葉面噴施脫落酸對黃瓜果實(shí)品質(zhì)的影響

梁 穎, 張澤錦, 王力明, 唐 麗, 高 佳

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610066; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610066; 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所, 成都 610066)

【研究意義】黃瓜(CucumissativusL.)是中國設(shè)施蔬菜的主要栽培作物,在全國各地廣泛種植。黃瓜幼苗在定植后容易受到干旱[1-2]、高溫[2-3]等脅迫,其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響,因此在黃瓜生長過程中常通過外源添加植物生長調(diào)節(jié)劑,如脫落酸(ABA),來改善植物的抗逆性[3-4]。ABA是調(diào)控植物生長發(fā)育過程的重要內(nèi)源性激素,也是調(diào)控植物響應(yīng)外源脅迫的關(guān)鍵因子,ABA能夠通過提高抗氧化酶類活性緩解脅迫效應(yīng),促進(jìn)植物對外源環(huán)境的抗逆性,同時(shí)也能夠通過內(nèi)源合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及和其他激素互作等多種途徑調(diào)控次生代謝物質(zhì)的合成[5-6]。此外,成熟果實(shí)中也會產(chǎn)生大量ABA,對果實(shí)發(fā)育成熟有重要的作用[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來,國內(nèi)外關(guān)于外源ABA對果實(shí)品質(zhì)影響的研究日益深入。研究發(fā)現(xiàn),外源ABA對果實(shí)發(fā)育成熟過程中多個(gè)方面起調(diào)控作用。在葡萄、蘋果、蜜柚以及番茄等相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),外源施用ABA可以顯著提高果實(shí)重量、可溶性糖含量及果實(shí)硬度等,增加色素物質(zhì)如花色苷的累積,但是會減少類胡蘿卜素的合成[8-13]。對西瓜中的研究發(fā)現(xiàn),外源施用ABA提高果實(shí)可溶性固形物含量,果實(shí)硬度卻顯著降低[7]。在歐李中的研究發(fā)現(xiàn),采前噴施ABA對歐李果實(shí)品質(zhì)的調(diào)控作用不僅受到ABA濃度和噴施次數(shù)的影響,不同品種間也存在顯著差異[14]。在葡萄中利用轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)ABA通過調(diào)控花青苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因來促進(jìn)葡萄花青苷的積累,同時(shí)篩選出可能參與調(diào)控這個(gè)過程的15個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[15]。在藍(lán)莓中通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選獲得參與藍(lán)莓成熟著色的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄組因子VcMYBA[16]。在番茄中發(fā)現(xiàn)外源ABA可能通過誘導(dǎo)芳香物質(zhì)次生代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)促進(jìn)番茄果實(shí)中芳香物質(zhì)的合成[17]。Chen等[18]通過轉(zhuǎn)錄組分析揭示了外源生長素和外源ABA通過RLKs激酶以及相關(guān)的激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控草莓成熟的機(jī)理。以上結(jié)果表明,通過轉(zhuǎn)錄組測序分析不同外源ABA處理?xiàng)l件下果實(shí)基因表達(dá)差異及調(diào)控模式差異,可以篩選關(guān)鍵調(diào)控基因,挖掘ABA調(diào)控果實(shí)發(fā)育的深層機(jī)理[19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 黃瓜的特征風(fēng)味物質(zhì)主要為2E,6Z-壬二烯醛和2,6-壬二烯醇,2E,6Z-壬二烯醛是主要的特征風(fēng)味物質(zhì)[19],是影響黃瓜品質(zhì)的重要指標(biāo)。目前關(guān)于黃瓜施用外源脫落酸的報(bào)道大多集中在ABA對黃瓜抗逆性的影響[20-21],很少有研究關(guān)注葉片噴施ABA對黃瓜果實(shí)品質(zhì)的變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以華北型黃瓜‘川翠13號’為研究對象,通過葉面噴施ABA,測定黃瓜果實(shí)品質(zhì),并通過轉(zhuǎn)錄組測序揭示調(diào)控黃瓜果實(shí)相關(guān)基因表達(dá)的變化,為外源噴施ABA影響黃瓜果實(shí)品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為‘川翠13號’黃瓜品種,購自成都好特園藝有限公司。ABA為分析純,購自飛凈生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)于2021年3—5月在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園(四川省,成都市)大棚內(nèi)進(jìn)行。2021年3月,挑選籽粒飽滿的黃瓜種子進(jìn)行催芽,待露白后播種于32孔穴盤中,自然光條件下育苗3周后,選擇整齊一致的黃瓜幼苗移栽至塑料大棚中進(jìn)行水培,營養(yǎng)液采用山崎營養(yǎng)液配方[22]。當(dāng)黃瓜果實(shí)長度約為10 cm時(shí)(開花后1～2 d),以第3節(jié)黃瓜果實(shí)為試驗(yàn)對象,用塑封袋套住果實(shí)進(jìn)行遮擋,對黃瓜第3節(jié)瓜處以及上下各1片葉(共3片葉)進(jìn)行ABA處理。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理,分別噴施0(CK)、50(T1)、100(T2)、200(T3)和400 μmol/L(T4)的ABA溶液,以滴水為度,正反兩面噴施。每個(gè)處理4株黃瓜植物,重復(fù)3次。處理后1周采取果實(shí)并保存于液氮中用于轉(zhuǎn)錄組測序和后續(xù)品質(zhì)測定。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1 品質(zhì)指標(biāo)測定 黃瓜品質(zhì)指標(biāo)參照李合生[23]的方法進(jìn)行測定,其中可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定,抗壞血酸含量采用二氯酚靛酚滴定法測定。

