一例鵝病毒性痛風(fēng)診斷報告

摘要：2018年以來，灌云縣及周邊縣市的肉鵝養(yǎng)殖戶所飼養(yǎng)的雛鵝群暴發(fā)了以皮下及部分內(nèi)臟器官表面尿酸鹽沉積為特征的痛風(fēng)癥狀，經(jīng)研究表明，近期雛鵝痛風(fēng)的病原是一種新型鵝星狀病毒，給養(yǎng)鵝業(yè)造成極大損失，為區(qū)別于傳統(tǒng)認知的鵝痛風(fēng)（營養(yǎng)及代謝障礙引起的），有必要暫定為鵝病毒性痛風(fēng)。本文擬對雛鵝病毒性痛風(fēng)從病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化、診斷及綜合防治措施等方面進行詳細說明，以供參考。

關(guān)鍵詞：雛鵝；病毒性痛風(fēng)；鵝星狀病毒；防控

鵝病毒性痛風(fēng)是由新型鵝星狀病毒引起的一種以鵝的心包、皮下、肝臟等內(nèi)臟及關(guān)節(jié)出現(xiàn)大量尿酸沉積為主要特征的急性傳染性疾病，造成鵝的大量死亡，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1，2]。該病于1980年首次被McNulty等從患腹瀉和死亡的11日齡雛火雞的腸內(nèi)容物中檢出星狀病毒；1965年，英國學(xué)者Asplin發(fā)現(xiàn)了禽星狀病毒，但是受限于當(dāng)時的研究條件，并未將其命名為星狀病毒；1985年，Gough等才將該病毒鑒定并命名為鴨肝炎病毒2型，確定為鴨星狀病毒1型；后于1969年在美國發(fā)現(xiàn)的DHV-3，直到2009年才被確認為鴨星狀病毒2型；我國于2014年首次報道該病，2017年2月，我國暴發(fā)了一種主要引起雛鵝痛風(fēng)癥狀的傳染病，經(jīng)多位學(xué)者的初步研究證實，該次疫病的主要病原為鵝星狀病毒（AstV）[3]。該病主要發(fā)生在4～20日齡的雛鵝，最早可發(fā)生在1日齡。日齡越小，發(fā)病率越高，死亡率也越高[4，5]。主要通過消化道和呼吸道等進行水平傳播的新型鵝星狀病毒，也可通過種蛋發(fā)生垂直傳播[6]。本病一年四季均可發(fā)生，以冬春季節(jié)多發(fā)，其他時間較少發(fā)生，每年11月至次年5月份為高發(fā)季節(jié)。

新型鵝星狀病毒（goose astrovirus，GAstV）屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬，是一類無囊膜的正鏈單股RNA病毒，基因組全長為6.9～7.9 kb。在電子顯微鏡下可以觀察到病毒表面有5～6個突起，結(jié)構(gòu)呈球形，直徑大約28～30 nm。該病毒在自然條件下較為穩(wěn)定，可在4 ℃條件下穩(wěn)定存活數(shù)月之久。研究發(fā)現(xiàn)，我國現(xiàn)流行的新型鵝星狀病毒被分為兩個基因型群組，兩個群組之間同源性小于80%，有研究人員將兩群組劃分為GAstV-1及GAstV-2。已有學(xué)者從發(fā)病雛鵝體內(nèi)成功分離出GAstV-2，經(jīng)動物回歸實驗證明其能引起痛風(fēng)[7]。

近年來，灌云縣及周邊市縣肉鵝養(yǎng)殖戶反映痛風(fēng)病發(fā)病率有增長的趨勢，該病已成為限制肉鵝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的疾病之一。引起該病發(fā)生的因素很多，除了新型鵝星狀病毒外，還包含傳統(tǒng)認知的鵝痛風(fēng)（指體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝障礙和腎功能障礙所引起的營養(yǎng)代謝疾病，其發(fā)病原因是蛋白質(zhì)含量過高的飼料長時間攝入致使腎功能障礙，繼而尿酸鹽沉積在部分臟器上，如腎臟、輸尿管等），此外不佳的飼養(yǎng)環(huán)境、失衡的腸道菌群也是該病發(fā)生的誘因。

本文所述肉鵝養(yǎng)殖場在飼料、飼養(yǎng)管理環(huán)節(jié)加以改善后，鵝群仍發(fā)生了痛風(fēng)病，由此懷疑是由新型鵝星狀病毒引起的?，F(xiàn)就其中1例鵝痛風(fēng)診斷報告如下。

1 發(fā)病情況

2020年5月23日，沭陽縣韓山鎮(zhèn)張姓養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的雛鵝近4天死亡約600只，在當(dāng)?shù)刂委煙o效后，來筆者處診斷。主訴：5月5日，從該縣某肉鵝炕孵廠購進8 500只鵝苗，全部用某飼料集團肉鵝專用顆粒飼料喂養(yǎng)；第1、10日齡時接種過小鵝瘟抗體，13日齡時發(fā)現(xiàn)部分鵝苗采食量減少、有的鵝苗不愿活動或呆立，次日早晨巡查發(fā)現(xiàn)鵝苗死亡50余只，經(jīng)當(dāng)?shù)孬F醫(yī)診斷，疑似肉鵝痛風(fēng)，用通腎抗痛風(fēng)藥物進行治療，未見效果，3 d共死亡近540只（其中治療當(dāng)日死亡110只，次日死亡210只）。

