1-MCP處理采后紅陽獼猴桃果實(shí)生理效應(yīng)的研究

林晉雨，肖 麗，楊春平，龔國(guó)淑，陳華保

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

‘紅陽’獼猴桃是由四川省自然資源科學(xué)研究院選育的中華獼猴桃優(yōu)質(zhì)紅肉型品種，肉質(zhì)鮮嫩，富含多種營(yíng)養(yǎng)因素，其中采后軟熟時(shí)VC 含量達(dá)135.8 mg/100 g，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.45%高出‘海沃德’近5%[1]。因其果實(shí)成熟期早，品質(zhì)優(yōu)異，現(xiàn)成為全國(guó)主栽品種之一[2]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，其呼吸速率會(huì)突然升高，并在生長(zhǎng)停止到開始進(jìn)入衰弱期之間出現(xiàn)一個(gè)呼吸高峰。由于果實(shí)采收時(shí)溫度較高，果實(shí)對(duì)乙烯更加敏感，促進(jìn)其后熟作用，從而存在采后難以保存的情況，且‘紅陽’獼猴桃果皮較薄，田間抗逆性與‘秦美’等品種相比更弱，成熟時(shí)間較短相較而言更難保藏。

通常果實(shí)的采后保鮮采用防腐殺菌、冷藏、亞精胺處理、氣調(diào)貯藏和1-甲基環(huán)丙烯處理等方式。防腐殺菌一般有物理和化學(xué)兩種方式，如藥劑處理及低溫處理等。其中藥劑處理通常采用涂膜保鮮劑京2B（用水1∶20 稀釋）加200 mg/kg 2，4-D 液，加250 mg/kg多菌靈液浸果2～3 min[3]。或使用0.2%赤藻糖酸鈉溶液浸果。果蔬保鮮使用化學(xué)和物理處理方法雖方便快捷，但其大多會(huì)造成處理后化學(xué)殘留等問題。亞精胺是一種游離態(tài)的多胺，它的合成和乙烯合成來自于同一底物S-腺苷甲硫氨酸，二者既相互聯(lián)系又相互制約。使用外源亞精胺處理果實(shí)可降低乙烯的生物合成，延緩果實(shí)的后熟衰老[4]，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道在亞精胺對(duì)梨、李和蘋果等采后貯藏效果的研究，并在生產(chǎn)實(shí)踐中得到應(yīng)用。但亞精胺的保存和使用需要使用人具備一定的專業(yè)技能，需要嚴(yán)格控制用量。氣調(diào)貯藏能顯著延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期，抑制細(xì)胞壁降解酶的活性，更好地維持紅陽獼猴桃的商品性[5]。在新西蘭等國(guó)家，獼猴桃的貯藏大多是采用現(xiàn)代化的貯藏庫(kù)，這種方法是最理想的貯藏方法，可以將貯藏指標(biāo)調(diào)整到最佳狀態(tài)。氣調(diào)庫(kù)貯藏需要做到適時(shí)采收，及時(shí)入庫(kù)貯藏，控制CO2在5%左右，O2在2%左右，溫度在（0±0.5） ℃，相對(duì)濕度在90%～95%，達(dá)到以上條件貯藏果實(shí)可長(zhǎng)達(dá)5～8個(gè)月[6]。

目前生產(chǎn)上最為常使用也最為便捷的仍是冷藏保鮮，低溫冷藏可降低果實(shí)的呼吸強(qiáng)度，同時(shí)降低淀粉等物質(zhì)向可溶性糖轉(zhuǎn)化的速率[7]。近年來各省及中央農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也展開了關(guān)于扎實(shí)推進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地冷藏保鮮設(shè)施建設(shè)的系列舉措[8]，旨在增強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地冷藏保鮮能力，減小產(chǎn)品損失最大程度保障農(nóng)民收益。特別是近年來的復(fù)合保鮮措施，Zhang H. Y.[9]等在對(duì)優(yōu)化鮮豬肉片冷藏保鮮中發(fā)現(xiàn)單寧酸殼聚糖涂層可延緩豬肉在冷藏過程中品質(zhì)劣變3～6 d。Babao?lu Ali Samet[10]等使用不同果實(shí)渣提取物配合冷藏處理牛肉餅，發(fā)現(xiàn)黑莓果渣水提取物可提高牛肉餅在冷藏過程中的氧化穩(wěn)定性，維持牛肉餡的品質(zhì)。

