PABPC1對人單核白血病細(xì)胞系THP-1翻譯活性的影響

翟雪瑩，王 芳，余 佳

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005

急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是成人急性白血病中最常見的類型,是一組基因改變導(dǎo)致的造血干細(xì)胞克隆性增殖失調(diào)的高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性疾病[1]。目前,標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療及聯(lián)合造血干細(xì)胞移植是AML患者臨床治療的主要手段[2]。但是AML在形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)表型、細(xì)胞遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)等方面具有高度的異質(zhì)性,AML患者間的生存概率和預(yù)后差異很大,大多數(shù)AML患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化治療后結(jié)果不理想,預(yù)后較差[3]。過去10～15年大量研究鑒定出AML中分子和表型的多樣性,并揭示了各種AML中分子和免疫治療靶點(diǎn)的可能性,提供了治療AML的新思路[4]。細(xì)胞質(zhì)多聚腺苷酸結(jié)合蛋白-1(cytoplasmic poly(A)binding protein-1,PABPC1)在細(xì)胞質(zhì)中介導(dǎo)mRNA的多聚腺苷酸化,參與翻譯起始及mRNA降解過程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。目前有關(guān)PABPC1在AML中的功能鮮有報道,THP-1細(xì)胞是1980年Tsuchiya等人建立的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系,本研究以THP-1細(xì)胞為研究對象,采用短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低PABPC1表達(dá)檢測其對THP-1細(xì)胞翻譯的影響,探究PABPC1作為治療AML潛在靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:商品化人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1(北京細(xì)胞中心)。

1.1.2 主要試劑:胎牛血清FBS(Life Technologies公司);Sucrose(Amresco公司);DEPC、KCl、Triton X-100、HEPES、DTT(Sigma-Aldrich公司);RNase Inhibitor- EDTA free、DNase Ⅰ(Promega公司);Protein safeTMprotease inhibitor cocktail-EDTA-free(TransGen Biotech公司);Glycerol(Solarbio公司); CHX-2112S(Cell Signaling Technology公司);UltraPureTM1 mol/L Tris-HCI緩沖液、NaCl、MgCl2、RNase Ⅰ、TrizolTMLS Reagent InvitrogenTM、UltraPureTMDNase/RNase-Free Distilled Water(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理:取THP-1細(xì)胞復(fù)蘇,用含10%滅活FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2),待細(xì)胞活力較好并增殖滿10 cm皿后,將THP-1細(xì)胞消化重懸,計數(shù)后接種于6孔板中(2×105/孔),將細(xì)胞中的培養(yǎng)基更換為無血清無雙抗培養(yǎng)基,對細(xì)胞進(jìn)行分組,分別分為實(shí)驗(yàn)的對照組和實(shí)驗(yàn)組,其中 PABPC1的shRNA序列通過Sigma網(wǎng)站在線設(shè)計,挑選已經(jīng)驗(yàn)證且準(zhǔn)確度最高的兩條序列作 shPABPC1-1#和shPABPC1-2#,再設(shè)計一段無關(guān)的隨機(jī)序列作為對照。其中處理細(xì)胞的分組為:1)對照(control)組:按照說明書上的實(shí)驗(yàn)參考條件,給細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入 5 μL Lipofectamine3000和50 μmol/L國際通用的與所有基因均無同源性序列的 nontarget shRNA;2)敲低PABPC1表達(dá)組(shPABPC1組):給細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入5 μL Lipofectamine3000和50 μmol/L shPABPC1。轉(zhuǎn)染24 h后更換新鮮有血清培養(yǎng)基并加入1 mg/L嘌呤霉素進(jìn)行篩選,篩選的最適藥物濃度參考嘌呤霉素的說明書并做相關(guān)的藥物梯度實(shí)驗(yàn),篩選后繼續(xù)培養(yǎng)待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Western blot檢測PABPC1蛋白表達(dá)量:待對照組和實(shí)驗(yàn)組的THP-1細(xì)胞增殖滿培養(yǎng)皿后,收集并裂解各組THP-1細(xì)胞以提取總蛋白,采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測蛋白濃度,各樣品取20 μg變性的蛋白質(zhì)進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至NC膜,5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗(PABPC1,1∶1 000稀釋、GAPDH,1∶10 000稀釋),4 ℃孵育過夜,1×TBST洗滌,加入二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔,1∶10 000稀釋),室溫孵育 2 h。1×TBST洗滌,顯色,曝光,采用Image J軟件進(jìn)行定量蛋白質(zhì)分析。

