高效液相色譜法對(duì)養(yǎng)胃合劑中芍藥苷的含量測(cè)定與方法學(xué)研究

李桂芹,楊景然,和文宇,趙樹花,劉宇,張寶洪

慢性胃炎是由各種病因引起的胃黏膜慢性炎性反應(yīng),發(fā)病率在多種慢性胃病中居第一位[1-2]。該病臨床主要表現(xiàn)為胃脘部疼痛、飽脹、惡心嘔吐、反酸及納呆等,西醫(yī)主要給予對(duì)癥治療,但總體療效較仍有欠缺。慢性胃炎病程長(zhǎng),病情易反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3-4]。養(yǎng)胃合劑系云南省第一人民醫(yī)院臨床使用多年的經(jīng)方中藥復(fù)方制劑,由北沙參、白芍、黃芩、木香、炒麥芽、炒谷芽、陳皮、厚樸和甘草等組成,具有養(yǎng)胃健脾、行氣消脹、和胃止痛之功效,可治療胃脘脹痛、消化不良,如慢性胃炎等疾病。養(yǎng)胃合劑安全性高,藥效肯定。中醫(yī)講究辨證論治,望聞問切,用藥須合中醫(yī)理論的君、臣、佐、使。由于復(fù)方中藥方劑中所用藥材眾多,明確復(fù)方方劑中的君藥、臣藥、佐藥和使藥并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制,對(duì)保證藥效至關(guān)重要。為更好地確保藥材質(zhì)量,本研究以方劑中白芍[5]為主要成分作為質(zhì)控指標(biāo),采用高效液相色譜法測(cè)定,測(cè)定芍藥苷含量[5-9]。本研究旨在建立養(yǎng)胃合劑的質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)并對(duì)方法進(jìn)行分析探討。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC-1260液相色譜儀(配有1260泵、1260自動(dòng)進(jìn)樣器和紫外檢測(cè)器,美國(guó)Agilent公司),XW-8柱溫箱(天津奧特恩斯儀器有限公司),CPA225D型電子天平(賽多利斯),KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥及試劑 芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-201842)為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。甲醇和乙腈(色譜純,Sigma公司),磷酸和乙醇(分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水;其他試劑均為分析純。供試品(樣品)：養(yǎng)胃合劑(云南省第一人民醫(yī)院制劑,批號(hào)：20181122、20181129、20181205,規(guī)格：200 ml/瓶)。樣品含北沙參、白芍等。本品每1 g含白芍以芍藥苷(C23H28O11)計(jì),不得少于0.90 mg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACE-EXL-121-2546U(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86),流速1.0 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm,柱溫25 ℃。

2.2 制備對(duì)照品溶液 取對(duì)照品芍藥苷,精密稱定,加入稀乙醇溶液,隨后制備成每1 ml含60 μg的對(duì)照品溶液,備用。

2.3 制備供試品溶液 取供試品養(yǎng)胃合劑(批號(hào)：20181122)約1 g,精密稱定,置于帶玻璃塞的錐形瓶中,加稀乙醇溶液50.0 ml,隨后稱定重量,進(jìn)行超聲處理(功率240 W,頻率45 kHz)30 min,自然冷卻,加稀乙醇溶液以補(bǔ)足減失的重量,反復(fù)振搖,濾過,作為供試品溶液,備用。

2.4 制備陰性對(duì)照品溶液 按處方比例,取不含白芍藥材的陰性對(duì)照樣品,加水煎煮兩次,每次1 h,濃縮成浸膏,按照制備處方工藝加入比例的輔料,混勻。按“2.3”項(xiàng)制成不含芍藥的陰性對(duì)照品溶液,備用。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取芍藥苷對(duì)照品、養(yǎng)胃合劑供試品和陰性對(duì)照品溶液各10 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,見圖1-3。陰性對(duì)照品色譜圖與芍藥苷對(duì)照品、養(yǎng)胃合劑供試品色譜圖中相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn),表明陰性對(duì)照品無干擾,方法專屬性好。

2.6 考察線性范圍 精密吸取“2.2”項(xiàng)的芍藥苷對(duì)照品溶液2、5、10、20、25 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,測(cè)其峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo),芍藥苷對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程：芍藥苷Y=1306.6X-4.7384,r=1.0000,表明芍藥苷在0.11788～1.4735 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 供試品溶液色譜圖