1-甲基環(huán)丙烯（1-methycyclopropylene，1-MCP）是近年來保鮮領(lǐng)域的熱點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藍(lán)莓[11]、香蕉[12]等多種果蔬采后貯藏保鮮。因其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無毒無刺激性氣味，且其易于合成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[13]使得1-MCP 擁有了廣闊產(chǎn)品應(yīng)用前景。1-MCP可抑制乙烯的生成，彭麗等[14]發(fā)現(xiàn)1-MCP延緩‘軟棗’獼猴桃變軟的同時(shí)可維持果實(shí)內(nèi)可滴定酸含量。陳景丹等[15]通過測(cè)定常溫下貯藏獼猴桃不同時(shí)段其淀粉酶基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)1-MCP處理后果實(shí)淀粉酶基因表達(dá)量降低，果實(shí)硬度下降速度緩慢。并且Zhang Y.等[16]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗壞血酸代謝途徑的基因轉(zhuǎn)錄水平也受到1-MCP 處理的調(diào)控。在1-MCP處理協(xié)同冷藏貯藏上，Q. Victoria 等[17]控制2個(gè)處理變量結(jié)果發(fā)現(xiàn)1-MCP 處理果實(shí)的食窗比未處理果實(shí)長(zhǎng)且冷藏下可延長(zhǎng)貯藏至180 d。Li F. J.等[18]使用1-MCP 和乙烯利對(duì)比處理蘋果在采收和冷藏器間的品質(zhì)變換，結(jié)果1-MCP抑制實(shí)乙烯合成和信號(hào)傳導(dǎo)，影響了果實(shí)表皮蠟質(zhì)的合成，從而改變了果實(shí)表皮蠟質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)，使蘋果果實(shí)在采收和冷藏期間保持品質(zhì)。Xia Y. X. 等[19]研究發(fā)現(xiàn)1-MCP 處理降低了多聚半乳糖醛酸酶活性，從而在獼猴桃長(zhǎng)期貯藏期間可以使果實(shí)保持較高的硬度。除此之外1-MCP 對(duì)果實(shí)品質(zhì)及風(fēng)味的維護(hù)也起到至關(guān)重要的作用，Wang H.等[20]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃采后0～6 d總可溶性固形物增加了77.4%。

以上研究表明，1-MCP處理會(huì)抑制采后果實(shí)內(nèi)與促進(jìn)成熟有關(guān)的基因表達(dá)從而減少催熟激素等的釋放延緩果實(shí)成熟。目前1-MCP 用于紅陽獼猴桃保鮮的研究仍較少，內(nèi)容不夠系統(tǒng)深入。本試驗(yàn)擬通過1-MCP 處理紅陽獼猴桃觀察其果實(shí)品質(zhì)變化情況，并對(duì)紅陽獼猴桃進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析差異基因，進(jìn)一步挖掘響應(yīng)1-MCP結(jié)合冷藏處理采后紅陽獼猴桃果實(shí)保鮮的分子機(jī)制，為‘紅陽’猴桃冷藏保鮮和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)使用獼猴桃品種為‘紅陽’獼猴桃，于2019 年8 月采摘自四川蒲江獼猴桃果園。采摘時(shí)選取大小一致，無疤痕、畸形果實(shí)，同時(shí)果實(shí)固形物含量大于6.2%（在田間用手持式阿貝折光儀測(cè)定）采摘，采摘后立即帶回四川農(nóng)業(yè)大學(xué)無公害農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行果實(shí)保鮮處理。1-MCP（粒劑，有效質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18%），四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、乳酸和冰醋酸，成都市科隆化學(xué)品有限公司；異丙醇、無水乙醇和丙三醇，四川西隴化工有限公司；甲醇，西隴科學(xué)有限公司；三氯乙酸，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；考馬斯亮藍(lán)R250，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；苯酚，成都市科龍化工試劑廠。試驗(yàn)用各試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1 折光儀、JYL-C16D 榨汁機(jī)、Allegra64R冷凍離心機(jī)、Millipore 超純水機(jī)和TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)無公害農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供。Zen blue2.0 ZEN 數(shù)字成像軟件，卡爾蔡司生物科技有限公司；UV-300分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇富華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)處理

