溫度、氨氮和亞硝氮對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化的聯(lián)合影響效應(yīng)

賈文飛　易雨君

摘要：鱘作為具有重要生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水生生物，在氣候變暖和人類活動(dòng)的影響下其自然繁育面臨巨大威脅。為了探究環(huán)境因子對(duì)鱘早期胚胎發(fā)育的影響，采用3因子3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析法，開展了溫度（14～22℃）、氨氮（0.05～0.15 mg/L）和亞硝氮（0.05～0.25 mg/L）對(duì)西伯利亞鱘（Acipenser baerii）早期胚胎發(fā)育的聯(lián)合影響效應(yīng)研究，旨在建立溫度、氨氮和亞硝氮與西伯利亞鱘胚胎孵化率的定量關(guān)系，并通過多元回歸得出溫度、氨氮和亞硝氮的最佳組合。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，西伯利亞鱘胚胎孵化率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，隨著氨氮和亞硝氮濃度的降低，西伯利亞鱘胚胎孵化率逐漸升高。水溫與氨氮的聯(lián)合效應(yīng)對(duì)鱘胚胎孵化率的影響呈顯著水平（P<0.05），而水溫與亞硝氮的聯(lián)合效應(yīng)以及氨氮與亞硝氮的聯(lián)合效應(yīng)對(duì)鱘胚胎孵化率的影響不顯著（P>0.05）。建立的西伯利亞鱘胚胎孵化率模型方程的相關(guān)系數(shù)為0.9832，校正相關(guān)系數(shù)為0.9616。通過模型優(yōu)化得出西伯利亞鱘胚胎在溫度18℃，氨氮濃度低于0.08 mg/L和亞硝氮濃度低于0.13 mg/L條件下西伯利亞鱘胚胎的孵化率最高，達(dá)到90%以上。研究結(jié)果為西伯利亞鱘的人工繁殖和自然資源保護(hù)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：西伯利亞鱘胚胎；溫度；氨氮；亞硝氮；孵化率

中圖分類號(hào)：S965.215? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1674-3075（2023）06-0072-07

魚類產(chǎn)卵地的環(huán)境條件與它們的繁殖活動(dòng)，甚至種群的延續(xù)息息相關(guān)。魚類胚胎孵化過程會(huì)發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，這些過程會(huì)受到水體中各種環(huán)境因子包括溫度（Kappenman et al，2009; Güralp et al，2017）、鹽度（Bian et al，2016）、pH（Ko et al，2014）、氨氮（Chen et al，2013; El-Greisy et al，2016）、亞硝氮（Kroupova et al，2010; 韓楓等，2016）、溶解氧（Yang et al，2015）等的影響。水溫通過影響受精卵孵化酶活性進(jìn)而影響魚卵孵化（Kappenman et al，2009），水溫過高會(huì)破壞酶的活性，過低則抑制酶的活性（Bian et al，2016），且不同魚類胚胎發(fā)育所需的最適宜水溫范圍各不相同（Güralp et al，2017）。無機(jī)氮主要以非離子氨和亞硝氮的形式對(duì)胚胎的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生較大的毒害作用。不同物種對(duì)氨氮和亞硝氮的適應(yīng)性也有差異（Chen et al，2013），且水生生物的不同生命階段也會(huì)表現(xiàn)出不同的敏感性（Harcke & Daniels，1999; Chen et al，2012）。此外，多個(gè)環(huán)境因子對(duì)胚胎孵化影響的聯(lián)合效應(yīng)也是顯著的（彭俊，2011; 韓楓等，2016）。

鱘是起源最早的脊椎動(dòng)物類群之一，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值（Webb & Doroshov，2011; 班文波等，2016）。近年來，由于全球氣候變化引起的水溫異常、水利設(shè)施的建設(shè)和水體的富營(yíng)養(yǎng)化，導(dǎo)致鱘自然棲息的生境條件惡化，一些物種（如中華鱘Acipenser sinensis）已瀕臨滅絕（惠二青等，2018; 陶雨薇等，2018；Shen et al，2018）。了解環(huán)境因素對(duì)鱘胚胎發(fā)育的影響對(duì)鱘資源的保護(hù)具有重要意義。