1.2.3 Polysome profiling實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的翻譯活性:在實(shí)驗(yàn)前配制好20%、50%濃度的蔗糖溶液,分別取10 g、25 g蔗糖溶于蔗糖buffer中至50 mL,緩慢倒置搖勻。待對照組和實(shí)驗(yàn)組的THP-1細(xì)胞增殖滿培養(yǎng)皿后,收集并裂解各組已經(jīng)CHX固定好的THP-1細(xì)胞沉淀,離心吸取上清液,在離心期間配置蔗糖密度梯度溶液,金屬長吸頭安裝在10 mL注射器上,使用之前吹空注射器以去除金屬吸頭內(nèi)的液體。先加20%濃度的蔗糖溶液,吸入蔗糖溶液插入離心管底緩慢加入直到蔗糖溶液體積到達(dá)超速離心管刻度線上方2 mm左右,同樣方法加入50%濃度的蔗糖溶液。待加完蔗糖溶液蓋上超速離心管的的短帽,在自動梯度儀上選取參數(shù)為SW41,sucrose,20%～50%,點(diǎn)擊“RUN”鍵進(jìn)行梯度制備。運(yùn)行結(jié)束后直接掀開短帽,槍頭貼在液面下吸出多余的蔗糖梯度溶液,吸完后沿側(cè)壁緩慢加入樣品。待蔗糖梯度溶液中加入樣品后,將超速離心管轉(zhuǎn)移至SW1轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)子架內(nèi),擰緊轉(zhuǎn)子蓋,在超速離心機(jī)38 000 r/min,3 h進(jìn)行超速離心。離心結(jié)束后再按照Biocomp密度梯度分離系統(tǒng)分離樣品組分,得到分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PABPC1在AML患者中高表達(dá)

分析GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中542例AML患者數(shù)據(jù)和73名健康人數(shù)據(jù)(圖1),相較于健康人,PABPC1在AML患者中的表達(dá)量更高,健康人組的相對表達(dá)量均值為9.437,AML患者組的相對表達(dá)量均值為9.590(P<0.001)。其中542例AML患者數(shù)據(jù)類型包括:正常核型的AML數(shù)據(jù)、伴有缺失異位等染色體突變的AML數(shù)據(jù)、復(fù)雜融合型AML數(shù)據(jù)。

Expression levels of PABPC1 in AML patients and normal pesron using GEO GSE13159 dataset, AML contains 3 differernt subtypes: normal karyotype(n=351), chromosome mutant subtype(n=105), complex subtype(n=86); *P<0.001 compared with normal person

2.2 轉(zhuǎn)染shPABPC1對THP-1細(xì)胞中PABPC1的表達(dá)水平的影響

圖2顯示shPABPC1-1#組與shPABPC1-2#組THP-1細(xì)胞中的PABPC1蛋白表達(dá)水平相較于對照組分別降低了59%(P<0.001)與21%(P<0.01)。THP-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染shPABPC1后,其PABPC1表達(dá)量明顯下降。由于在THP-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shPABPC1-1#的敲低效果更顯著,所以選擇轉(zhuǎn)染shPABPC1-1#的THP-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A.expression of PABPC1 protein in THP-1 cells transfected by shPABPC1; B. relative protein levels of PABPC1 detected by n=3); *P<0.01, **P<0.001 compared with sh-Ctrl group

2.3 敲低PABPC1抑制THP-1的翻譯活性

圖3顯示相較于對照組,敲低PABPC1的THP-1細(xì)胞中40 s亞基波峰基本不變,60 s亞基波峰降低,多核糖體部分顯著減少,組裝形成80S核糖體的亞基在敲低PABPC1組的THP-1細(xì)胞中基本上不受影響。

Polysome profiling was used to detect translational activity of THP-1 cells

3 討論

PABPC1與mRNA中富含腺苷酸的序列結(jié)合,在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。同時PABPC1還參與mRNA的許多代謝通路,包括腺苷酸多聚化/脫腺苷酸化、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA翻譯、降解及mircoRNA相關(guān)調(diào)控[5]。

PABPC1在翻譯起始過程中起著關(guān)鍵作用,翻譯起始是蛋白質(zhì)合成中的限速步驟,在腫瘤中翻譯失控導(dǎo)致的異常激活很重要。PABPC1在翻譯起始中的主要作用是通過與eIF4G(eIF4F-m7G帽結(jié)合復(fù)合物的支架組分)相互作用來介導(dǎo)mRNA的環(huán)化,促進(jìn)mRNA翻譯[6]。以往的研究表明,翻譯異常,特別是由eIF4F-PABPC1復(fù)合物介導(dǎo)的mRNA異常環(huán)化可能是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵樞紐[7]。

長期以來,AML以其復(fù)雜的異質(zhì)性著稱,近年來,一些與翻譯相關(guān)的藥物對特定亞型的AML療效顯著[7-9],例如抗病毒藥物ribavirin只作用于M4/M5亞型,對其他亞型的AML翻譯抑制效果甚微[7],因此仍然需要尋找新的治療靶點(diǎn),開發(fā)新的治療策略惠及更多AML患者[10]。

通過公共數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示PABPC1在AML中表達(dá)量高于健康人,Polysome Profiling結(jié)果表明,組裝形成80S核糖體的亞基在敲低PABPC1組的THP-1細(xì)胞中基本上不受影響,但能夠繼續(xù)進(jìn)入多核糖體部分進(jìn)行主動翻譯的80S核糖體顯著減少,細(xì)胞內(nèi)整體翻譯效率降低。敲低PABPC1后,THP-1細(xì)胞中不論是mRNA結(jié)合核糖體亞基的能力還是mRNA翻譯效率均顯著降低,推測敲低PABPC1可以抑制THP-1中促癌基因的表達(dá),敲低PABPC1降低腫瘤細(xì)胞的惡性表型,從而達(dá)到治療目的。

綜上所述,敲低PABPC1可抑制THP-1細(xì)胞翻譯能力與翻譯效率,提示PABPC1在AML發(fā)生發(fā)展中可能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,具有成為AML治療靶點(diǎn)的可能性。