橫斷山脈亞高山帶幾種高山櫟林下叢枝菌根菌(AMF)調(diào)查

李鴻博　黃耀華　康定旭等

關(guān)鍵詞：橫斷山脈高山櫟；叢枝菌根真菌（AMF）；系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建；分類地位

中圖分類號：Q945.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-1498（2023）01-0079-12

菌根是建立于植物根系和土壤菌根真菌之間的古老共生體系，在自然界中存在已有4億年之久，有研究統(tǒng)計(jì)，地球上大約86%的陸生被子植物能夠與真菌互作形成菌根共生體。叢枝菌根真菌（AMF）作為植物根系所在土壤環(huán)境中微生物群落的重要組成者之一，在個(gè)體層面可以促進(jìn)植物對K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺離子的有效吸收，幫助植物抵御逆境中來自生物或非生物的脅迫，宏觀群落層面則能夠優(yōu)化植被分布，森林中地下的龐大菌根系統(tǒng)能夠?qū)⒘帜緜€(gè)體有機(jī)相連而形成一個(gè)物質(zhì)資源共享體，加速種群建成并形成植物優(yōu)勢種，從而改變生態(tài)格局，可以說，菌根真菌和植物共生，是維護(hù)森林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定及發(fā)展的基礎(chǔ)。

高山櫟（Quercus spp.）作為一類廣泛分布在我國西部川、滇、藏地區(qū)的常綠硬葉櫟類植物，是橫斷山脈地區(qū)重要的野生植被群落優(yōu)勢種，多以成規(guī)模的林地出現(xiàn)或以離散點(diǎn)狀方式與其他喬木混生生長于海拔1800～4800 m的地區(qū)，其熱值高、生長速度快及萌蘗更新能力強(qiáng)的特點(diǎn)對該地區(qū)生態(tài)環(huán)境保持具有重要意義。當(dāng)前，外界公認(rèn)松科植物共生菌根類型為外生菌根已毋庸置疑，而櫟屬植物存在外生菌根共生現(xiàn)象的同時(shí)，是否能與內(nèi)生菌根真菌共生尚鮮有報(bào)道。楊淑嬌等對云南香格里拉高山櫟和高山松（Pinus densata Mast.）的林下菌塘微生物分布研究發(fā)現(xiàn)，高山櫟林下菌塘有大量AMF存在，且高山櫟林下菌塘中真菌和AMF生物量顯著高于高山松，但AMF種類豐度只有1種，綜合高山櫟和高山松林型下菌塘的多種微生物比較認(rèn)為，菌塘中的微生物類型是其菌落結(jié)構(gòu)組成的重要影響因素，林型則未影響林下微生物群落特征構(gòu)成。該研究說明在錯綜復(fù)雜的地下根系網(wǎng)絡(luò)中，不同類型土壤微生物之間的相互聯(lián)系往往對宿主植物林下菌群結(jié)構(gòu)和分布具有重要影響。張中峰將摩西球囊霉（Glomus mosseae （Nicol.＆Gerd.）Gerd.&Trapp）和根內(nèi)球囊霉（Glomus intraradices Schenck&Smith）接種至青岡櫟（Quercus glauca （Thunberg） Oersted）幼苗發(fā)現(xiàn)，AMF能夠顯著促進(jìn)青岡櫟幼苗葉面積和生物量增長，提升幼苗成活率，該結(jié)果表明，在人為干擾措施下，櫟屬植物能夠與AMF形成互惠共生關(guān)系?；谏鲜銮叭搜芯坎浑y推測，AMF與高山櫟組植物間應(yīng)當(dāng)存在相應(yīng)的聯(lián)系。這種聯(lián)系是否具有廣泛性和普遍性？同為被子植物門下的櫟屬植物高山櫟根系在非人為干擾的野生生境中，其根際及根系是否同AMF共生等問題值得深入探究?；诖耍狙芯考僭O(shè)橫斷山脈亞高山地區(qū)高山櫟林下同樣具有AMF分布，并且在自然條件下高山櫟植物根系存在AMF。分三步驗(yàn)證上述假設(shè)：第一，利用濕篩沉淀法對采自橫斷山脈不同地區(qū)高山櫟林下土壤樣本進(jìn)行孢子濕篩，利用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)結(jié)合的手段對其種類進(jìn)行鑒定。第二，利用分子克隆方法選取針對AMF 18S rRNA gene的特異引物對高山櫟外根際潛在的AMF進(jìn)行擴(kuò)增，測序檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果中是否存在AMF。第三，利用染色觀察的方法觀察高山櫟根系樣本內(nèi)是否存在典型的AMF叢枝、泡囊結(jié)構(gòu)，結(jié)合對比單孢提取與克隆擴(kuò)增結(jié)果，以期明確橫斷山脈亞高山帶自然環(huán)境中生長的高山櫟林下根圍、根際AMF種類，揭示橫斷山脈亞高山高山櫟林下AMF的演化方向。