經(jīng)問詢后分析，張姓養(yǎng)殖戶長期從事肉鵝養(yǎng)殖，鵝苗發(fā)病不存在飼養(yǎng)管理原因?qū)е碌臄D壓等非疾病因素所致死。

2 臨床癥狀

患病的雛鵝表現(xiàn)為精神萎靡，采食量明顯下降，直至食欲減退，行動遲緩或不愛走動，腹瀉，大便白色稀薄嚴重，死亡時神經(jīng)癥狀不明顯。

3 剖檢病變

剖檢病、死鵝13只，發(fā)現(xiàn)病死鵝的皮下可見尿酸鹽沉積（13/13），尤其是大腿內(nèi)側(cè)及腹部皮下覆有明顯的白色尿酸鹽沉積物（11/13）；心臟表面覆有白色尿酸鹽沉積物（13/13），肝臟表面覆有白色尿酸鹽沉積物（9/13），腸道等器官表面覆有白色尿酸鹽沉積物（13/13），具體剖檢情況見圖1～5。

4 診斷

4.1 初步診斷

通過養(yǎng)殖戶交代的發(fā)病經(jīng)過，結(jié)合臨床癥狀以及解剖情況，具有皮下、肝臟、心臟等器官部位尿酸鹽沉積等典型癥狀，初步診斷疑似星狀病毒引起的鵝痛風(fēng)。

4.2 鑒別診斷

1）飼料源性。剖檢可見心、肝、脾、腸系膜被白色尿酸鹽似石炭樣膜覆蓋，腎臟多為不對稱性腫大、尿酸鹽沉積，輸尿管變粗、內(nèi)有白色尿酸鹽沉積，而該病無明顯此特征癥狀。飼料源性痛風(fēng)無傳染性，多顯慢性發(fā)生，少見集中暴發(fā)病例，而該病特征正相反。

2）副傷寒。雛鵝20日齡內(nèi)易感，表現(xiàn)為精神不振，閉眼，眼瞼腫脹，兩翅下垂，排石炭狀或水樣稀糞，常阻塞肛門，鼻流漿液性分泌物，而該病無此特征。

剖檢可見肝腫大、表面被纖維素滲出物覆蓋，但肝上有淡黃色針尖大壞死灶，而該病無此特征；心包內(nèi)積有漿液性纖維素滲出物，而該病心包內(nèi)很少見到積有漿液。

3）禽流感。禽流感發(fā)生，常見鵝只腳蹼有出血斑等特征病變，而該病無此特征。剖檢可見皮下有黃色半透明的黏液，且呈現(xiàn)面積大，肺淤血，心內(nèi)外出血或淤血，而該病無此特征。

4.3 回歸實驗

無菌操作，取少許病鵝的心臟、肝臟等病料，青霉素和鏈霉素滅菌，加入生理鹽水，粉碎，高速離心分離，提取上清液備用。

取20只1日齡健康雛鵝隨機將其分成2組，每組10只。試驗組雛鵝經(jīng)皮下注射提取上清液，0.5 mL/只，對照組雛鵝經(jīng)皮下注射無菌生理鹽水，0.5 mL/只；自注射之日起對鵝群連續(xù)觀察15 d。

每日觀察雛鵝的臨床癥狀，剖檢病死雛鵝，可見大腿內(nèi)側(cè)、腹部皮下、心臟表面、肝臟表面、腸道等覆有白色尿酸鹽沉積物，具有該病解剖應(yīng)有的典型特征癥狀。

4.4 實驗室診斷

1）細菌分離。無菌操作取病死雛鵝的肝臟和腎臟組織，接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱培養(yǎng)基上，接種后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察有無細菌生長。

在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、馬丁瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱培養(yǎng)基上未見可疑菌落，細菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性。

2）病料采集。無菌操作采集病鵝的心臟、肝臟、腎臟等病變明顯器官，進行RT-PCR檢測。

3）病毒RNA的提取及RT-PCR檢測。

①病毒RNA提?。合葘惐挤胖?20 ℃預(yù)冷，將采集的適量病料放入含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）中進行研磨，將研磨好的病料放入1.5 mL離心管中，反復(fù)凍融3次。之后使用離心機，在4 ℃條件下，設(shè)置轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心3 min。取300 μL上清液后，置于干凈的1.5 mL EP管中，加入Trizol溶液500 μL，輕輕顛倒混勻后室溫靜置5～7 min；加入三氯甲烷200 μL，劇烈混勻15 s后靜置5 min；12 000 r/min離心10 min，取上清約400 μL至新的RNase-freeEP管中，加入已預(yù)冷的異丙醇400 μL，顛倒混勻后-20 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液；加入DEPC水配制的70%乙醇800 μL，顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清，室溫放置2～5 min。

