天津沿海牡蠣的形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定

于帥，劉利華，李永仁，郭永軍，陳麗梅

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

牡蠣（Concha Ostreae）分類學(xué)上隸屬軟體動(dòng)物門（Mollusca），雙殼綱（Bivalvia），珍珠貝目（Pterioida），牡蠣科（Ostreidae），又被稱為蠔、海蠣子等[1]。牡蠣分布很廣，除寒帶的某些特別地區(qū)外，熱帶、亞熱帶、溫帶和亞寒帶均有分布[2]。在中國，主要分布在從渤海、黃海向南至南沙群島的各個(gè)海區(qū)[3]。牡蠣肉質(zhì)鮮美，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，更被譽(yù)為“海中牛奶”，并且牡蠣具有生長迅速、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，牡蠣成為世界各國重要的海水養(yǎng)殖對(duì)象之一[1]。

天津市地處于渤海灣西北部，海岸線從南部的歧口到北部的澗河口，長約153千米[4]，歷史上天津大神堂海域曾經(jīng)是渤海灣貝類的重要棲息場所，形成了以活體牡蠣礁為基礎(chǔ)的獨(dú)特生態(tài)系統(tǒng)[5]。隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展和開發(fā)力度逐步加大，天津沿海海域面臨著環(huán)境污染和過度捕撈的嚴(yán)重威脅，貝類資源持續(xù)衰退。目前關(guān)于天津沿海牡蠣的分布及種類組成尚沒有詳細(xì)報(bào)道，其背景信息亟待闡明。傳統(tǒng)的分類方法主要是基于牡蠣的貝殼形態(tài)，但由于牡蠣的生活習(xí)性為營固著生活，使得外殼易受環(huán)境變化影響而造成誤差和混淆[6]。因此，為了探明天津海域牡蠣的物種多樣性，本研究在天津沿海設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行牡蠣樣品采集，在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，采用分子手段進(jìn)一步確定，以期明確天津沿海牡蠣的分布和種類，為天津地區(qū)的貝類物種多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用牡蠣于2019年7月2日、3日和11日分別采集于獨(dú)流減河口（壩上、灘涂、礁石）、北疆電廠防波堤與東疆港礁石，遵循隨機(jī)原則進(jìn)行采樣，采樣時(shí)不分大小，共采集野生牡蠣樣本127個(gè)。采樣點(diǎn)具體信息見表1。

1.2 樣本形態(tài)特征鑒定及保存

將采集到的野生牡蠣外殼表面的泥沙清洗干凈，用游標(biāo)卡尺測量牡蠣的殼長、殼寬、殼高，電子天平稱量牡蠣的總重和鮮肉重。

測量完畢后，對(duì)牡蠣貝殼的各部分特征進(jìn)行觀察記錄，包括殼型、殼表、殼內(nèi)顏色、鱗片形狀、放射肋分布情況以及閉殼肌痕形狀、顏色等。

通過形態(tài)特征對(duì)牡蠣進(jìn)行初步鑒定。選取具有典型性外殼特征的牡蠣樣本，對(duì)其內(nèi)殼和外殼分別進(jìn)行拍照記錄。樣品牡蠣按采集地點(diǎn)和區(qū)域分為5組，從每一組別中挑選4個(gè)外殼形態(tài)差別較大的個(gè)體，取牡蠣樣品閉殼肌，-20 ℃冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因組DNA提取和COI基因擴(kuò)增

1.3.1 基因組DNA提取

使用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）按照操作步驟提取牡蠣閉殼肌組織DNA。樣品DNA使用超微量分光光度計(jì)（Nanophotometer N60）檢測核酸濃度，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 目的基因PCR擴(kuò)增

牡蠣 COI序列擴(kuò)增所用的引物為通用引物L(fēng)CO-1 490（5＇-GGTCACAAATCATAAAGATATT GG-3＇）和 HCO-2 198（5＇-TAAACTTCAGGGT GACCAAAAAATCA-3＇）[7]。PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，其中包括 0.2 μmol/L引物、50～70 ng DNA模板、2×PCR buffer、2 mmol/L dNTPs、1.5 μmol/L MgCl2和2U Taq聚合酶（Takara）。循環(huán)參數(shù)如下：預(yù)變性95 ℃加熱5 min，變性 95 ℃ 30 s，引物退火51 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)30，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。其中引物合成及測序工作交由生工生物（上海）股份有限公司進(jìn)行。