稱取1-MCP 粒劑，用蒸餾水分別配制成1.17、11.7 和117 μL/L 的3 個(gè)濃度，蒸餾水作為對(duì)照組。將處理組‘紅陽’獼猴桃均勻平整的放入塑料盒中，裝有1-MCP 熏蒸劑的培養(yǎng)皿置于塑料盒中央，密封，在室溫（25±1）℃條件下熏蒸12 h 后通風(fēng)15～30 min，隨后將處理組和對(duì)照組均置于冷藏（1～4 ℃）條件下保存。每30 d 取樣，測(cè)定果實(shí)硬度、可溶性固形物（TSS）、維生素C（VC）、可滴定酸及花色苷含量，選取蒸餾水對(duì)照組及1-MCP 濃度為1.17 μL/L的處理組，每10 d 取樣，測(cè)定一次果實(shí)內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）酶比活力、丙二醛（MDA）及乙烯含量。測(cè)定時(shí)去皮組織破碎。每20個(gè)果實(shí)一個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，第1次數(shù)據(jù)在處理當(dāng)天測(cè)定。

1.3.2 果實(shí)硬度的測(cè)定

果實(shí)硬度測(cè)定用GY-1 型果實(shí)硬度計(jì)[21]進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)果實(shí)在其中間位置去皮后測(cè)定，各組分別選取9 個(gè)果實(shí)其中每個(gè)重復(fù)取3 個(gè)，每個(gè)果實(shí)重復(fù)測(cè)定3次取平均值，結(jié)果以kg/cm2表示。

1.3.3 果實(shí)主要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定

可溶性固形物含量測(cè)定：可溶性固形物（TSS）含量采用手持折光儀測(cè)定，果實(shí)去皮后組織破碎，用玻璃棒蘸取清澈透明汁液于折射儀鏡面上，直接讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)，各組分別選取9個(gè)果實(shí)其中每個(gè)重復(fù)取3 個(gè)，每個(gè)果實(shí)重復(fù)測(cè)定3 次取平均值，結(jié)果以%表示。

維生素C 含量測(cè)定：維生素C（VC）含量采用2，6-二氯酚靛酚法（2，6-D 法）[22]測(cè)定，各組分別選取9 個(gè)果實(shí)其中每個(gè)重復(fù)取3 個(gè)，每個(gè)果實(shí)重復(fù)測(cè)定3次取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算勻漿液中VC的含量，結(jié)果以mg/mL表示。

可滴定酸含量測(cè)定：可溶性酸含量使用酸堿滴定法[23]測(cè)定，各組分別選取9 個(gè)果實(shí)其中每個(gè)重復(fù)取3個(gè)，每個(gè)果實(shí)重復(fù)測(cè)定3次取平均值，根據(jù)以下公式計(jì)算溶液中可溶性酸的含量，并計(jì)算果實(shí)中可溶性酸的含量。

可溶性酸濃度= C（NaOH）×V（NaOH）/V（可溶性酸）;

其中果實(shí)中可溶性酸含量是溶液中可溶性酸含量的100倍。

花色苷含量測(cè)定：花色苷含量采用分光光度計(jì)法[24]測(cè)定，果實(shí)去皮后進(jìn)行組織破碎，取5 g 勻漿液轉(zhuǎn)入100 mL 三角瓶中，加入含有0.1%濃鹽酸的80%乙醇50 mL，4 ℃下避光浸提24 h，過濾濾液接入200 mL 容量瓶，并用含有0.1%濃鹽酸的80%乙醇清洗果肉殘?jiān)?，一并轉(zhuǎn)入容量瓶中并定容。吸取50 mL浸提液與等體積的pH 1.0的緩沖液（0.2 mol/L KCl 和0.2 mol/L HCl 以25∶67 的比例配制）混勻，平衡30 min 后，在536 nm 下測(cè)定吸光度，以50 mL 含有0.1%濃鹽酸的80%乙醇50 mL+50 mL pH 1.0 的緩沖液做空白測(cè)定。各組分別選取9個(gè)果實(shí)其中每個(gè)重復(fù)取3 個(gè)，每個(gè)果實(shí)重復(fù)測(cè)定3 次取平均值。采用以下公式計(jì)算溶液中花色苷的含量，并計(jì)算果實(shí)中花色苷的含量。