目前關(guān)于鱘胚胎發(fā)育與環(huán)境因子的響應(yīng)關(guān)系研究，主要集中在溫度對(duì)其的影響方面（Park et al，2013；Kim et al，2018）。Park等（2013）通過孵化試驗(yàn)確定了最適宜西伯利亞鱘（Acipenser baerii）胚胎孵化的水溫為20℃左右，水溫低于20℃，受精卵發(fā)育速度較慢，水溫超過24℃會(huì)造成受精卵死亡；Kim等（2018）發(fā)現(xiàn)俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）胚胎的適宜孵化水溫與西伯利亞鱘相近；也有研究通過對(duì)天然產(chǎn)卵場(chǎng)的水質(zhì)調(diào)查來獲取鱘的適宜生存環(huán)境（王彩理等，2002）。然而這些研究沒有綜合考慮因子之間的互作性，未能準(zhǔn)確反映水生生物對(duì)多個(gè)環(huán)境因子脅迫的響應(yīng)，本研究針對(duì)水溫、氨氮和亞硝氮，采用響應(yīng)曲面法和Box-Behnken設(shè)計(jì)了系列試驗(yàn)，對(duì)多因子影響下的西伯利亞鱘胚胎孵化進(jìn)行了分析，以期構(gòu)建溫度、氨氮和亞硝氮對(duì)其胚胎孵化率的定量關(guān)系，得出孵化的最佳水溫、氨氮、亞硝氮條件，量化各因子及因子之間的交互影響，為西伯利亞鱘的人工繁殖和自然資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

西伯利亞鱘受精卵來自北京燕山長(zhǎng)城金鱒養(yǎng)殖基地，通過人工受精的方式獲得（Kim et al，2018）。為了消除個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，卵子和精子分別取自3組性腺發(fā)育良好的西伯利亞鱘，采用腹部擠壓法，將卵子擠入塑料盆中，再快速取適量精子與卵子混合，并用玻璃棒攪動(dòng)3 min實(shí)現(xiàn)受精。受精卵通過石灰法處理去除粘性（張耀武等，2017），并用清水沖洗備用。

1.2? ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用響應(yīng)曲面法分析溫度、氨氮和亞硝氮對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化的影響。響應(yīng)曲面法是用來研究不同變量間相互作用的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，該方法能夠以最少的試驗(yàn)量充分反映變量之間的響應(yīng)關(guān)系（Ahmad et al，2005），并找到最合適的條件，進(jìn)行較準(zhǔn)確的響應(yīng)預(yù)測(cè)（Wang et al，2014; 吳富華等，2016）。本研究采用3因子3水平的Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因子為水溫、氨氮、亞硝氮，分別以T、A、N表示，孵化率用HR表示。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置水溫為14～22℃，氨氮濃度為0.05～0.15 mg/L，亞硝氮濃度為0.05～0.25 mg/L。整個(gè)試驗(yàn)包括17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，各試驗(yàn)點(diǎn)的次序隨機(jī)安排，因子組合如表1所示。

試驗(yàn)?zāi)敢悍謩e用分析純NH4Cl和NaNO2與超純水配制而成（Chen et al，2013），試驗(yàn)液由母液經(jīng)曝氣脫氯后的自來水稀釋而成，試驗(yàn)水溫通過水溫控制器調(diào)節(jié)，依據(jù)西伯利亞鱘胚胎孵化所需的適宜水質(zhì)條件（Gisbert & Williot，2002），將水體溶解氧設(shè)為9.13～9.58 mg/L，pH為7.89～8.35，其他水質(zhì)指標(biāo)通過YSI水質(zhì)儀檢測(cè)以確保不同處理水平保持一致。試驗(yàn)容器為高30 cm，直徑20 cm的圓塑料桶，圓桶用高錳酸鉀液消毒處理，試驗(yàn)用水量為2 L，試驗(yàn)期間每8 h更換1次以保證水質(zhì)穩(wěn)定（圖1）。每個(gè)組次培養(yǎng)50粒成功受精的魚卵，試驗(yàn)過程中通過氣石使受精卵在水中保持翻滾，每天定時(shí)取出死亡的受精卵，每4 h觀察胚胎發(fā)育情況并記錄。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?ANOVA結(jié)果

西伯利亞鱘胚胎孵化的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，通過Design-Expert 10.0軟件對(duì)表1和表2中結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，建立了水溫、氨氮和亞硝氮對(duì)鱘胚胎孵化率影響的回歸方程：