黃瓜風(fēng)味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛含量參考劉春香等[24]的方法稍作改進(jìn)進(jìn)行測定。稱取5 g凍樣黃瓜粉末到頂空瓶中,采用頂空微固相萃取與氣質(zhì)聯(lián)用儀,利用選擇離子掃描技術(shù)測定黃瓜中特征風(fēng)味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛的含量。以反,順-2,6-壬二烯醛為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中反,順-2,6-壬二烯醛的含量。75 μm聚二甲基硅氧烷(Polydim ethylsiloxane,PDMS)萃取頭。色譜條件:色譜柱HP-5MS(30 m0 mls mmmmlsi,μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃,接口溫度250 ℃;分流比12∶1;載氣為高純氦氣,恒流流速1.0 mL/min;升溫程序:起始溫度36 ℃,然后以12 ℃/min的速率升至60 ℃,再以6℃/min升至140 ℃,最后以20 ℃/min升至240 ℃,保持10 min。質(zhì)譜條件:離子源溫度200 ℃,電離方式EI,電子能量70 eV。

1.3.2 黃瓜果實(shí)總RNA提取、文庫構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測序以及差異表達(dá)基因篩選 黃瓜果實(shí)的總RNA提取方法參照RNAplant Plus Reagent DP437(天根,北京,中國)方法進(jìn)行,采用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)檢測RNA濃度及純度,采用試劑盒VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina(Vazyme,北京,中國)構(gòu)建cDNA文庫。由派諾森公司(http://www.personalbio.cn/)完成測序,測序平臺為illumina Novaseq 6000。樣品上機(jī)測序獲得的原始數(shù)據(jù)(RAW reads)進(jìn)一步過濾,去除一些帶接頭、低質(zhì)量的reads從而獲得Clean reads。利用HISAT v2.0.4將Clean reads與對黃瓜的參考基因組進(jìn)行序列對比[25]]。利用BLAST進(jìn)行基因功能注釋[16-17,26-27]。利用DESeq軟件獲得差異表達(dá)基因(FDR<0.05, |log2FC| >2)。GO(Gene ontology)功能富集分析采用topGO進(jìn)行[28],KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析使用OmicShare tools (www.omicshare.com/tools)完成。