溶液中花色苷含量：C（mg/L）=（A×MW×DF×1 000）/（ε×1）

果實(shí)中花色苷含量=16×溶液中花色苷含量

其中：A為吸光值；MW 為分子量（以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)，449.4）；DF為稀釋倍數(shù)這里為200；ε為消光系數(shù)：26 900 L/(cm·mg)。

1.3.4 防御相關(guān)酶活性的測(cè)定

SOD 參照氮藍(lán)四唑（NBT）法[25]進(jìn)行測(cè)定，MDA活性采用植物丙二醛ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 乙烯含量的測(cè)定

乙烯含量采用ELISA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機(jī)洗板）；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

標(biāo)準(zhǔn)品（0～5）濃度依次為0、15、30、60、120 和240 nmol/mL。在Microsoft Excel 工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.3.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

以蒸餾水熏蒸為對(duì)照組處理、以濃度1.17 μL/L的1-MCP 熏蒸紅陽獼猴桃果實(shí)0.5 d 后放入冷庫(kù)（1～4 ℃，黑暗，濕度80%）貯藏10 d。各組均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)9 個(gè)果實(shí)。在每個(gè)處理相同位置切取1 g果肉組織，分別放入15 mL凍存管內(nèi)迅速置于液氮中速凍。交由北京諾禾生物科技有限公司進(jìn)行樣品RNA的提取、質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序以及數(shù)據(jù)分析等工作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Office Word、Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，IBM. SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-MCP處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)硬度的影響

果實(shí)硬度是果實(shí)成熟度的重要指標(biāo)（圖1）。貯藏90 d 內(nèi)，處理組和對(duì)照組果實(shí)在冷藏貯存過程中果肉硬度均逐漸降低，所有處理組果實(shí)硬度均不同程度地高于對(duì)照組果實(shí)硬度；貯藏30～60 d，1.17 μL/L處理組硬度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；貯藏第90 天時(shí)，11.7 μL/L 處理組硬度稍高于對(duì)照組及其他處理組，但無明顯差異。表明1-MCP處理能延緩紅陽獼猴桃果實(shí)硬度的降低，濃度1.17 μL/L的1-MCP 處理在果實(shí)快速軟化期能很好地延緩果實(shí)硬度降低的速度。

圖1 不同熏蒸濃度處理下‘紅陽’獼猴桃硬度變化Figure 1 Hardness of ＇Hongyang＇ kiwifruit changes under different fumigation concentrations

2.2 1-MCP處理冷藏對(duì)‘紅陽’獼猴桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響

2.2.1 1-MCP 處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)可溶性固形物的影響

TSS含量是衡量‘紅陽’獼猴桃品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，采后果實(shí)內(nèi)部淀粉轉(zhuǎn)化為糖導(dǎo)致果實(shí)內(nèi)部可溶性固形物含量上升，直接反映果實(shí)的口感。貯藏0～60 d，各處理間TSS 含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），然而處理組之間果實(shí)TSS含量并無明顯差異（圖2-A）。整體來看1.17 μL/L 處理組TSS 含量增加幅度較其他處理組的小。相對(duì)于對(duì)照組而言，1-MCP 處理對(duì)‘紅陽’獼猴桃果實(shí)TSS 含量上升有明顯抑制作用。

2.2.2 1-MCP 處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)維生素C含量的影響

在果實(shí)貯藏過程中，抗壞血酸極易分解，因此維持果實(shí)內(nèi)VC 的含量是果實(shí)保鮮的重要意義之一。整個(gè)貯藏期內(nèi)所有處理組及對(duì)照組果實(shí)VC含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。貯藏0～30 d間，1-MCP 濃度為1.17、11.7 μL/L 的處理組果實(shí)VC 含量上升趨勢(shì)較組大，第30天時(shí)1.17 μL/L處理組VC含量最高（圖2-B），117 μL/L 處理組VC 含量越低最低。在貯藏30～60 d 內(nèi)，對(duì)照組下降趨勢(shì)最大而117 μL/L 處理組果實(shí)VC 含量下降趨勢(shì)最小，第60天時(shí)，處理組VC 含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且1.17 μL/L 濃度處理的果實(shí)VC 含量最高。表明1-MCP 低濃度處理能延緩‘紅陽’獼猴桃貯藏后期VC含量的降低。