1采樣地與材料

1.1采樣地概況

橫斷山脈作為世界年輕的山脈群之一，縱跨川、滇二省西部及西藏東部，山嶺曲折蜿蜒，谷高差懸殊，植被分布以海拔梯度差異明顯，受高空西風(fēng)環(huán)流、印度洋及太平洋季風(fēng)環(huán)流影響，氣候主要分為干濕兩季，降水多集中于5—10月，但因地形地勢復(fù)雜，地域遼闊，年均氣溫13.6℃，年降水量942.6 mm，部分地區(qū)降雨差異較明顯。由于該地區(qū)地勢陡峭，降雨所致的水土流失成為潛在威脅。

1.2樣品采集

于2020年7月、10月和2021年8月分別前往位于28°45′3″～30°59′35″N，97°40′25″～102°50′18″E（四川、西藏等地）以及99°11′46″E、28°11′51″N（云南香格里拉）地段，橫斷山脈亞高山帶的不同海拔（2340～3630 m）地區(qū)（表1）陽坡地段高山櫟天然林，各高山櫟林均為喬木或灌木純林，林下無其他植被。采集其根部10～30 cm處的土壤混合裝入9號自封袋，沿主根對高山櫟根系進(jìn)行挖掘，找到高山櫟根系側(cè)根、須根等與根際土裝入自封袋，放入含冰袋的保溫箱隔離貯存，標(biāo)記并編號，帶回實(shí)驗(yàn)室將根系于-80℃保存，土壤平鋪風(fēng)干置于塑封袋用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2試驗(yàn)方法

2.1高山櫟根系土壤AMF濕篩與鑒定

2.1.1高山櫟根部土壤AMF孢子篩取 將高山櫟根部土壤過40目篩后，精確稱量20 g土壤，倒入玻璃燒杯，加500 mL超純水浸泡12 h后，利用濕篩沉淀法過4目（100目165μm、140目105μm、200目74μm、300目50μm）篩出并將每一目篩出的孢子及細(xì)土倒入容積為1L的燒杯靜置，靜置15min后倒300 mL入封液漏斗，后向燒杯內(nèi)加水至500 mL。靜置15 min后向漏斗中填200 mLddH₂O，此步驟重復(fù)3次。后靜置15min并棄漏斗廢液300 mL。將每一目篩孢子用的封液漏斗置于鐵架臺，使用抽濾機(jī)（Rocker 600）將孢子抽濾至實(shí)驗(yàn)前預(yù)備好的畫有方格的濾紙上，編號標(biāo)記并放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2孢子形態(tài)學(xué)鑒定與孢子密度統(tǒng)計(jì) 在體式鏡（LAICA SE6）下從培養(yǎng)皿中的濾紙上挑出形態(tài)、顏色等不同的孢子，單個(gè)置于滴加ddH₂O的載玻片上在光學(xué)顯微鏡（LEICA MC170）下觀察并拍照，記錄孢子顏色、大小，輕輕將其壓破，觀察孢壁顏色、類型、厚度、層數(shù)及內(nèi)含物特征等，載玻片上還可加入Melzer's染液觀察是否存在顯色反應(yīng)，并拍照保存。同時(shí)，每拍攝一個(gè)孢子將與其形態(tài)相同的孢子挑至1.5mL的離心管內(nèi)-20℃冰凍保存，以便做分子鑒定時(shí)一一對應(yīng)。參照《VA菌根真菌鑒定手冊》（1988）和http：//invam.caf.wvu.edu網(wǎng)址上的圖片對照及近年來所發(fā)表的研究文獻(xiàn)成果，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