1.3.3 qRT-PCR方法驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果 隨機(jī)選取10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析,用于驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果。使用微孔板紫外分光光度計(jì)(TECAN,infinite M200 Pro,Switzerland)檢測RNA濃度和質(zhì)量,然后對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄使用cDNA合成試劑盒(Tiangen)。以CsEF1A為看家基因(Csa_2G139820),使用熒光定量PCR儀(Bio-Rad,CA,USA)檢測基因相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)包括95 ℃ 3 min以及40個(gè)循環(huán)95 ℃ 15 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s。特異性引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和方差分析,使用Sigmaplot 14以及Adobe Illustrator 6.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片噴施不同濃度ABA處理對黃瓜果實(shí)品質(zhì)的影響

從表2可知,葉面噴施ABA可顯著提升黃瓜果實(shí)可溶性糖含量。與CK相比,葉面噴施不同濃度ABA,黃瓜果實(shí)可溶性糖含量分別增加47.35%、16.50%、4.16%和5.79%。黃瓜果實(shí)抗壞血酸含量則隨著ABA濃度增加呈先增加后降低趨勢,T1、T2、T3處理的抗壞血酸含量較CK分別增加60.49%、63.49%和65.08%,而T4處理的抗壞血酸含量較CK下降62.08%。但是噴施不同濃度的ABA均可降低黃瓜風(fēng)味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛含量,與CK相比,T1、T2、T3和T4處理分別下降44.24%、30.09%、26.67%、42.58%。說明,葉面噴施ABA可以促進(jìn)黃瓜可溶性糖和抗壞血酸含量的積累,但是降低黃瓜風(fēng)味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛的積累。T4處理中黃瓜的風(fēng)味物質(zhì)和抗壞血酸含量都顯著降低,為了進(jìn)一步解析外源ABA對黃瓜果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)的影響,選擇T4處理作為研究對象進(jìn)行下一步分析。

表2 葉片噴施ABA對黃瓜品質(zhì)的影響Table 2 Effect of foliar ABA application on qualities of cucumber

2.2 黃瓜果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組分析概況

從表3可知,經(jīng)過測序,黃瓜果實(shí)獲得共計(jì)261 364 680條原始數(shù)據(jù),經(jīng)過質(zhì)量剪切過濾后獲得237 831 174條序列,占總reads數(shù)的91%。GC含量為42.23%～43.78%,Q20值和Q30值分別為97.44%～97.62%和92.94%～93.58%,說明測序質(zhì)量較好,可以用于后續(xù)分析。將過濾后數(shù)據(jù)與黃瓜的基因組進(jìn)行比對,序列的匹配度為95.73%～96.25%,因此,測序結(jié)果可靠程度較高。

表3 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量Table 3 Qualities of the RNA-seq

2.3 黃瓜果實(shí)基因差異性表達(dá)分析

將CK和T4處理進(jìn)行基因差異表達(dá)分析,從圖1A～B可知,葉片噴施ABA后,黃瓜果實(shí)共檢測到169個(gè)基因差異表達(dá),其中有75個(gè)基因下調(diào)表達(dá),占基因差異表達(dá)的44.38%,基因上調(diào)表達(dá)有94個(gè),占基因差異表達(dá)的55.62%。從圖1-C可知,差異表達(dá)基因在3個(gè)重復(fù)之間的表達(dá)趨勢基本一致,說明葉面噴施ABA影響了黃瓜果實(shí)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

A為差異表達(dá)基因的數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖;B為差異表達(dá)基因的火山圖;C為差異表達(dá)基因相對表達(dá)量的熱圖。A showed the numbers of the DEGs numbers; B showed the volcano map of the DEGs; C is the normalized expression level of the DEGs.圖1 葉片噴施ABA黃瓜果實(shí)中的差異表達(dá)基因Fig.1 Differentially expressed genes of cucumber fruits in response to foliar ABA application