2.2.3 1-MCP 處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)可溶性酸含量的影響

可溶性酸是果實(shí)使用價(jià)值的品質(zhì)指標(biāo)之一，影響到果實(shí)的風(fēng)味及口感。貯藏期內(nèi)各處理組及對(duì)照組果實(shí)內(nèi)可溶性酸含量均呈下降趨勢(shì)（圖2-C），且各處理組可溶性酸含量均高于對(duì)照組。貯藏第30天，117 μL/L處理組果實(shí)可溶性酸含量高于其他處理；30～60 d 內(nèi)，11.7 μL/L 處理組下降趨勢(shì)最小，在第60 天時(shí)各處理組果實(shí)可溶性酸含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），11.7 μL/L處理果實(shí)可溶性酸含量最高，其次為117、1.17 μL/L。貯藏60～90 d 各處理組果實(shí)內(nèi)可溶性酸含量下降趨勢(shì)較對(duì)照組大，但在第90 天時(shí)各處理組含量依舊高于對(duì)照組。以上結(jié)果表明，1-MCP處理能夠延緩‘紅陽’獼猴桃果實(shí)冷藏貯藏期間可溶性酸含量的降低。

圖2 不同熏蒸濃度處理下‘紅陽’獼猴桃果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的變化Figure 2 Flavor quality of ＇Hongyang＇ kiwifruit changes under different fumigation concentrations

2.2.4 1-MCP 處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)花色苷含量的影響

花色苷是影響果蔬色澤的內(nèi)源抗氧化物質(zhì)之一。90 d貯藏時(shí)間內(nèi)，所有果實(shí)內(nèi)花色苷含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2-D）。貯藏0～60 d 各處理組果實(shí)內(nèi)花色苷含量呈現(xiàn)為117 μL/L處理組＞11.7 μL/L處理組＞1.17 μL/L處理組。第30天和第60天，各處理組果實(shí)花色苷含量與對(duì)照組相比具有顯著性（P＜0.05）。表明1-MCP處理‘紅陽’獼猴桃果實(shí)有助于減緩花色苷降解的速度。

2.3 1-MCP處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)防御相關(guān)酶活性的影響

2.3.1 1-MCP 處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)MDA活力的影響

MDA 可以使植物細(xì)胞纖維素分子間的橋鍵松弛，是逆境條件中過氧化作用發(fā)生后的產(chǎn)物，可以衡量植物逆境條件下脂質(zhì)過氧化作用的程度[26]。貯藏0～20 d內(nèi)（圖3-A），經(jīng)1-MCP處理后果實(shí)中的MDA含量上升較對(duì)照組緩慢；在貯藏第20天時(shí)處理組果實(shí)MDA 含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；貯藏第20～30天，處理組果實(shí)MDA的含量依舊緩慢上升而對(duì)照組則表現(xiàn)為下降，第30 天時(shí)處理組果實(shí)MDA 含量高于對(duì)照組但二者間差異不顯著。對(duì)照組MDA 含量先上升后下降，在貯藏20 d時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)果實(shí)中MDA 含量為1.735 nmol/L；1-MCP 處理組果實(shí)中MDA含量在貯藏30 d內(nèi)均呈現(xiàn)緩慢上升狀態(tài)，與對(duì)照組相比處理組抑制了果實(shí)內(nèi)MDA的積累，1-MCP配合冷藏貯存阻礙過氧化作用的發(fā)生進(jìn)行。