在體式鏡下統(tǒng)計(jì)每個(gè)土樣下的孢子數(shù)目，并計(jì)算出孢子密度，每個(gè)土樣4次重復(fù)。

孢子密度（SD）：指每克土樣中叢枝菌根真菌的孢子個(gè)數(shù)。

SD=某土樣中AMF所有孢子數(shù)／土壤干質(zhì)量。

2.1.3孢子的分子生物學(xué)鑒定 利用Chelex-100提取單孢DNA，向裝有孢子的離心管中加入600μLddH₂O，置入超聲波震蕩洗滌儀器（30Hz）震蕩3min，挑出孢子轉(zhuǎn)移至新的離心管，重復(fù)上述步驟以清洗孢子表面存在的雜質(zhì)。將清洗后的單孢轉(zhuǎn)移至新的離心管中（1.5 mL），加入30μL TE buffer，置于盛有液氮的保溫瓶速凍，取已滅菌的研磨棒在體式顯微鏡下將孢子研碎。加入15μL 20% Chelex-100后置于金屬恒溫水浴鍋98℃裂解10 min，放入-20℃冰箱冰浴5 min后取出，置于離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5417R）12000r·min^-1離心10 min，所得上清液即為用于擴(kuò)增的孢子的DNA模板。

參照《菌根學(xué)》中的擴(kuò)增辦法，對孢子DNA模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增上下游引物為GeoLl（5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3），GeoA2 （5-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）反應(yīng)體系為50μL（ddH₂O 20μL，Taq PCRMaster Mix 25μL，

GeoL1 1.5μL，

GeoA2 1.5μL，DNA 2μL）。94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30s，54℃退火1min，72℃延伸2 min，其中變性、退火、延伸進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸10 min。將擴(kuò)增后的PCR原液稀釋10～20倍作為第二輪DNA擴(kuò)增模板，第二輪PCR上下游引物為AM1（5'-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3'）和NS31-GC（5'-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3'）94℃預(yù)變性2 min，94℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸45s，其中變陛、退火、延伸進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸7 min，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（110V，25min）經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)（Molecular Imager GEL Doc TM XR）檢測，觀察結(jié)果，拍照并記錄。將條帶清晰的產(chǎn)物送擎科生物公司（TSINGKE昆明）測序分析。

2.2高山櫟根際潛在的AMF鑒定

2.2.1高山櫟根際AMF分子克隆 為證明高山櫟根系內(nèi)外根際存在AMF，取-80℃冷凍保存的西藏、四川（GSL1-a，GSL4-a）以及香格里拉地區(qū)的高山櫟根系（G）樣本，置于流水下沖洗根系表面后，分別剪成1cm長的小段放入1.5 mL的離心管中，加入75%的酒精后劇烈震蕩30 s，將根系取出至ddH₂O下沖洗，后放入已滅菌的研缽加液氮速凍并研磨至粉末狀。利用試劑盒（EZUP柱式植物基因組DNA抽提試劑盒，SANGONG），嚴(yán)格按照盒內(nèi)使用說明書的操作步驟提取高山櫟根系總DNA，使用AMF的特異上下游引物AML1，AML2對高山櫟內(nèi)外根際潛在的AM真菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL（ddH₂O 24.8μL，TaqPCRMasterMix16.2μL， AML1、AML2各2.5μL，DNA 4μL）。步驟為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30s，54℃復(fù)性1min，72℃退火2 min，其中變性、復(fù)性、退火進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸10 min。之后經(jīng)凝膠電泳（同2.1.3）檢測后，利用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，純化回收產(chǎn)物，使用克隆試劑盒（零背景TOPO-TA克隆試劑盒）嚴(yán)格按照使用說明將回收的DNA插入質(zhì)粒載體。于37℃在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h（將液體培養(yǎng)基放入搖床180～200 rpm震蕩培養(yǎng)）。培養(yǎng)完成后在超凈工作臺下取200μL菌液涂布于提前加入氨芐青霉素（AMP）的LB固體培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基吸收后封存，37℃恒溫培養(yǎng)12～16h。