西伯利亞鱘胚胎孵化率響應(yīng)曲面模型的ANOVA方差分析結(jié)果（表3）表明，模型的P值<0.0001，說明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平，失擬項(xiàng)P值為0.798，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型能夠充分說明因子與響應(yīng)變量之間的函數(shù)關(guān)系，所建立的孵化率模型有效。模型的擬合度通過相關(guān)系數(shù)R2和校準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)R2檢驗(yàn)，R2超過0.90表明模型擬合良好。該回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9832，表明孵化率98.32 %的變量可以通過所有自變量的線性、二次和交互影響解釋，校準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)R2=0.9616，表明模型擬合度良好。變異系數(shù)CV值相對(duì)較低（12.80 %），表明試驗(yàn)具有良好的精度和可靠性。模型精密度可達(dá)到19.315，滿足要求。從圖2中也可以看出，模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值分布在一條直線上，表明模型的精密度和可信度均在可行的范圍內(nèi)，因此可用該回歸方程分析和預(yù)測(cè)水溫、氨氮和亞硝氮對(duì)西伯利亞鱘孵化的影響。

對(duì)回歸模型系數(shù)估計(jì)的結(jié)果見表4，表明水溫和氨氮的一次效應(yīng)，氨氮的二次效應(yīng)對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化率的影響均極顯著（P<0.001），亞硝氮的一次效應(yīng)，水溫與氨氮的交互效應(yīng)，水溫和亞硝氮的二次效應(yīng)對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化率的影響均顯著（P<0.05），而水溫與亞硝氮的交互效應(yīng)以及氨氮與亞硝氮的交互效應(yīng)對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化率的影響不顯著（P>0.05）。氨氮的單因子影響最顯著（P<0.0001），其次是水溫（P<0.0004），最后是亞硝氮（P<0.007）。

2.2? ?響應(yīng)曲面分析

當(dāng)亞硝氮濃度固定在0.15 mg/L時(shí)，不同水溫和氨氮對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化的影響如圖3-a，3-b所示。隨著水溫和氨氮濃度的上升，孵化率呈現(xiàn)先增加到一定程度后開始降低的趨勢(shì)，水溫和氨氮對(duì)孵化的影響非常顯著，在水溫為11.8～18.9℃，氨氮濃度低于0.09 mg/L時(shí)，孵化率可達(dá)到80%以上。

當(dāng)氨氮濃度固定在0.10 mg/L時(shí)，不同水溫和亞硝氮對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化的影響如圖3-c，3-d所示。隨著水溫和亞硝氮的上升，孵化率同樣呈現(xiàn)先增加到一定程度后開始降低，水溫和亞硝氮對(duì)孵化的影響非常顯著，且水溫的影響程度更大。當(dāng)水溫為14～18℃，亞硝氮濃度低于0.16 mg/L時(shí)，孵化率可達(dá)到80%以上。

當(dāng)水溫固定在18 ℃時(shí)，不同氨氮和亞硝氮對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化的影響如圖3-e，3-f所示。隨著氨氮和亞硝氮的上升，孵化率先增加到一定程度后開始降低，相比于亞硝氮，氨氮對(duì)孵化的影響程度更大。當(dāng)氨氮濃度低于0.096 mg/L，亞硝氮濃度低于0.19 mg/L時(shí)，孵化率可達(dá)到80%以上。

2.3? ?模型優(yōu)化

本研究采用響應(yīng)曲面法中的數(shù)值優(yōu)化來獲取最佳孵化組合，數(shù)值優(yōu)化通過確定輸入變量（溫度、氨氮和亞硝氮）的組合，在期望的約束下優(yōu)化響應(yīng)（孵化率）。本研究主要目標(biāo)是最大化西伯利亞鱘的孵化率，有研究表明水溫與魚類胚胎的發(fā)育速率有顯著的關(guān)系，溫度越高胚胎發(fā)育速率越快（Park et al，2013; Wang et al，2014; Kim et al，2018），即高溫條件下胚胎越早發(fā)育到環(huán)境耐受性更高的仔魚階段，因此將水溫的期望設(shè)置為最大。通過數(shù)值優(yōu)化最終得到最佳條件為：水溫18.0℃，氨氮濃度低于 0.08 mg/L，亞硝氮濃度低于 0.13 mg/L，最大孵化率可達(dá)到91.2%。