2.3.2 1-MCP 處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)SOD活力的影響

超氧化歧化酶（SOD）是植物體內(nèi)代謝過程中一類重要的自由基清除劑。在30 d的貯藏期內(nèi)（圖3-B），1-MCP處理組和對(duì)照組果實(shí)SOD酶比活力變化趨勢(shì)均為先上升后下降，自10 d 之后，下降趨勢(shì)來看處理組比對(duì)照組果實(shí)SOD酶比活力下降得慢，且在貯藏第20 天時(shí)處理組比對(duì)照組相對(duì)酶比活力高60.97，第20、30天時(shí)處理組SOD酶比活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖3 不同處理下‘紅陽’獼猴桃果實(shí)相關(guān)酶含量/活力變化（A：MDA；B：SOD）Figure 3 Enzyme content/viability of ＇Hongyang＇ kiwifruit changes under different treatments（A: MDA; B: SOD）

2.4 1-MCP處理對(duì)冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)乙烯含量的影響

測(cè)定1-MCP 濃度1.17 μL/L、熏蒸時(shí)間0.5 d 處理‘紅陽’獼猴桃后保鮮過程中內(nèi)源乙烯的變化趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)乙烯含量變化情況如圖所示（圖4），30 d貯藏時(shí)間內(nèi)對(duì)照組果實(shí)內(nèi)源乙烯含量整體呈現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，并且在第20 天出現(xiàn)了最大值，此時(shí)對(duì)照組整體果實(shí)乙烯含量比處理組高1.31 nmol/L 無顯著性差異。整體上處理組果實(shí)乙烯含量處于緩慢上升狀態(tài)于第30 天時(shí)處理組含量高于對(duì)照組但兩組間差異不明顯。表明1-MCP 處理紅陽獼猴桃可以推遲乙烯峰值，進(jìn)一步證實(shí)1-MCP可以減少內(nèi)源乙烯的釋放。

圖4 不同處理下‘紅陽’獼猴桃果實(shí)中乙烯含量變化Figure 4 Ethene content of ＇Hongyang＇ kiwifruit changes under different treatments

2.5 1-MCP處理后冷藏‘紅陽’獼猴桃果實(shí)轉(zhuǎn)錄組分析

2.5.1 差異基因鑒定及篩選

以log2FC≥1 或log2FC≤0.25，pval≤0.05 為將篩選條件，篩選出顯著差異基因。橫坐標(biāo)表示兩個(gè)處理間的差異倍數(shù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示兩個(gè)分組差異的pad的負(fù)log10值，紅色（表達(dá)量上調(diào)）和綠色（表達(dá)量下調(diào)）的點(diǎn)表示基因的表達(dá)量有差異，藍(lán)色的點(diǎn)為沒有差異，繪制差異基因火山圖（圖5）。通過對(duì)比分析1-MCP 處理后冷藏保存與對(duì)照的‘紅陽’獼猴桃的基因差異表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，處理組共篩選出顯著差異表達(dá)基因2 380個(gè)，其中有1 503個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，占比63.15%，877 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，占比36.85%，1-MCP處理協(xié)同冷藏保存下的‘紅陽’獼猴桃果實(shí)中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量高于下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量，說明1-MCP處理加冷藏顯著促進(jìn)了‘紅陽’獼猴桃果實(shí)部分生理活動(dòng)。

圖5 差異表達(dá)基因火山圖Figure 5 Volcano map

2.5.2 差異表達(dá)基因的GO分類

將‘紅陽’獼猴桃Unigene 與GO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并將功能分類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖6-A）。在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到生物學(xué)進(jìn)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）三大類。BP 中富集分析最相關(guān)的GO Term 依次是翻譯（translation）、肽生物合成處理（peptide biosynthetic procese）等。CC 部分GO Term依次富集到核糖體（ribosome）、核糖體蛋白復(fù)合體（ribonucleoprotein complex）和無隔膜的細(xì)胞器（non-membrane-bounded organelle）等。MF 部 分GO Term 依次富集到結(jié)構(gòu)分子活性（structural molecule activity）、核糖體的結(jié)構(gòu)成分（structural consltiuenl of ribosome）、肌動(dòng)蛋白結(jié)合（actin binding）、氫離子轉(zhuǎn)位的焦磷酸鹽類活性（hydrogon transloeating pyrophoephataee activity）、蛋 白 綁 定（proteincontaning complex binding）、運(yùn)輸?shù)鞍谆顒?dòng)（protein heterodimerization activity）和蘋果酸脫氫酶活動(dòng)（malic enzyme activity）等。