在超凈工作臺下將培養(yǎng)好的菌落用無菌的移液器吸頭（量程為20μL）挑人提前加裝10μL ddH₂O的PCR管并抽吸混勻，利用AML1和AML2引物對DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL（ddH₂O22.8μL， Taq PCR Master Mix 20.2μL， AML1、AML2各2.5μL，DNA2μL）。94℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，65℃復(fù)性1 min，72℃退火45 min，其中變性、復(fù)性、退火進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸10 min。經(jīng)凝膠電泳檢測后將擴(kuò)增結(jié)果良好的樣本送至測序公司（SanGong昆明）測序。

2.2.2高山櫟根系A(chǔ)MF染色觀察 分別將2次采集的根系須根樣本剪成0.5～1 cm的小段，置入盛有10% KOH溶液的試管于水浴鍋90℃脫色處理，直至根系顏色變淡，用蒸餾水反復(fù)沖洗后加入0.5%的苯胺藍(lán)染液繼續(xù)90℃染色1 h，重復(fù)沖洗步驟用3%乳酸、甘油脫色2～3 d至半透明后，置于顯微鏡下觀察根系內(nèi)的AMF泡囊叢枝結(jié)構(gòu)。

2.3數(shù)據(jù)處理

利用Chromas2.22、觀察序列峰圖、DNAman 8剪貼與拼接序列。將序列提交至NCBI基因數(shù)據(jù)庫比對并下載同源序列。使用Mega X多序列比對并篩選建樹模型，選擇參數(shù)值最高的推薦模型，利用最大似然法1000次迭代循環(huán)檢驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

運(yùn)用EXCEL2016統(tǒng)計(jì)孢子密度數(shù)據(jù)及擴(kuò)增樣本序列比對數(shù)據(jù)。

3結(jié)果與分析

3.1幾種高山櫟土壤AMF孢子形態(tài)及土壤孢子密度特征

對高山櫟根部10～30cm土壤的篩取結(jié)果表明：各高山櫟樣地下均有大量AMF孢子存在，孢子直徑為50～220μm，形狀以球形、近球形為主。顏色多以黑色和深棕色出現(xiàn)，偶見棕黃或深棕紅，其中，部分孢子呈黑色，該類孢子在顯微鏡下壓裂未見明顯孢壁層數(shù)，部分孢子有分泌物滲出（表2，圖1）。目前，經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察的孢子均未見Melzer's染液染色反應(yīng)。5種高山櫟根系土壤樣本中孢子密度分別為GSL2（205.49）>GSL4（178.90）>GSL1（88.39）>GSL3（43.84）>GSL5（16.16）個(gè)·g^-1，不同高山櫟土壤樣本具有明顯差異，且呈喬木高山櫟大于灌木的趨勢（圖2），其中，GSL3為灌木但表現(xiàn)出孢子密度相對較低的特征。各樣本孢子100目下（直徑>165μm）以黑色硬質(zhì)孢子為主，多數(shù)孢子密集分布于300目篩（50～74μm）內(nèi)，呈深棕色。

3.2結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對高山櫟林下菌塘AMF孢子及根系A(chǔ)MF克隆的鑒定