1.4 序列數(shù)據(jù)處理

使用 Clustal X[8]軟件結(jié)合人工校對(duì)進(jìn)行多序列對(duì)比，校正序列后使用NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行核酸序列同源性比對(duì)。使用DnaSP 5軟件對(duì)牡蠣樣本的單倍型數(shù)目（Haplotype，H）、單倍型多樣性（Haplotype diversity，h）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，π）等進(jìn)行結(jié)果分析。在Genbank中選擇巨蠣屬的9條序列，以O(shè)strea chilensis為外群（表2），進(jìn)行聚類分析，采用 MEGA7軟件中的鄰接法（Neighbor- joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表2 從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載COI基因序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣形態(tài)特征分析

本次采集的牡蠣樣本經(jīng)形態(tài)特征初步鑒定后，全部為一個(gè)種類——長牡蠣（圖1）。采集到的樣本牡蠣個(gè)體基本中等大小，殼高為殼寬的2.5倍左右，存在個(gè)別個(gè)體相對(duì)較大的情況。其中在獨(dú)流減河口灘涂處采集的樣本個(gè)體較大，在北疆電廠防波堤采集的牡蠣樣本普遍較小，詳細(xì)的牡蠣形態(tài)特征參數(shù)見表3。

圖1 牡蠣樣本圖片

表3 牡蠣形態(tài)特征參數(shù)

在3個(gè)地點(diǎn)采集的牡蠣樣本外殼形態(tài)基本一致，絕大多數(shù)殼形為長型，少數(shù)殼形為近圓形。殼表顏色大多為褐色、黃褐色等。樣本左殼較大而且呈現(xiàn)凹陷狀，右殼稍小較平。殼面鱗片不明顯，有些個(gè)體殼表鱗片為波紋狀，層次稀疏，放射肋不明顯，殼內(nèi)表面大部分為白色，個(gè)別殼內(nèi)為黃色。殼頂腔較深，韌帶槽較長，閉殼肌痕大多為黃色、褐色等，近圓形或馬蹄形狀。

2.2 牡蠣COI序列分析

2.2.1 COI序列對(duì)比結(jié)果

20個(gè)牡蠣樣本經(jīng)測序后獲得16條可用序列，利用Clustal X[8]軟件進(jìn)行比對(duì)之后，進(jìn)行人工校對(duì)剪切后序列長度為578 bp。經(jīng)軟件分析，16個(gè)個(gè)體中存在9個(gè)單倍型（H），單倍型多樣性（h）為0.767，核苷酸多樣性（π）為0.001 73。使用NCBI網(wǎng)站上的Blast程序進(jìn)行核酸序列同源性比對(duì)，結(jié)果表明所測牡蠣樣本確為長牡蠣，支持形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。在16條序列中共有8個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生變異，分別是216 bp處（M4）、163 bp處（M6）、81 bp處（M9）、169 bp處（M10）、17 bp處（M14）、30 bp處（M16）、444 bp處（M17）和558 bp處（M20）。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

將本研究得到 COI基因序列的 9個(gè)單倍型（M3、M4、M6、M9、M10、M14、M16、M17和 M20）和巨蠣屬的9條序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。9個(gè)單倍型與長牡蠣C.gigas（FJ717 608）聚為一支，結(jié)合長牡蠣的形態(tài)特征，確定本研究采集的牡蠣樣本為長牡蠣。9個(gè)單倍型、長牡蠣C.gigas（FJ717 608）與福建牡蠣C.angulata（KX579 091）先聚為一支，再與熊本牡蠣C.sikamea（AB904 878）聚為一支，說明其親緣關(guān)系較近。

圖2 基于牡蠣 COI 基因使用鄰接法（NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 天津沿海牡蠣種類組成

結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與COI基因鑒定結(jié)果，得出本研究采集的牡蠣種類均為長牡蠣。長牡蠣（Crassostrea gigas）又稱為太平洋牡蠣，隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca），雙殼綱（Bivalvia），翼形亞綱（Pterimorphia），珍珠貝目（Ostreoida），牡蠣科（Ostreidae），巨蠣屬（Crassostrea），屬于牡蠣種類中體型較大的一種，具有廣鹽、廣溫性，廣布于中國、韓國和日本沿海海域，其主要集中棲息在低潮線附近至20 m 深處，在淺海的巖礁及潮間帶上天然分布，在河口生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。長牡蠣作為國內(nèi)牡蠣養(yǎng)殖的主要品種，擁有營養(yǎng)豐富，出肉率高、適應(yīng)能力強(qiáng)、生長速度快等特點(diǎn)[9-10]，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，我國遼寧、山東、江蘇、浙江、福建等沿海地區(qū)均為長牡蠣的主要養(yǎng)殖區(qū)域[11]。