圖3 陰性對(duì)照品溶液色譜圖

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)的芍藥苷對(duì)照品溶液10 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,芍藥苷峰面積RSD為0.77%,表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批次養(yǎng)胃合劑(批號(hào)：20181122)6份,按“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法平行制備,精密吸取各10 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,芍藥苷峰面積RSD為1.85%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)供試品溶液,于室溫下存放,分別于0、2、4、6、17、25 h精密吸取供試品溶液10 μl,自動(dòng)進(jìn)樣于高效液相色譜中,芍藥苷峰面積RSD為1.25%,表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 稱取同一批次養(yǎng)胃合劑(批號(hào)：20181122,含量0.207%)0.5 g,精密稱取6份,置帶有玻璃塞的錐形瓶中。分別精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液(濃度0.9867 mg/ml)0.8、1.0和1.2 ml各2份,按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,芍藥苷回收率為104.1%,RSD為1.52%。表明該法回收率好,滿足回收率限度90%～108%的要求,見表1。

表1 芍藥苷的加樣回收試驗(yàn) (n=6)

2.11 樣品含量測(cè)定 取3批養(yǎng)胃合劑(批號(hào)：20181122、20181129、20181205)0.5 g,每批取2份,精密稱取6份,按“2.3”項(xiàng)進(jìn)行制備,精密吸取各10 μl,注入高效液相色譜儀,測(cè)定含量,見表2。據(jù)3批樣品芍藥苷的含量測(cè)定,平均每1 g養(yǎng)胃合劑含芍藥苷1.94 mg。由于藥材隨產(chǎn)地、批次不同,其含量略有差異,依據(jù)白芍飲片芍藥苷含量限度為不得少于1.2%投料計(jì)算,制得成品的含量為0.92 mg/g?？紤]到提取過程中偏差,故每1 g含白芍以芍藥苷(C23H28O11)計(jì),不得少于0.90 mg。

表2 3批養(yǎng)胃合劑樣品中芍藥苷的含量

3 討 論

養(yǎng)胃合劑中北沙參和白芍為君藥、黃芪、厚樸、陳皮和木香為臣藥,丹參、焦山楂、炒麥芽和炒谷芽為佐藥,甘草為使藥。白芍是一種用藥歷史悠久的傳統(tǒng)中藥,其藥用資源豐富,《本經(jīng)》記載其“主邪氣腹痛,除血痹,破堅(jiān)積,治寒熱疝瘕,止痛,利小便,益氣”,因其功效豐富,被廣泛應(yīng)用于中西醫(yī)臨床治病研究[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,白芍含有效成分芍藥苷,具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、肝保護(hù)、腦和神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)等多種作用,其中肝保護(hù)、腦和神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)功能多依托于芍藥苷降低氧化應(yīng)激損傷、調(diào)控促炎因子減少炎性反應(yīng)損傷和調(diào)控細(xì)胞凋亡的藥理活性[11-13],與本品針對(duì)慢性胃炎具有極強(qiáng)的相關(guān)性。

芍藥苷的提取工藝有乙醇超聲提取、乙醇回流提取、乙醇索氏提取和水提取。張騰騰等[14]研究表明,采用醇溶液超聲提取芍藥苷方法簡(jiǎn)便、提取率高、價(jià)格低廉。對(duì)于提取溶劑及方式的選擇,本試驗(yàn)在不同溶劑甲醇、乙醇和稀乙醇中進(jìn)行超聲處理(功率240 W,頻率45 kHz)和回流提取各30 min,測(cè)定養(yǎng)胃合劑中芍藥苷的含量,結(jié)果表明同一提取方式下稀乙醇提取能力最高,同一提取溶劑下相同提取時(shí)間,超聲提取能力與回流相似。故確定提取溶劑為稀乙醇,因超聲提取法實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便,提取時(shí)間短,提取效率高,無需加熱,故選用超聲提取法。對(duì)于提取時(shí)間的考察,在用超聲處理(功率240 W,頻率45 kHz)分別提取30、60、90 min,測(cè)定芍藥苷的含量,結(jié)果表明超聲提取30 min與60、90 min提取幾乎完全,效率一致,故確定超聲提取時(shí)間為30 min。

白芍具有抗炎、保肝、鎮(zhèn)痛、養(yǎng)血等藥理作用。白芍總苷是白芍的提取有效部位,主要包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷等成分[15]。由于近年的實(shí)驗(yàn)中多以白芍總苷為整體分析對(duì)象進(jìn)行藥理研究,少見對(duì)其具體成分進(jìn)行分離解析,因此可對(duì)白芍單體成分進(jìn)行分析,進(jìn)一步利用中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),擴(kuò)大臨床治療范圍,充分發(fā)揮藥理活性[5]。車婭莉等[16]對(duì)中國(guó)16個(gè)產(chǎn)地的白芍和赤芍的芍藥苷成分進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,野生芍藥根中芍藥苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于6.0%,D兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.05%,而未加工的人工栽培芍藥根中芍藥苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于6.0%,未檢測(cè)到D兒茶素,說明不同產(chǎn)地、特別是道地與非道地的白芍藥材之間芍藥苷含量存在明顯差異。因此在制劑中,應(yīng)明確標(biāo)明藥用產(chǎn)地,為標(biāo)準(zhǔn)建立提供支撐和依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。