GC-MS分析艾納香葉超臨界提取物中的揮發(fā)性成分

王國盼,楊 達,陸安靜,秦 琳,張倩茹,王建梅,楊再文,何 莉,譚道鵬

(1.遵義醫(yī)科大學 貴州金釵石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)工程中心,貴州 遵義 563000;2.貴州匯騰科技有限公司,貴州 遵義 563000;3.貴州苗藥生物技術(shù)有限公司,貴州 銅仁 554400)

艾納香,又名大風艾、大毛藥、大艾等,為菊科艾納香屬植物艾納香[Blumeabalsamifera(L.)DC.]的葉及嫩枝[1],是一種傳統(tǒng)苗藥,其性味辛、微苦、微溫,具有祛風除濕、溫中止瀉、活血散瘀之功效,可用于風濕痹痛、跌撲傷痛,可治療胃潰瘍[2]、促進皮膚創(chuàng)傷及燒傷愈合等[3-4]。艾納香廣泛分布于貴州、廣東、海南、云南、廣西、福建等長江以南省區(qū),特別是在貴州省的羅甸縣具有規(guī)?；姆N植[5]?；瘜W成分研究表明,艾納香含有揮發(fā)油、黃酮類、倍半萜類、苯丙素類等多種類型的化學成分[6]。其中,艾納香揮發(fā)油有特殊的清香氣,具有抗菌、消炎、止痛、抗氧化、驅(qū)蟲等多種活性[7-8],用于治療風濕性關(guān)節(jié)炎、濕疹、產(chǎn)后痛風等[9],被認為是艾納香的主要有效成分,是咽立爽口含滴丸[10]、金喉健噴霧劑[11]等多種貴州特色民族藥復方制劑的活性組分之一。此外,因具有顯著的抗菌、抗氧化活性,艾納香揮發(fā)油還被日益廣泛的應用于日化品行業(yè)[12]。文獻報道艾納香揮發(fā)性成分主要包括L-龍腦、樟腦、2-茨醇、β-石竹烯、桉葉油醇、古蕓烯、芳樟醇、松油醇、丁子香酚、愈創(chuàng)木醇、庫貝醇、花椒油素等[13-15],其中L-龍腦為艾片的主要有效成分,具有顯著的消炎止痛、抗菌、抗氧化、抗病毒等多種生物活性[16],花椒油素具有抑制血小板凝聚的作用[17],L-龍腦、樟腦均具有較好的抗腦缺血再灌注損傷作用[18-19],β-石竹烯具有抑菌、抗炎、抗抑郁等作用[20]。此外,還發(fā)現(xiàn)艾納香揮發(fā)油中的其他成分如芳樟醇、葎草烯、α-古蕓烯、石竹烯氧化物、δ-杜松烯等都表現(xiàn)出較好的抑菌活性[21]。

揮發(fā)油的傳統(tǒng)提取方法主要采用水蒸氣蒸餾法,但該方法具有高耗能、有效成分得率較低等缺點。CO2超臨界提取是一種新型的提取技術(shù),具有有效防止熱敏性物質(zhì)破壞、提取效率高且能耗較少,操作簡單、自動化程度高、各項指標易于準確控制[22]等優(yōu)點,日益廣泛地應用于食用油或中藥揮發(fā)油的提取,如薄荷精油[23]、花椒精油[24]、艾葉揮發(fā)油[25]等。

近年來,關(guān)于艾納香揮發(fā)油的提取報道,有水蒸氣蒸餾法[26]、同時蒸餾萃取法[27]、頂空固相微萃取法[28]、微波輔助法[29]等。本研究采用CO2超臨界萃取技術(shù)提取艾納香葉中的揮發(fā)性成分,并采用GC-MS技術(shù)分析鑒定其化學成分,以期為艾納香的進一步合理開發(fā)及綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 多功能粉碎機(BO-100P2,永康市鉑歐五金制品有限公司),萬分之一天平(ME203E/02,上海梅特勒-托利多儀器有限公司),超臨界CO2萃取儀(RZSCF230-50-5+1L,南通睿智超臨界科技有限公司),GC-MS聯(lián)用儀(GCMS-TQ8040,日本島津公司)。