對西藏、四川各高山櫟根圍土壤中的AMF分子鑒定結(jié)果表明：橫斷山脈不同海拔地區(qū)采集的高山櫟土壤AMF均與類球囊霉科（Paraglomeraceae）類球囊霉屬（Paraglomus）具有較近的親緣關(guān)系（表3）。經(jīng)西弗吉尼亞大學(xué)孢子比對網(wǎng)站（occultum｜Davis-INVAM｜West Virginia University （wvu.edu））比對發(fā)現(xiàn)，Paraglomus屬下目前收錄的菌種僅有巴西類球囊霉（Paraglomus brasilianum（Spain&J.Miranda）J.B.Morton＆D.Redecker）和隱類球囊霉（Paraglomus occultum （C.Walker）J.B. Morton&D.Redecker），但這2種AM孢子在顏色、質(zhì)地、孢壁層數(shù)與Melzer's染液反應(yīng)效果與目標(biāo)菌種均明顯不同。利用Mycobank檢索AMF Paraglomus屬，選取Gosling等和Mello等發(fā)表的AMF Paraglomus屬的幾種序列以及MAARJAM （ut.ee）中與本研究孢子相似度高于90%（相似度為90.9%～99.2%）的序列對幾種高山櫟林下AMF孢子進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果表明：明確到種的Paraglomus序列聚為一支，MAARJAM （ut.ee）中ParaglomeraceaeParaglomus sp.屬序列與樣本GSL2-014聚為一支（圖3），其余所有孢子與根系A(chǔ)MF克隆樣本能夠單獨(dú)聚為一支，其中，同源序列相似度高于97%的個(gè)體極有可能為類球囊霉屬內(nèi)某種真菌。

3.3云南香格里拉高山櫟根際AMF孢子和根系A(chǔ)MF的分子克隆

利用AMF特異引物AML1、AML2對香格里拉地區(qū)的高山櫟根系潛在AMF的ITS片段DNA克隆，結(jié)果表明：經(jīng)75%濃度酒精對高山櫟根系表面消毒30s后，其根系表面仍存在AMF的DNA。通過MAARJAM （ut.ee）網(wǎng)站比對發(fā)現(xiàn)，存在真菌普遍與球囊霉屬Glomus在Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列相似度較高，部分目標(biāo)菌種序列與Genbank中的序列對比有相似度較高的類球囊霉屬Paraglomus序列存在（表4），但其在覆蓋度（Query coverage）或最大識別度（Max identity）2個(gè)指標(biāo)并非最高。利用Bio-edit軟件檢驗(yàn)克隆所得目標(biāo)AM菌種同源性，發(fā)現(xiàn)17個(gè)菌種均為同一菌株，故選擇G1為代表，與該樣本下AMF孢子序列（GA、GB）一同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生演化樹（圖4），分析表明：目標(biāo)菌種樣品G1、GA和GB與Glomus versiforme（Y17651.1）聚為一支，說明其親緣關(guān)系與該屬較近，置信度可達(dá)98%，推測高山櫟能夠和與Glomus versiforme同源性較高的AMF形成共生關(guān)系，且其與林下菌塘孢子類似，二者均未能鑒定到種。說明能夠與香格里拉地區(qū)高山櫟根系共存的AMF極可能為球囊霉屬和類球囊霉屬，或與其并列的某一新屬真菌。

3.4幾種高山櫟根系A(chǔ)MF泡囊叢枝結(jié)構(gòu)觀察

幾種高山櫟根系苯胺藍(lán)染色結(jié)果表明：100～200倍放大時(shí)可見明顯的類泡囊和叢枝結(jié)構(gòu)，此類結(jié)構(gòu)在高山櫟根系內(nèi)主要呈圓形或近圓形（圖5a、b），部分呈橢圓形，部分泡囊分布密集，并伴隨“向無規(guī)則方向伸展”的橫向菌絲結(jié)構(gòu)，推測其為高山櫟根系于AMF共生所形成的泡囊和叢枝。