本研究在3個(gè)采樣點(diǎn)采集的樣本均為長牡蠣，說明天津沿海牡蠣的物種多樣性比較單一。薛春汀[12]在對(duì)天津?qū)幒訁^(qū)俵口距今 5 000年左右的牡蠣礁進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，牡蠣礁的主要品種為長牡蠣，含有少數(shù)近江牡蠣，但是近些年的報(bào)道中均未發(fā)現(xiàn)近江牡蠣存在。黃津偉等[10]還發(fā)現(xiàn)天津漢沽大神堂潮間帶區(qū)域存在貓爪牡蠣，但由于此次采樣地點(diǎn)未包括此地，故并未發(fā)現(xiàn)該種類。因此我們認(rèn)為，進(jìn)一步對(duì)大神堂潮間帶及活體牡蠣礁進(jìn)行調(diào)查取樣，能夠得出更全面的結(jié)論。此外，在本研究的3個(gè)采樣點(diǎn)中，獨(dú)流減河口灘涂上采集的牡蠣個(gè)體最大，北疆電廠防波堤上采集的個(gè)體最小。并且在獨(dú)流減河口壩上、灘涂和礁石三個(gè)區(qū)域同時(shí)采集的樣本中，個(gè)體大小順序?yàn)椋簽┩浚窘甘緣紊希f明在不同的生存環(huán)境中，牡蠣的生長情況也存在一定差異。

本研究探明天津沿海牡蠣的種類和分布情況，對(duì)研究天津現(xiàn)生牡蠣資源狀況以及生物多樣性的保護(hù)具有重要意義，為野生牡蠣的種質(zhì)資源保護(hù)和合理開發(fā)提供了數(shù)據(jù)參考。

3.2 COI基因在牡蠣物種鑒定中的應(yīng)用

物種鑒定是生物研究和保護(hù)工作的基礎(chǔ)，以往的貝類鑒定主要是依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行，如張璽等[13]參照1928年以來搜集的標(biāo)本以及國外的資料，根據(jù)牡蠣的外部形態(tài)特征、內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)、生態(tài)習(xí)性和分布區(qū)域等把我國沿海牡蠣分為1屬、4亞屬、13種。李孝緒等[14]通過對(duì)中國沿海15種牡蠣的比較解剖學(xué)研究，將其分為2個(gè)科、4個(gè)亞科、10屬。但由于牡蠣的外殼易受環(huán)境變化的影響，僅依靠外形特征鑒定對(duì)于某些種類存在一定困難，如多名學(xué)者曾將中國北方沿海常見的長牡蠣種類認(rèn)定為褶牡蠣（Crassostrea plicatula）或僧帽牡蠣（Saccostrea cuccullata）[13-14]。王海艷等[15]在形態(tài)學(xué)分類的基礎(chǔ)上，利用COI、16S rRNA等基因序列對(duì)中國北方沿海典型海區(qū)的“褶牡蠣”重新進(jìn)行了系統(tǒng)分類學(xué)研究，并與Genbank的牡蠣序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果證明中國北方沿海礁石上分布的牡蠣與C.gigas聚為一支，確認(rèn)應(yīng)為長牡蠣。由于COI基因片段具有結(jié)構(gòu)簡單、富含系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)、較高的多態(tài)性、易被通用引物擴(kuò)增及較高的物種鑒定可靠性等特點(diǎn)[16]，近些年來在貝類分類鑒定中發(fā)揮了越來越大的作用，崔宗梅等[17]利用COI基因?qū)V東雷州半島東部沿岸潮間帶的牡蠣進(jìn)行鑒定，指出至少有 5種牡蠣分布于潮間帶，其中熊本牡蠣和福建牡蠣為優(yōu)勢種。李翠等[18]利用COI基因?qū)V西沿海牡蠣進(jìn)行物種鑒定，表明廣西沿海牡蠣物種豐富，至少7種牡蠣分布于潮間帶，其中優(yōu)勢種為貓爪牡蠣和熊本牡蠣。本研究中根據(jù)已有報(bào)道[7]使用通用引物L(fēng)CO-1 490和HCO-2 198進(jìn)行COI基因序列擴(kuò)增，重復(fù)性高，效果較好。說明應(yīng)用COI基因序列進(jìn)行天津沿海牡蠣鑒定是可行的。由于在不同區(qū)域采集的樣本中，牡蠣的形態(tài)差別較大，利用COI基因結(jié)合外形形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，有助于得出更加準(zhǔn)確的結(jié)論。