1.1.2 試劑 C7-C40系列正構(gòu)烷烴標準液(壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司)、正己烷[AR,薩恩化學技術(shù)(上海)有限公司]、丙酮[AR,重慶川東化工(集團)有限公司]、無水硫酸鈉(AR,國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.3 藥材 艾納香葉(產(chǎn)地:貴州省羅甸縣,批號:20181001)由貴州苗藥生物技術(shù)有限公司提供,經(jīng)遵義醫(yī)科大學譚道鵬副教授鑒定為菊科植物艾納香Blumeabalsamifera的干燥葉。

1.2 方法

1.2.1 艾納香葉CO2超臨界提取物的制備 取干燥的艾納香葉,粉碎,稱取455 g,裝入CO2超臨界萃取儀的萃取釜中,設(shè)置壓力30 MPa、溫度46～47 ℃,用超臨界CO2循環(huán)萃取80 min,然后從分離釜(I分壓力:7 MPa;Ⅰ分溫度:41～42 ℃;Ⅱ分壓力:6 MPa;Ⅱ分溫度:44～45 ℃)中分離出艾納香葉CO2超臨界提取物。

1.2.2 艾納香葉CO2超臨界提取物的GC-MS分析 取艾納香葉CO2超臨界提取物適量,加入10 mL正己烷充分溶解,用無水硫酸鈉除水,稀釋至適宜濃度后用0.22 μm微孔濾膜過濾并進行GC-MS分析。氣相色譜條件:色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱;程序升溫條件:柱溫70 ℃(保持2 min),以5 ℃/min升溫至150 ℃(保持2 min),以10 ℃/min升溫至260 ℃保持10 min至完成分析。進樣口溫度250 ℃,載氣為高純氦氣,載氣流量1.0 mL/min,進樣量0.5 μL,分流比10∶1;質(zhì)譜條件:離子源為EI源,離子源溫度200 ℃,接口溫度250 ℃,電子能量70 eV,溶劑延遲1.5 min,質(zhì)量范圍為45～500 amu。采用NIST標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合保留指數(shù)進行定性分析,僅報道匹配度大于80%(最大值100%)的鑒定結(jié)果,采用峰面積歸一化法定量。

1.2.3 保留指數(shù)的測定 精密吸取C7-C40系列正構(gòu)烷烴標準液100 μL,加正己烷定容至1 mL,搖勻,0.22 μm微孔濾膜過濾后即得0.1 mg/mL C7-C40正構(gòu)烷烴混標溶液。按照1.2.2中的色譜條件分析正構(gòu)烷烴混標,記錄保留時間。各組分的保留指數(shù)根據(jù)其保留時間與C7-C40正構(gòu)烷烴混標的保留時間通過GC-MS-TQ8040聯(lián)用儀的數(shù)據(jù)分析軟件(GC-MS再解析)自動計算求得。

2 結(jié)果

2.1 GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分 采用CO2超臨界萃取技術(shù)提取得到的艾納香葉提取物為黃綠色油狀物,得率為9.01%。采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分進行分析鑒定,共分離出119個組分。各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機檢索NIST標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并結(jié)合保留指數(shù)定性分析,采用峰面積歸一化法測定各組分的相對含量,共鑒定78種化合物,占艾納香葉揮發(fā)性成分總量的87.02%(表1)。圖1為艾納香葉和C7-C40系列正構(gòu)烷烴標準液的GC-MS總離子流色譜。