4討論

4.1高山櫟根圍土AMF的驗(yàn)證

自然界中能夠獨(dú)立生存的生物少之又少，幾乎所有生物之間普遍存在共生關(guān)系。AM作為一種重要的功能型土壤微生物，其與宿主植物間形成的共生體系能夠使宿主植物在群落構(gòu)成及其對外界生境在生態(tài)適應(yīng)性層面產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。調(diào)查野生生境中的AMF不僅能夠擴(kuò)充AMF菌種資源庫，有利于發(fā)掘AMF在不同宿主植物根系下的群落構(gòu)成及多樣性，且在探究其對于生態(tài)系統(tǒng)平衡穩(wěn)定的可持續(xù)發(fā)展層面具重要意義。

橫斷山脈一直以來是生物多樣性研究的熱點(diǎn)地區(qū)，不少學(xué)者研究認(rèn)為，4000～5000萬年前印度次大陸與歐亞板塊碰撞導(dǎo)致的青藏高原隆起，隨后該地區(qū)可能成為東亞北溫帶植物的避難所。楊欽周認(rèn)為，橫斷山脈縱向深切及垂直氣候帶的明顯分布促使硬葉櫟類古老櫟群的殘遺保留和新生類群的分化形成。因此，選擇古老的高山櫟組植物對其根系潛在的AMF進(jìn)行研究，從演化發(fā)育的角度能夠更有助于理解并揭示該地區(qū)AMF的起源、營養(yǎng)類型、生活方式及分類問題。

本研究利用濕篩沉淀法從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的視角證實(shí)高山櫟林下菌塘中存在AMF真菌孢子，這與楊淑嬌等基于磷脂脂肪酸（RLFP）方法研究香格里拉高山櫟林下菌塘微生物的結(jié)果一致，驗(yàn)證了AMF在野生條件下能夠廣泛存在于橫斷山脈亞高山地區(qū)高山櫟林下的假設(shè)。西藏、四川等地各土壤樣本中的孢子18S rRNA gene分子證據(jù)表明，所有孢子均與類球囊霉屬Paraglomus的親緣關(guān)系較接近，通過將各孢子的形態(tài)學(xué)特征與已證實(shí)或發(fā)表的孢子形態(tài)對比發(fā)現(xiàn)，其在顏色、質(zhì)地、孢壁層數(shù)和Melzer's染液反應(yīng)效果等方面均與目前已知的巴西類球囊霉、隱類球囊霉及其他幾種該屬下發(fā)表的新種具有明顯差異，故認(rèn)為該地區(qū)高山櫟林下AMF很有可能為類球囊霉屬下的未知種。由于其所處地理位置植被分布的古老與獨(dú)特性，結(jié)合18S rRNA gene序列相似度比對分析認(rèn)為，其或在漫長演化進(jìn)程中在Glomeraceae和Paraglomeraceae科便已出現(xiàn)分化?；谙到y(tǒng)發(fā)育樹（圖3）對橫斷山北部西藏四川等地區(qū)孢子的演化進(jìn)行推測，GSL2-14的演化介于Paraglomus和Archeaspora之間，而GSL1-001、2-008、3-007、4-003等則獨(dú)立分為一支，與前者呈并列關(guān)系，這與前人基于真菌分類學(xué)為“科”級別將Paraglomus和Archeaspora從Glomus中分離出去的分類學(xué)定位相吻合。