上調(diào)的1 503 個(gè)差異基因，在BP 中主要富集到酰胺生物合成過程、肽代謝過程、肽轉(zhuǎn)運(yùn)、主動(dòng)運(yùn)輸；在CC 中主要富集到核糖體蛋白復(fù)合物、核糖體、反式高爾基網(wǎng)絡(luò)運(yùn)輸、肌動(dòng)蛋白結(jié)合；在MF 中主要富集到結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、核糖核酸綁定的翻譯因素活動(dòng)、蛋白綁定、運(yùn)輸?shù)鞍谆顒?dòng)、蘋果酸脫氫酶活動(dòng)和運(yùn)輸?shù)鞍谆顒?dòng)（圖6-B）。

下調(diào)的877個(gè)差異基因，富集到BP的是酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)、防御反應(yīng)、胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯起始和衣殼蛋白涂層；富集到CC的是核糖體、有凹陷的網(wǎng)格蛋白、反式高爾基網(wǎng)絡(luò)運(yùn)輸囊泡膜；富集到MF的是結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、肌動(dòng)蛋白結(jié)合和蘋果酸脫氫酶活動(dòng)（圖6-B）。

圖6 GO功能富集分析圖Figure 6 Functional enrichment analysis of GO

2.5.3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

經(jīng)過1-MCP 處理后的‘紅陽’獼猴桃和對(duì)照組果實(shí)在冷藏10 d 后得到的差異表達(dá)基因，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中以padj＜0.05 作為顯著性富集的閾值進(jìn)行分類，將富集程度最顯著的前20 個(gè)Term 繪制成散點(diǎn)圖（圖7），縱坐標(biāo)為通路，橫坐標(biāo)為基因比率。各通路詳情見表3。

表3 差異表達(dá)基因富集顯著性高的 KEGG 通路（q≤0.05）Table 3 KEGG pathway with high concentration of differentially expressed genes（q≤0.05）

圖7 KEGG通路富集散點(diǎn)圖Figure 7 Enrichment scatter diagram of KEGG pathway

其中處理組在轉(zhuǎn)錄水平上的差異主要體現(xiàn)在蘋果酸脫氫酶、蘋果酶活性、含蛋白質(zhì)的復(fù)合物結(jié)合翻譯因子活性、RNA 結(jié)合酶抑制劑活性、氫轉(zhuǎn)移焦磷酸酶活性肌動(dòng)蛋白結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、包被凹坑的網(wǎng)格蛋白涂層、反式高爾基體網(wǎng)膜囊泡的網(wǎng)格蛋白、細(xì)胞內(nèi)無膜細(xì)胞器、核糖蛋白復(fù)合體、核糖體、翻譯起始、酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)、肽轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)防御反應(yīng)、酰胺生物合成過程、肽代謝過程和肽生物合成。此外，核糖體（ribosome）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、溶酶體（phagosome）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、泛素介導(dǎo)的蛋白水解（ubiquitin mediated proteolysis）、RNA運(yùn)輸（RNA transport）、MAPK信號(hào)通路-植物（MAPK signaling pathway- plant）以及內(nèi)吞作用（endocytosis）等通路也出現(xiàn)差異富集。

3 討論與結(jié)論

1-MCP 可很好地保持產(chǎn)品的硬度，本試驗(yàn)中，1-MCP處理濃度為1.17～117 μL/L區(qū)間，熏蒸0.5 d，可以有效保持果實(shí)中TSS、VC以及花色苷的含量從而可以更好地維持果實(shí)原有風(fēng)味。1-MCP 處理紅陽獼猴桃果實(shí)能減少M(fèi)DA 含量的產(chǎn)生，推遲SOD活性高峰期，延遲乙烯高峰到來的時(shí)間。