表1 艾納香葉CO2超臨界提取物中化學成分組成

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

A:艾納香葉CO2超臨界提取物;B:C7-C40系列正構(gòu)烷烴標準液。圖1 GC-MS總離子流色譜

2.2 艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分 如圖2所示,艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分主要包括:5種萜類衍生物(31.90%)、44種脂肪族化合物(18.58%)、10種芳香族化合物(18.50%)、12種含氮化合物(14.54%)及其他類成分。脂肪族化合物包括:13種酯類化合物,相對含量最高為5.51%;其他依次為17種飽和烷烴類(5.22%)、6種酮酸類(4.21%)、5種醇類(2.56%)、2種烯烴類(0.25%)、1種醚類(0.83%)。各組分中相對含量最高的為單萜酯類化合物1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯(31.18%),其次為含氮化合物1-(4-十氫二苯并吡喃)-4-苯基-5-硫酮四唑(7.26%)、芳香族化合物鄰苯二甲酸單丁酯(6.53%)、芳香族化合物1-對硝基乙酰苯-3,4-二甲氧基苯(3.61%)、酮酸類化合物2,6,6,9,9,13-六甲基-7,8-二氮-2,7,12-三烯-4,11-二酮-7,8-二氧化物(3.32%),這些成分占艾納香葉揮發(fā)性成分總量的51.9%。

圖2 艾納香葉中揮發(fā)性成分的分類及相對含量

3 討論

植物中的揮發(fā)性成分比較復雜,常常由幾十種到數(shù)百種成分組成,大多為相對分子質(zhì)量小、極性小的化合物,主要包括萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物等。本研究艾納香葉CO2超臨界提取物中的揮發(fā)性成分主要為萜類衍生物,占31.90%。萜類化合物是一類廣泛存在于植物界的化學成分,具有多種生物活性,并且是一些中藥的主要有效成分[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)了5種艾納香中未曾報道過的萜類衍生物,其中包括含量最高的1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯,占31.18%,有文獻報道與其結(jié)構(gòu)相近的倍半萜內(nèi)酯具有抗流感病毒活性[33]。此外,還發(fā)現(xiàn)了種類豐富的飽和烷烴類化合物,包括正十九烷烴、正二十一烷烴、正二十八烷烴等活性成分,具有抗菌[34]、抗抑郁活性[35]。這些結(jié)果表明CO2超臨界萃取得到的艾納香葉提取物具有較高的開發(fā)前景。

本研究所得到的艾納香葉CO2超臨界提取物與文獻報道的艾納香揮發(fā)油成分有所不同:如王遠輝等[27]采用GC-MS分析水蒸汽蒸餾法、同時蒸餾萃取法和頂空固相微萃取法3種方法提取的艾納香提取物中含量較高的化學成分包括龍腦、樟腦、桉葉醇、花椒素、(+)-γ-古蕓烯、(E)-羅勒烯、(E)-石竹烯等單萜及倍半萜類化合物,而本研究提取的艾納香葉CO2超臨界提取物并未發(fā)現(xiàn)這些成分,并且王遠輝等提取的3個樣品中相對含量前5位的化學成分在種類與數(shù)量上也都存在差異。這說明提取工藝會造成艾納香提取物中化學成分的較大差異。與趙超等[15]的研究也有所不同,當超臨界CO2萃取條件為萃取壓力30 MPa,萃取溫度50 ℃,萃取時間50 min時含量較高的化學成分有(+)-2-樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素、7-(2-羥基異丙基)-1,4α-二甲基十氫萘-1-醇、葉綠醇、二十四烷、三十三烷等,與本研究含量較高的1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯、1-(4-十氫二苯并吡喃)-4-苯基-5-硫酮四唑、鄰苯二甲酸單丁酯、1-對硝基乙酰苯-3,4-二甲氧基苯、2,6,6,9,9,13-六甲基-7,8-二氮-2,7,12-三烯-4,11-二酮-7,8-二氧化物等化學成分不同,說明萃取壓力、萃取溫度、萃取時間不僅對艾納香揮發(fā)油的萃取率產(chǎn)生影響,提取物的化學成分也有差異。不同產(chǎn)地具有不同的自然環(huán)境和氣候條件,可能影響中藥化學成分的組成。因此,以上不同艾納香提取物中化學成分的差異可能是由于樣品的采摘地點、采摘季節(jié)及樣品的提取工藝等因素所導致的。

此外,文獻報道1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯結(jié)構(gòu)類似物具有抗流感病毒活性,而1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-環(huán)戊烯在艾納香葉CO2超臨界提取物中的相對含量高達31%,這也為艾納香藥材資源的開發(fā)利用提供了新的思路。