3? ?討論

溫度是影響水生生物胚胎發(fā)育的重要因素之一。本研究中西伯利亞鱘胚胎的孵化率與水溫存在顯著的相關(guān)關(guān)系，溫度的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)與孵化率具有顯著正相關(guān)（P<0.05），表明隨著溫度的升高，西伯利亞鱘胚胎的孵化率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這一現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在其他鱘的研究中。Park等（2013）的試驗(yàn)研究表明，水溫為18～20℃時(shí)最適宜西伯利亞鱘孵化，此水溫條件下胚胎發(fā)育速率較高，同時(shí)也保證了孵化率水平較高。當(dāng)水溫超過20℃，西伯利亞鱘的孵化率會(huì)受到影響而降低，水溫到達(dá)24℃受精卵會(huì)大量死亡。Kim等（2018）對(duì)俄羅斯鱘受精卵孵化受水溫影響的試驗(yàn)研究得到了一致的結(jié)論。王彩理等（2002）對(duì)于中華鱘產(chǎn)卵場(chǎng)的環(huán)境調(diào)查顯示，水溫在17～21℃時(shí)中華鱘受精卵孵化率較高，超出適宜水溫，孵化率將大大降低，且畸形率也會(huì)增加。本研究發(fā)現(xiàn)西伯利亞鱘胚胎在14℃、18℃和22℃溫度下發(fā)育正常，隨著溫度的升高，孵化速率先升高后降低，在18℃時(shí)達(dá)到最大值。有研究稱水溫通過影響孵化酶的活力進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育速度（Kim et al，2018）。雖然水溫會(huì)影響鱘的孵化質(zhì)量（Park et al，2013；Kim et al，2018），但本研究中不同水溫下成功孵化的幼魚個(gè)體之間無顯著差異。在保證孵化質(zhì)量的前提下建議采用較高的溫度進(jìn)行的孵化，受精卵可盡早發(fā)育至適應(yīng)能力更強(qiáng)的仔魚階段（Gisbert & Williot，2002；莊平等，2009）。

已有研究證實(shí)魚類的早期發(fā)育對(duì)氨氮和亞硝氮較為敏感（Chen et al，2013; Shyam & Nakul，2013; 韓楓等，2016），本研究結(jié)果表明，氨氮和亞硝氮均顯著影響西伯利亞鱘孵化率（P<0.05），隨著氨氮和亞硝氮濃度的升高西伯利亞鱘胚胎的孵化率隨之降低。目前關(guān)于氨氮和亞硝氮對(duì)鱘胚胎孵化影響的試驗(yàn)性研究鮮有報(bào)道，主要的方法是通過產(chǎn)卵場(chǎng)的水質(zhì)調(diào)查來了解鱘孵化的水質(zhì)需求（戰(zhàn)培榮等，2002；胡小琴等，2009）。由于生活污水的排放導(dǎo)致葛洲壩壩下中華鱘產(chǎn)卵場(chǎng)水體氨氮濃度升高（胡小琴等，2009），結(jié)合本研究結(jié)果，為保證中華鱘的成功繁殖，建議對(duì)該區(qū)域氨氮進(jìn)行監(jiān)測(cè)并采取相應(yīng)措施進(jìn)行管理。戰(zhàn)培榮等（2002）對(duì)黑龍江段水質(zhì)的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示鱘鰉魚產(chǎn)卵場(chǎng)氨氮濃度平均值約為0.011 mg/L，亞硝氮濃度平均值為0.02 mg/L。不同物種對(duì)亞硝氮的敏感性存在差異，Kroupova 等（2010）得到鯉（Cyprinus carpio）胚胎孵化的無影響亞硝氮濃度為7.0 mg/L，更高濃度的亞硝氮會(huì)一定程度上延緩鯉胚胎的發(fā)育速度。虹鱒（Oncorhynchus mykiss）胚胎孵化的無影響亞硝氮濃度為0.01 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鯉（Kroupova et al，2008）。值得注意的是，相較于自然條件，室內(nèi)孵化系統(tǒng)中水質(zhì)更加穩(wěn)定，胚胎對(duì)氨氮和亞硝氮的耐受性相對(duì)較高（Kamstra et al，1996）。