②RT-PCR：以提取的RNA為模板進行RT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL，其中5×RT Buffer（Mg2+）4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，六堿基隨機引物（50 μmol）1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）1 μL，RI（40 U/μL）0.5 μL，DEPC水9.5 μL。RT-PCR反應(yīng)程序為：將反轉(zhuǎn)錄體系先放置25 ℃金屬浴中10 min，接著放置42 ℃水浴鍋中反轉(zhuǎn)錄1 h，然后放置70 ℃金屬浴中10 min對反轉(zhuǎn)錄酶滅活，最后可將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-20 ℃保存。

③PCR檢測：根據(jù)RNA依賴型RNA聚合酶（ORF1b），用Primer 5.0設(shè)計一對通用檢測引物，引物序列如下：上游引物F為5′-CGCTTYGATGGNATHCC-3′；下游引物R為5′-GGYTTKACCCACATNCCRAA-3′。產(chǎn)物大小428 bp，引物設(shè)計完成后交由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進行合成公司合成。

以上述cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為25 μL，其中cDNA 1 μL，10×TransTaq ？誖Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.5 μL，TransTaq？誖 DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL，上下游引物（10 mol/L）各0.5 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸適當(dāng)時間30 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠，電泳條件為恒定電壓110 V，時間30 min，之后使用凝膠成像儀進行觀察。

4）PCR檢測結(jié)果。利用合成的引物，以提取到的病毒cDNA為模板，擴增出明亮的428 bp大小的目的片段，且片段大小與預(yù)期一致（圖6）。PCR產(chǎn)物送公司測序，證實有鵝星狀病毒感染。

結(jié)合發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢病變、鑒別診斷及實驗室PCR方法診斷，確診該病為鵝病毒性痛風(fēng)。

5 防治措施

5.1 治療方案

未見該病治療確切方案報道，但經(jīng)筆者組方用藥，對該病例及前后確診的23例該類病例進行了治療，取得有明確的治療效果。

將10%氟苯尼考、10%安普霉素和“激活”（飼料添加劑，主要成分為屎腸球菌及中草藥發(fā)酵產(chǎn)物）混合兌水，前3 d按照說明書建議用量的2倍飲水治療，早晚2次；后續(xù)2 d按照說明書建議用量使用，鞏固治療效果。通過上述組方治療，用藥2 d后，大群鵝中未發(fā)現(xiàn)新增病例；用藥3 d后，未死亡病鵝也已基本康復(fù)。

5.2 預(yù)防措施

雛鵝星狀病毒感染引起的痛風(fēng)病主要通過糞-口傳播，采用地上網(wǎng)架飼養(yǎng)或多層籠養(yǎng)等育雛模式，可以有效減少和糞便污染過的飼料及水源的接觸，從而降低感染病原的幾率。

1）場地用具消毒。空置的欄舍分別用過氧乙酸、2%氫氧化鈉先后全面各噴灑一次，食具等設(shè)備用2%氫氧化鈉溶液浸泡1～2 d后，先清水洗滌清潔干凈，再用消毒劑如聚維酮碘等噴灑1次，晾干后備用。

2）帶鵝舍常規(guī)消毒。夏季帶鵝噴霧消毒1次/3d，秋冬季帶鵝噴霧消毒1次/7d；發(fā)病時，每天帶鵝噴霧消毒1～2次，經(jīng)常使用過氧乙酸、聚維酮碘等帶鵝消毒藥，濃度的選擇一般按說明書的規(guī)定。

3）飼養(yǎng)場地消毒。要定期對飼養(yǎng)場周邊環(huán)境進行清掃、消毒，一般保持1次/10d。

4）嚴格飲水衛(wèi)生。注意飲水的衛(wèi)生與消毒，日常要注意保持料槽和水槽的清潔，最好每天對料槽和水槽各洗滌1次，減少飲水和飼料被糞便污染的情況發(fā)生等。

5）購買健康雛苗。若發(fā)現(xiàn)疑似病毒病，要從根源上切斷傳播途徑，無害化處理被患病鵝接觸過的垃圾、糞便，同時做好及時隔離。

6）定期中草藥預(yù)防。飼料中添加防止腸道感染的中草藥制劑如穿甘苦參散、白頭翁散等，以及添加清熱解毒的中草藥制劑如雙黃連、板藍根、清瘟敗毒散等。

7）加強飼料管理。保持合理的飼養(yǎng)密度，注意調(diào)節(jié)圈舍溫、濕度，尤其是鵝苗到場的前14 d內(nèi)，要保持到合理的理想溫度；鵝苗到場后第1天要在飲水中加入多維及防腸道感染藥物進行預(yù)防。

8）嚴格執(zhí)行全進全出的飼養(yǎng)制度。每批育肥鵝出欄后，對飼養(yǎng)圈舍及內(nèi)部用品要做到及時徹底清洗消毒；對于潮濕的棚底積糞和道路，可用生石灰粉吸濕、消毒，針對戲水池用二氯異氰脲酸鈉等藥物進行水體消毒。同時注意要保持鵝舍至少空置一周以上再投入使用；如是活動式棚舍的可移動到其它清潔衛(wèi)生干燥的場所飼養(yǎng)。

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