果實(shí)的成熟衰老是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，最早由D. Harman[27]提出的自由基學(xué)說認(rèn)為衰老過程是活性氧代謝失調(diào)與累積的過程?；钚匝蹙哂袉?dòng)衰老的作用，在果實(shí)采后貯藏過程中，活性氧的積累，會(huì)引起物質(zhì)代謝紊亂、細(xì)胞死亡等生理傷害，導(dǎo)致果實(shí)采后品質(zhì)下降[28]。本試驗(yàn)中MDA的一定數(shù)量的減少能降低活性氧對(duì)果實(shí)細(xì)胞膜的損傷，從而延緩果實(shí)衰老。

一般認(rèn)為1-MCP 能夠與組織中的乙烯競(jìng)爭(zhēng)乙烯受體蛋白，并優(yōu)先與乙烯受體蛋白發(fā)生不可逆的結(jié)合，進(jìn)而影響相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]，從而有效地減少組織對(duì)乙烯的敏感性。乙烯能調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育的許多方面，如參與開花、結(jié)果、種子萌發(fā)以及幼苗生長(zhǎng)等生命活動(dòng)，抑制乙烯的生物合成能有效地延長(zhǎng)植物的成熟衰老。Gong H. J.等[30]發(fā)現(xiàn)了果蔬中乙烯的生物合成途徑為甲硫氨酸→腺苷甲硫氨酸→非蛋白氨基酸→乙烯途徑。另外劉思敏等[31]研究表明柿果實(shí)采后貯藏過程中，乙烯的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)直接參與半胱氨酸和蛋氨酸代謝（ko00270）和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）這2個(gè)通路。本研究分別通過熏蒸蒸餾水、1-MCP氣化后冷庫(kù)貯藏的果肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共得到Clean data 數(shù)據(jù)量為38.55 Gb，各組間樣品Clean data 數(shù)據(jù)量均達(dá)到5.97 Gb 以上。組間樣品的表達(dá)量相關(guān)性高于0.94，具有較好的生物重復(fù)性，隨后將上調(diào)基因進(jìn)行通路分析，富集到數(shù)量最多的是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（ath04075），其次是半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路（ath00270）。同時(shí)，在苯丙氨酸代謝（ath00360）、谷胱甘肽代謝（ath00480）、丙氨酸和天冬氨酸（ath00250）等抗氧化相關(guān)的通路也富集到大量的上調(diào)基因。乙烯是由蛋氨酸在供氧充足的條件下轉(zhuǎn)化而成的，結(jié)果表明，經(jīng)過1-MCP 處理后的紅陽獼猴桃果實(shí)中蛋氨酸代謝通路的上調(diào)富集，減少了乙烯合成的前體，從而降低乙烯含量。從轉(zhuǎn)錄組角度說明1-MCP 處理可以降低乙烯的合成，延緩紅陽獼猴桃衰老。下調(diào)基因進(jìn)行通路分析，富集到數(shù)量最多的是丙酮酸代謝通路（ath00620），葉綠素代謝（ath00860），煙酸和煙酰胺代謝（ath00760），蛋白酶體（ath03050）等影響呼吸作用強(qiáng)度的通路。說明1-MCP 處理可以通過降低果實(shí)呼吸強(qiáng)度，達(dá)到果實(shí)保鮮效果。

KEGG分析顯示植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路差異基因顯著富集植物MAPK（mitogen-activated protein kinase）信號(hào)通路，又稱ERK（extracelular signalregulated kinase）一種廣泛存在的Ser/Thr 細(xì)胞外蛋白激酶，依賴于第二信使傳遞作用于下游的磷酸化級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。由此推測(cè)1-MCP 對(duì)果實(shí)的作用信號(hào)是通過MAPK-依賴途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的。

結(jié)果顯示，1-MCP主要通過體外影響乙烯合成通路、控制內(nèi)源乙烯的結(jié)合受體減少乙烯的合成，同時(shí)下調(diào)呼吸強(qiáng)度基因降低‘紅陽’獼猴桃呼吸強(qiáng)度，從而延緩果實(shí)衰老以及果實(shí)快速軟化達(dá)到預(yù)期保鮮效果。本實(shí)驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄組角度進(jìn)行分析，明確了1-MCP結(jié)合冷藏保鮮‘紅陽’獼猴桃的作用機(jī)制，為1-MCP 在‘紅陽’獼猴桃產(chǎn)品保鮮方面的使用推廣提供了理論基礎(chǔ)。