22.3±2.1)kg/m2;病灶部位：結(jié)腸19例,直腸6例;分化程度：高分化4例,中分化7例,低分化14例;病理類型：腺癌14例,黏液腺癌5例,其他6例。對(duì)照組年齡(58.1±6.5)歲;BMI(22.6±2.4)kg/m2;病灶部位：結(jié)腸21例,直腸4例;分化程度：高分化5例,中分化11例,低分化9例;病理類型：腺癌15例,黏液腺癌4例,其他6例。本研究符合《赫爾辛基宣言》,經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審議通過(批號(hào)：2019-1174-111-02),研究方案經(jīng)患者或監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照組 對(duì)照組給予化療+PD-1抑制劑,具體方法如下：采用mFOLFOX6方案化療：奧沙利鉑(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20093892)85 mg/m2靜脈滴注,大于2 h,第1天;亞葉酸鈣(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20013091)400 mg/m2靜脈滴注,大于2 h,第1天;5-氟尿嘧啶(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H12020959)400 mg/m2靜脈推注,第1天;5-氟尿嘧啶1 200 mg/(m2·d)持續(xù)靜脈泵入48 h,第2、3天。每2周為1個(gè)周期,連續(xù)12個(gè)化療周期。同時(shí),在mFOLFOX6方案的第4天給予派安普利單抗注射液(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S20210033)200 mg靜脈推注,每2周為1個(gè)周期,與化療同步進(jìn)行。

1.2.2 研究組 在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予補(bǔ)腎解毒散結(jié)方內(nèi)服,藥物組成：地黃15 g、女貞子15 g、人參9 g、肉蓯蓉12 g、山慈菇15 g、八月札9 g。中藥生藥均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院提供并代煎。一貼2袋,每袋200 ml,早晚各溫服1袋,連續(xù)服用2周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 近期臨床療效 治療前、治療4個(gè)周期后復(fù)查CT或磁共振,應(yīng)用RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1,將臨床療效分為完全緩解(Complete response,CR)、部分緩解(Partial response,PR)、穩(wěn)定(Stable disease,SD)、進(jìn)展(Progressive disease,PD)。疾病控制率(Disease control rate,DCR)=(CR+PR+SD)/總例數(shù)×100%,客觀緩解率(Objective response rate,ORR)=(CR+PR)/總例數(shù)×100%。將CR、PR和SD患者納入有效組,PD患者納入無效組。

1.3.2 外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè) 治療前、治療4個(gè)周期后,采用Beckman Coulter Cytoflex S流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平,采用HITACHI 7600型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)水平。

1.3.3 外周血PD-1、PD-L1水平檢測(cè) 治療前、治療4個(gè)周期后,抽取清晨的空腹外周靜脈血3 ml,置于EDTA抗凝管中,1 000轉(zhuǎn)/min高速離心20 min,收集上層清液放置在-80 ℃冰箱中保存。將標(biāo)本樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體加入預(yù)包裹抗體的微孔內(nèi),孵育并充分清洗。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清PD-1、PD-L1水平,試劑盒購(gòu)自迪信泰檢測(cè)科技(北京)有限公司(批號(hào)：EKHU3727、EKHU3732),酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自Bio-Rad公司,檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處各孔光密度值(OD450)。

2 結(jié)果

2.1 近期臨床療效比較 研究組的DCR為64.0%,明顯高于對(duì)照組36.0%(P<0.05);兩組ORR比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者近期臨床療效比較[例(%)]

2.2 治療前后T細(xì)胞亞群比較 治療前,研究組和對(duì)照組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,研究組CD3+、CD4+水平明顯升高(P<0.05),CD8+、CD4+/CD8+較治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),研究組上述T細(xì)胞亞群各指標(biāo)均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前后T細(xì)胞亞群比較

2.3 治療前后體液免疫指標(biāo)比較 治療前,研究組和對(duì)照組血清IgA、IgG、IgM水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,兩組各體液免疫指標(biāo)均明顯升高(P<0.05),研究組IgA、IgM水平均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前后體液免疫指標(biāo)比較

2.4 治療前后外周血PD-1、PD-L1比較 治療前,兩組外周血PD-1、PD-L1比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,研究組與對(duì)照組外周血PD-1、PD-L1水平均顯著下降(P<0.05),且研究組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

表4 治療前后患者外周血PD-1、PD-L1水平比較(pg/ml)

2.5 研究組不同療效組患者免疫功能指標(biāo)及PD-1、PD-L1水平比較 研究組患者中,有效組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及IgA、IgG、IgM水平明顯升高,PD-1、PD-L1水平明顯下降(P<0.05)。見表5。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤,常伴有癌基因、抑癌基因多發(fā)性突變[8-9]。研究發(fā)現(xiàn),PD-1/PD-L1信號(hào)通路介導(dǎo)的免疫抑制微環(huán)境是結(jié)直腸癌細(xì)胞的生存基礎(chǔ),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及免疫監(jiān)視逃逸中發(fā)揮重要作用[10-11]。