2.4 黃瓜果實(shí)差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路分析

GO功能富集分析表明,CK和T4處理的黃瓜果實(shí)差異表達(dá)基因主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程(圖2-A)。此外,GO功能富集還包括一些生物合成過程,如調(diào)控大分子生物合成、芳香物質(zhì)合成以及雜環(huán)合成等。

為了進(jìn)一步分析預(yù)測差異基因的生物功能,對CK和T4處理的黃瓜果實(shí)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析(圖2-B),發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因富集的主要通路包括植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙氨酸代謝、類胡蘿卜素代謝以及花生四烯酸代謝,說明葉面噴施ABA可能影響黃瓜果實(shí)的苯丙氨酸代謝、類胡蘿卜代謝和花生四烯酸代謝,并可能通過改變激素信號途徑調(diào)控黃瓜果實(shí)品質(zhì)。

圖2 黃瓜果實(shí)差異表達(dá)基因GO功能分析和KEGG通路富集分析Fig.2 Gene ontology (GO) enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment of the DEGs of cucumber fruits

2.5 黃瓜果實(shí)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子分析

GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn),黃瓜葉片噴施ABA后黃瓜果實(shí)的差異表達(dá)基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控,因此對差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析(圖3)。黃瓜果實(shí)差異表達(dá)的基因中有44個(gè)基因(26%)功能注釋為轉(zhuǎn)錄因子,主要包括bHLH轉(zhuǎn)錄因子、bZIP轉(zhuǎn)錄因子、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子C2H2和C3H、MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及NAC轉(zhuǎn)錄因子。噴施ABA后黃瓜果實(shí)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子、bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)均上調(diào),鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子C2H2和C3H中有3個(gè)基因表達(dá)上調(diào),3個(gè)基因表達(dá)下調(diào);MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子有3個(gè)基因表達(dá)上調(diào),2個(gè)基因表達(dá)下調(diào);而NAC轉(zhuǎn)錄因子有2個(gè)基因表達(dá)上調(diào),4個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。這些轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)說明葉片噴施ABA影響黃瓜果實(shí)中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

圖3 外源ABA處理黃瓜果實(shí)中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子匯總分析Fig.3 Expression profile of transcription factor in response to foliar ABA application

2.6 黃瓜果實(shí)差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

隨機(jī)選擇黃瓜果實(shí)10個(gè)差異顯著基因進(jìn)行qRT-PCR分析,并與這些基因的RNA-seq結(jié)果進(jìn)行比較(表4),選取的基因在2種分析方法下,表達(dá)趨勢一致,說明RNA-seq結(jié)果的可信度較高。

表4 差異表達(dá)基因qRT-PCR結(jié)果Table 4 qRT-PCR results of the differential expression genes

3 討 論

果實(shí)品質(zhì)是衡量園藝作物商品性最重要的指標(biāo)之一,其主要包括可溶性糖、維生素C以及風(fēng)味物質(zhì)等。ABA是一種重要的植物激素,在果實(shí)成熟過程中起重要作用。目前,關(guān)于外源ABA對植物果實(shí)品質(zhì)的影響研究較多,例如,曲文穎等[29]研究發(fā)現(xiàn),噴施ABA可以提高藍(lán)莓果實(shí)中的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、花色素苷含量,然而對藍(lán)莓維生素C含量影響不顯著。王星辰等[9]對著色期蘋果噴施ABA后,發(fā)現(xiàn)果實(shí)中可溶性糖含量顯著提高。Balate等[13]研究發(fā)現(xiàn),噴施和根灌ABA均能提高番茄果實(shí)可溶性固形物含量和固酸比。然而,噴施ABA后,歐李果實(shí)的可溶性固形物含量、可滴定酸含量、類黃酮含量、總酚含量以及抗氧化能力都顯著降低[14],說明ABA對果實(shí)品質(zhì)的影響具有物種差異性。本研究中葉面噴施一定量ABA可以提高黃瓜的可溶性糖含量以及抗壞血酸含量,這與曲文穎等[29]的研究結(jié)果相似,可能是因?yàn)橥庠词┯肁BA可以促進(jìn)黃瓜果實(shí)內(nèi)源ABA的積累,從而增加了糖分的運(yùn)輸和積累導(dǎo)致的[23],然而本研究發(fā)現(xiàn),ABA濃度高于400 μmol/L(T4)時(shí),抗壞血酸含量反而降低。獨(dú)特的風(fēng)味是黃瓜的重要特征之一。黃瓜風(fēng)味品質(zhì)在很大程度上決定于黃瓜濃郁的清香氣息,其最重要的物質(zhì)是反,順-2,6-壬二烯醛,其含量越高,黃瓜風(fēng)味越濃郁[30]。本研究發(fā)現(xiàn),噴施ABA抑制了黃瓜風(fēng)味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛的累積。說明,葉片噴施一定濃度的ABA可促進(jìn)可溶性糖和抗壞血酸含量的累積,但是會抑制風(fēng)味物質(zhì)的累積。