環(huán)境因子對(duì)水生生物胚胎發(fā)育的交互影響因物種、影響因子和發(fā)育階段而存在差異（Wang et al，2012; Ko et al，2014; Wang et al，2015; 吳富華等，2016）。本研究結(jié)果顯示，水溫和氨氮的交互作用會(huì)對(duì)西伯利亞鱘的孵化產(chǎn)生顯著影響（P<0.05，見表3），表明水溫和氨氮協(xié)同作用于孵化過程。當(dāng)溫度和氨氮超過其最佳范圍時(shí)，溫度對(duì)西伯利亞胚胎孵化的負(fù)效應(yīng)會(huì)增強(qiáng)，死亡率會(huì)增加。因此在鱘的實(shí)際繁育過程中溫度和氨氮的交互作用是需要重點(diǎn)關(guān)注的影響因素。值得注意的是，pH和溶解氧會(huì)顯著影響氨氮和亞硝氮對(duì)胚胎發(fā)育的影響（Chen et al，2013），即水生生物胚胎對(duì)氨氮和亞硝氮的耐受性與水質(zhì)差異有關(guān)。例如，當(dāng)溶解氧較低時(shí)，氨氮對(duì)水生生物胚胎的毒性更大（Wang et al，2015; El-Greisy et al，2016）。本文沒有考慮pH、溶解氧和鹽度等其他因素的影響，也未對(duì)西伯利亞鱘受精及仔魚個(gè)體發(fā)育階段進(jìn)行試驗(yàn)和觀察，因此，后續(xù)需進(jìn)一步研究更多環(huán)境因素對(duì)鱘受精、孵化及幼魚生長(zhǎng)和存活的綜合影響。

4? ?結(jié)論

本文采用響應(yīng)曲面法建立了溫度、氨氮和亞硝氮對(duì)西伯利亞鱘孵化率的定量關(guān)系，并得出西伯利亞鱘胚胎的最佳孵化組合：溫度18℃，氨氮濃度低于0.08 mg/L，亞硝氮濃度低于0.13 mg/L。水溫與氨氮的聯(lián)合效應(yīng)對(duì)西伯利亞鱘胚胎孵化率的影響較大，水溫與亞硝氮以及氨氮與亞硝氮的聯(lián)合效應(yīng)影響不顯著。西伯利亞鱘胚胎對(duì)溫度、氨氮和亞硝氮的耐受范圍較窄，未來的環(huán)境變化對(duì)該物種的影響需要予以更多的關(guān)注。

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（責(zé)任編輯? ?張俊友? ?熊美華）

Combined Effects of Temperature， Ammonia Nitrogen and Nitrite Nitrogen

on Hatchability of Acipenser baerii Embryos

JIA Wen‐fei1，2， YI Yu‐jun1，2

（1. School of Environment， Beijing normal university， Beijing? ?100875， P.R. China；

2. Ministry of Education Key Laboratory of Water and Sediment Science， School of Environment，

Beijing Normal University， Beijing? ?100875， P.R. China）

Abstract：Sturgeons are an aquatic organism with important ecological and economic value， but their natural reproduction is threatened by climate warming and human activities. Thus， it is important for sturgeon conservation to explore the effect of environmental factors on embryo development. In this study， we analyzed the combined effects of temperatures （14-22 °C）， ammonia nitrogen （0.05-0.15 mg/L） and nitrite nitrogen （0.05-0.25 mg/L） on the hatching rate of Acipenser baerii embryos. By establishing a quantitative model of temperature， ammonia and nitrite on embryo hatching， we determined the optimal combination of the three environmental factors for embryonic development of this sturgeon species.? The incubation experiments were set using three treatment levels with a three factor Box-Behnken Design and Response Surface Methodology. Results show that the hatching rate of A. baerii embryos increased initially， and then decreased with temperature， and hatching rate increased with decreasing ammonia and nitrite. The combined effect of temperature and ammonia nitrogen on the hatching rate of A. baerii embryos was significant? （p<0.05）， while the combined effects of temperature and nitrite， and ammonia and nitrite were not significant （p<0.05）. The correlation coefficient of the hatching rate of A. baerii embryos toward temperature， ammonia and nitrite was 0.9832， and the adjusted correlation coefficient was 0.9616. The optimal combination of environmental factors for A. baerii embryo development was at temperature of 18 °C， ammonia below 0.08 mg/L and the nitrite below 0.13 mg/L， when the hatching rate of A. baerii embryos peaked at near 90%. Our study will provide theoretical evidence for artificial breeding and conservation of A. baerii.

Key words： Acipenser baerii embryo; temperature; ammonia nitrogen; nitrite nitrogen; hatching rate

收稿日期：2021-11-23? ? ? 修回日期：2023-05-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目（52025092）；北京市杰出青年基金項(xiàng)目（JQ19034）。

作者簡(jiǎn)介：賈文飛，1990年生，男，博士研究生，主要從事魚類生境模擬、泥沙輸移等相關(guān)研究。E-mail：jiawenfei_512@163.com

通信作者：易雨君。E-mail：yiyujun@bnu.edu.cn