4.2高山櫟根系A(chǔ)MF擴(kuò)增結(jié)果的提示

由于目前AMF分子研究技術(shù)仍舊有一定的局限性，即缺乏一套通用的既能擴(kuò)增所有AM家族，又能排除非AM真菌的引物。因此，為保證克隆質(zhì)量，選擇AML1和AML2作為引物擴(kuò)增高山櫟根系（樣本GSL1-a、GSL4-a、G）AMF的18srRNA基因，發(fā)現(xiàn)與四川、西藏等地高山櫟克隆菌株相似度較高的AMF均為類球囊霉屬Paraglomus，與香格里拉地區(qū)高山櫟克隆菌株相似度較高的AMF則均為球囊霉屬Glomus。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明：Glomus versiforme與后者AMF同源性極高（圖4），西藏、四川與香格里拉等地高山櫟根系A(chǔ)MF結(jié)果存在一定差異。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是AMF在長期演化過程中隨地域環(huán)境變化（從西藏、四川到云南）和不同高山櫟種（表1）而逐漸發(fā)生分化。同時(shí)，本研究克隆結(jié)果與張中峰等將摩西球囊霉和根內(nèi)球囊霉接種至青岡櫟幼苗的結(jié)果類似，說明櫟屬植物在非人為干擾的野生環(huán)境下根系也存在AMF。第二，PCR擴(kuò)增過程中由于DNA模板中存在殘留的酚類及腐殖酸等，此類物質(zhì)難以去除并會對DNA擴(kuò)增造成一定影響。引物不同，擴(kuò)增過程中的靶向序列堿基對存在差異，并且擴(kuò)增時(shí)堿基錯配的概率也可能呈倍放大，從而造成序列比對時(shí)發(fā)生單孢提取與分子克隆出現(xiàn)結(jié)果上的差異。此外，高山櫟根系、土壤樣本均分別僅有一種AMF出現(xiàn)，可能提示不同高山櫟同時(shí)僅與一種AMF在內(nèi)外根際范圍產(chǎn)生聯(lián)系。有研究表明，碳源和植物內(nèi)源激素能夠?qū)M產(chǎn)孢能力產(chǎn)生重要影響，二者條件豐富的情況下孢子萌發(fā)率較高。同理，高山櫟生長在半陽坡地區(qū)，當(dāng)?shù)貧夂?、海拔及水熱條件使得土壤生境中的碳源及高山櫟宿主植物內(nèi)源激素發(fā)生變化，進(jìn)而一定程度干擾AMF產(chǎn)孢，而Paraglomus和Glomus在高山櫟根際微生物的生態(tài)位競爭過程中占據(jù)了相對優(yōu)勢地位，以此來確保自身所需碳源的充分供給。

綜合橫斷山脈亞高山帶幾種高山櫟林下菌塘AMF孢子調(diào)查及其根際AMF的克隆結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高山櫟組植物作為典型的被子植物，在與外生菌根真菌發(fā)生共生現(xiàn)象的同時(shí)，極有可能在自然環(huán)境中保留了與AMF存在共生的現(xiàn)象。在喜馬拉雅造山運(yùn)動后，橫斷山區(qū)長時(shí)間與外界環(huán)境隔離，土壤微生物在漫長的演化進(jìn)程中由于地理環(huán)境的相對封閉而發(fā)生分化，最終形成了現(xiàn)有存在的AMF孢子，而該類孢子隨區(qū)域（從西藏、川西到云南）變化顯示出一定的演化差異，具體體現(xiàn)在其形態(tài)及分子學(xué)方面的不同。因此，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系的構(gòu)樹結(jié)果中，該類孢子以單獨(dú)匯聚為一支呈現(xiàn)。

5結(jié)論

本研究利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的手段證明，自然條件下橫斷山脈亞高山地區(qū)高山櫟林下菌塘普遍存在AMF，利用分子克隆手段發(fā)現(xiàn)AMF可分布于高山櫟植物根系，且發(fā)現(xiàn)西藏、四川等地該類孢子在形態(tài)上與已知AMF屬種存在較大差異，極有可能為Paraglomus屬下的新種。同時(shí)，云南香格里拉地區(qū)高山櫟根系A(chǔ)M與Glomus屬更接近，說明AM在長期演化過程中隨地域遷移出現(xiàn)分化。本研究結(jié)果為揭示AMF對橫斷山脈亞高山帶高山櫟生態(tài)適應(yīng)性機(jī)制的影響提供新的證據(jù)，為進(jìn)一步了解橫斷山脈亞高山帶高山櫟林下AMF的形成與演化提供理論參考。