ABA作為一種植物激素,可以用過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控下游基因的表達(dá)[6]。轉(zhuǎn)錄因子通過與DNA特異性結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá),參與植物的生長發(fā)育過程。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),黃瓜葉片噴施ABA后,黃瓜果實(shí)中大量轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)發(fā)生變化,包括鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(C2H2和C3H)、bHLH轉(zhuǎn)錄因子、MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、bZIP轉(zhuǎn)錄因子以及NAC轉(zhuǎn)錄因子等。鋅指蛋白構(gòu)成了最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,根據(jù)保守區(qū)域可以分為9個(gè)亞家族,包括C2H2(Cys2/His2)、C3H、C3HC4、C2HC5、C4HC3、C2HC、C4、C6和C8。C2H2是研究最多的鋅指蛋白,C2H2鋅指蛋白在植物非生物脅迫中有著重要的作用,包括在鹽分脅迫、滲透勢脅迫、冷脅迫、干旱脅迫、氧化脅迫以及高光脅迫中都起重要作用,C2H2鋅指蛋白通過與ABA信號通路相互協(xié)調(diào)、相互促進(jìn)來調(diào)控植物對非生物脅迫的響應(yīng)[31]。C2H2和C3H轉(zhuǎn)錄因子中有3個(gè)基因表達(dá)上調(diào),3個(gè)基因表達(dá)下調(diào),說明外源ABA處理影響黃瓜果實(shí)脅迫響應(yīng)基因的信號通路。此外,NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族,主要調(diào)控植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)[32]。堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)是一類廣泛存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子,主要參與了植物的生長發(fā)育、環(huán)境因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程以及脅迫響應(yīng)[33]。葉片噴施ABA后,這類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平都發(fā)生顯著變化,進(jìn)一步說明ABA對脅迫響應(yīng)信號通路的調(diào)控作用。bHLH轉(zhuǎn)錄因子、MYB轉(zhuǎn)錄因子以及WD40蛋白構(gòu)成MBW蛋白復(fù)合體,在植物生長發(fā)育以及次生代謝產(chǎn)物合成途徑的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用[34]。本研究中,bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量均上調(diào),MYB轉(zhuǎn)錄因子2個(gè)上調(diào),1個(gè)下調(diào)。轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)說明葉片噴施ABA可能通過調(diào)控黃瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),從而影響黃瓜代謝產(chǎn)物的合成。

4 結(jié) 論

外源噴施ABA后,通過調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)因子,增加黃瓜果實(shí)可溶性糖含量的累積,但是風(fēng)味物質(zhì)的累積顯著降低。此外,外源ABA濃度增加會引起黃瓜抗壞血酸含量降低。在生產(chǎn)中,通過外源噴施ABA提高黃瓜抗逆性需要選擇合適濃度,本研究結(jié)果表明,施用50 μmol/L的ABA對黃瓜品質(zhì)影響較小。