表5 研究組不同療效患者免疫功能指標(biāo)及PD-1、PD-L1水平比較

近年來,隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑的逐步應(yīng)用,晚期結(jié)直腸癌進(jìn)入免疫治療時(shí)代[12]。PD-1表達(dá)于結(jié)直腸癌變組織周圍CD8+T淋巴細(xì)胞表面,PD-L1異常高表達(dá)于癌變細(xì)胞表面,二者特異性結(jié)合后,可抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的正常功能,誘導(dǎo)活化的CD8+T細(xì)胞凋亡和耗竭,從而介導(dǎo)癌變細(xì)胞逃避T淋巴細(xì)胞的殺傷。PD-1/PD-L1抑制劑可阻斷PD-1與癌變細(xì)胞PD-L1結(jié)合,重新激活T淋巴細(xì)胞殺傷作用,增強(qiáng)免疫應(yīng)答,識(shí)別并殺傷癌變細(xì)胞[13-14]。研究證實(shí),PD-1和PD-L1抑制劑能夠顯著改善部分結(jié)直腸癌預(yù)后,且聯(lián)合化療可能進(jìn)一步提高治療效果,但此類研究仍以實(shí)驗(yàn)研究為主,臨床研究較少,且不良反應(yīng)發(fā)生率較高[15]。

結(jié)直腸癌歸屬于“積聚”、“癥瘕”、“腸癖”等范疇,其病位在腸,病本在腎,為本虛標(biāo)實(shí)之證,脾腎虛弱為本,痰瘀、濕熱為標(biāo),病機(jī)在于正氣不足,余毒伏居,濕熱蘊(yùn)結(jié),通降失司,積聚成形[16]?！毒霸廊珪しe聚》記載,凡脾腎不足、虛弱失調(diào)之人多有積聚之病。根據(jù)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院李琦教授前期研究,補(bǔ)腎解毒散結(jié)方具有補(bǔ)腎填精、清熱利濕解毒之功,有助于降低腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,改善預(yù)后[17]。本方以地黃滋陰補(bǔ)腎為君藥,女貞子、肉蓯蓉溫陽(yáng)填精為臣藥,人參補(bǔ)益元?dú)鉃樽羰?八月札、山慈菇清熱解毒、理氣散結(jié),全方標(biāo)本兼顧、攻補(bǔ)兼施,共奏補(bǔ)腎解毒散結(jié)之效。本研究結(jié)果顯示,雖然兩組ORR無顯著性差異,但研究組的DCR為64.0%,明顯高于對(duì)照組36.0%,表明補(bǔ)腎解毒散結(jié)方有助于進(jìn)一步改善晚期結(jié)直腸癌患者化療臨床療效。

化療藥物屬于攻邪藥物,導(dǎo)致脾胃受損、臟腑氣血陰陽(yáng)失調(diào),免疫功能抑制。近年來,PD-1抑制劑聯(lián)合中藥治療愈發(fā)引起重視,中醫(yī)藥作為結(jié)直腸癌綜合治療的重要組成,可有效緩解化療、免疫治療所致毒副作用,增強(qiáng)免疫力,改善預(yù)后。前期實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明,補(bǔ)腎解毒散結(jié)方可抑制結(jié)直腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移,但具體作用機(jī)制尚不明確[18-19]。由于晚期結(jié)直腸癌患者獲取組織標(biāo)本不易,本研究通過外周血檢測(cè)患者治療前后T淋巴細(xì)胞亞群及PD-1/PD-L1表達(dá)變化,結(jié)果顯示,研究組CD8+、CD4+/CD8+較治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CD3+、CD4+及IgA、IgG、IgM水平則明顯升高,且T細(xì)胞亞群各指標(biāo)及IgA、IgM均優(yōu)于對(duì)照組,與馮媛媛等[20]研究結(jié)果相符,同時(shí)外周血PD-1和PD-L1水平明顯降低,表明補(bǔ)腎解毒散結(jié)方有助于調(diào)節(jié)和提高結(jié)直腸癌患者化療、免疫治療期間免疫微環(huán)境,并抑制PD-1/PD-L1的表達(dá)。

對(duì)研究組進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),有效組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及IgA、IgG、IgM水平明顯升高,PD-1、PD-L1水平明顯降低,表明補(bǔ)腎解毒散結(jié)方聯(lián)合化療、免疫治療的療效與PD-1、PD-L1水平密切相關(guān)。研究表明,中藥可通過調(diào)節(jié)CD4+、CD8+T細(xì)胞及細(xì)胞表面的PD-1介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境[21]。補(bǔ)腎清毒湯藥能夠促進(jìn)成熟樹突狀細(xì)胞(DC)表面分子PD-L2表達(dá),下調(diào)表面分子PD-L1表達(dá)水平,從而改善DC功能并影響PD-1/PD-L1信號(hào)通路[22]。Zhou等[23]研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎中藥肉蓯蓉提取物可上調(diào)p53、Bax等抑癌基因表達(dá),通過抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖、加速腫瘤細(xì)胞凋亡,阻斷大腸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。

綜上所述,補(bǔ)腎解毒散結(jié)方可調(diào)節(jié)晚期結(jié)直腸癌患者的免疫微環(huán)境,改善臨床療效,其作用機(jī)制可能與其通過抑制PD-1/PD-L1信號(hào)通路,激活免疫細(xì)胞活性,增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)密切相關(guān),為晚期結(jié)直腸癌的臨床治療提供必要的依據(jù)。