不同地點和復墾方式煤矸石山土壤中叢枝菌根真菌群落變化*

李 俠，葉誠誠，張永芳，張 巽，霍麗娟，蘇世鳴

不同地點和復墾方式煤矸石山土壤中叢枝菌根真菌群落變化*

李 俠1，葉誠誠2**，張永芳1，張 巽1，霍麗娟3，蘇世鳴4

（1.山西大同大學農學與生命科學學院，大同 037009；2.溫州市優(yōu)質農產品開發(fā)服務中心，溫州 325000；3.太原科技大學環(huán)境科學與工程學院，太原 030024；4.中國農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所/農業(yè)農村部農業(yè)環(huán)境重點實驗室，北京 100081）

以山西省大同市晉華宮人工復墾和自然恢復煤矸石山以及忻州窯自然恢復煤矸石山為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術對三座煤矸石山土壤AM真菌群落組成進行分析，并測定其土壤理化性質，以探究不同地點煤矸石山不同復墾方式下土壤中叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi, AM真菌）群落組成的差異及其土壤影響因子。結果表明：晉華宮人工復墾煤矸石山和忻州窯自然恢復煤矸石山AM真菌多樣性指數(shù)（Chao指數(shù)和香農?威納指數(shù)）存在顯著差異，但晉華宮人工復墾和自然恢復煤矸石山AM真菌群落的多樣性指數(shù)差異不顯著。試驗共檢測到67個AM真菌OTUs，可鑒定到3個AM真菌屬級分類單元，其中球囊霉屬（）在晉華宮人工復墾煤矸石山、晉華宮自然恢復煤矸石山和忻州窯自然恢復煤矸石山中均為最優(yōu)勢菌，多樣孢囊霉屬（）、類球囊霉屬（）僅出現(xiàn)在晉華宮自然恢復煤矸石山。多元置換方差分析和多維尺度分析結果表明，晉華宮兩種恢復方式的煤矸石山之間AM真菌群落組成差異不顯著，而晉華宮與忻州窯兩個地點的煤矸石山AM真菌群落組成差異顯著。AM真菌群落差異與土壤全氮、有機碳含量和AM真菌孢子密度相關。綜上，晉華宮人工復墾（10～20a）煤矸石山土壤AM真菌群落可達到與自然恢復（50～60a）煤矸石山較為一致的效果。兩個地點煤矸石山土壤AM真菌群落差異較大，土壤全氮、有機碳含量和AM真菌孢子密度是驅動AM真菌群落組成差異的主要因子。

煤矸石山；叢枝菌根真菌群落；球囊霉屬；Illumina MiSeq高通量測序

煤矸石山由開采、洗選和利用煤炭的過程中產生的廢棄煤矸石堆積而成[1]，是煤炭生產過程中的必然產物，也是礦區(qū)的主要污染源之一。在礦山開采過程中，幾乎所有的開采活動都超過了生態(tài)系統(tǒng)的自我恢復能力，依靠自身恢復是一個緩慢的過程，最少需要50～100a[2]。國內外有不少關于煤礦區(qū)土地復墾和生態(tài)重建的研究，植被重建被認為是修復礦區(qū)生態(tài)破壞與環(huán)境污染最經濟有效的途徑，也是目前國內外主要采取的措施[3?4]。然而煤矸石風化物顆粒粗、結構差，水分和養(yǎng)分含量少，微生物區(qū)系稀少且活性低及重金屬含量高等嚴重制約了煤矸石山植被的恢復[5]。

土壤微生物具有豐度高、種類多、代謝快等特征，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，在調節(jié)養(yǎng)分循環(huán)和穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)等方面發(fā)揮著十分重要的作用[6]。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AM真菌）是一種廣泛分布于陸地生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生物，可以與大多數(shù)陸生植物共生[7]。AM真菌一方面侵染植物根系，另一方面可以延伸到土壤中，其龐大的根外菌絲網絡極大地擴展了根系范圍，吸收土壤中水分以及氮、磷等礦質元素，改善宿主植物水分和營養(yǎng)狀況，促進植物生長[8]，AM真菌還通過對土壤重金屬的固定、隔離以及增加植物耐受性等方式提高植物抵抗重金屬的能力[9]。AM真菌與植物這種互惠互利的共生關系，有利于克服煤矸石山生態(tài)重建中養(yǎng)分含量低、干旱、重金屬含量高等逆境的潛力[10?11]。另外，AM真菌還可以通過分泌球囊霉素相關蛋白，以及菌絲的物理纏繞等方式促進土壤團聚體的形成，改良土壤結構[12]，因此，在生態(tài)系統(tǒng)恢復初期，菌根植物常作為先鋒植物在這些極端環(huán)境中優(yōu)先生存下來。牛天心[13]對補連塔煤礦采陷區(qū)植物進行研究發(fā)現(xiàn)，在所調查的20種植物中，菌根植物共有16種，且共分離鑒定出AM真菌13種。近年來，人工擴繁的AM真菌菌劑也常被應用到退化生態(tài)系統(tǒng)和污染環(huán)境的生態(tài)恢復中，畢銀麗等[1]在煤矸石山復墾區(qū)接種AM真菌13個月后發(fā)現(xiàn)，煤矸石山植被的成活率提高了15%。這些研究表明AM真菌對煤礦區(qū)生態(tài)環(huán)境恢復起重要的推動作用。

在生態(tài)系統(tǒng)中，植物群落演替、人類活動和環(huán)境條件變化會引發(fā)AMF真菌多樣性和群落組成的時空變化[14?16]。植物、土壤和AM真菌及其相互關系在受干擾土壤生態(tài)系統(tǒng)功能恢復過程中起著重要作用[17]，以往關于采煤區(qū)生態(tài)恢復的研究主要集中在植物群落的演替變化和重建過程中，而穩(wěn)定的AM真菌群落組成對于提高生態(tài)系統(tǒng)生產力、維持生態(tài)平衡同樣至關重要[18]，其受植被、土壤、人為干擾、氣候和地理距離等生物和非生物因子的影響[19]。山西省煤礦資源十分豐富，是聞名全國的“煤都”。但在過去長期的開采過程中，礦區(qū)生態(tài)被嚴重破壞，水土流失嚴重。近些年，對一些煤矸石山采取了人工修復和治理，植被生長和覆蓋狀況得到了很大改善。李俠等[20]研究發(fā)現(xiàn)短期人工修復（10～20a）的煤矸石山盡管植被種類遠少于長期自然恢復（50～60a）的煤矸石山，但植被蓋度兩者無顯著差異，甚至植被密度還高于長期自然恢復的煤矸石山，而不同地點的煤矸石山即使恢復年限較一致，但植物群落差異卻較大。然而關于不同地點和恢復方式煤矸石山土壤中AM真菌群落的研究卻少有報道。探明這些煤矸石山土壤中AM真菌群落組成狀況及土壤驅動因子可為有效利用植物和AM菌種資源、合理制定煤矸石山修復方案提供重要的理論和實踐指導意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地大同市晉華宮礦位于山西省北部，地處N40°6’, E113°8’；忻州窯礦位于山西省北中部，地處N38°25’, E112°43’；兩個礦均屬溫帶大陸性半干旱季風氣候，年均降水量約為400mm。晉華宮礦的煤矸石山分別為人工復墾和自然恢復樣地，忻州窯礦的煤矸石山為自然恢復樣地。晉華宮人工復墾煤矸石山采用覆土約20cm、人工種植紫苜蓿進行修復，取樣時主要植被為中華草沙蠶、豬毛菜和紫苜蓿；晉華宮自然恢復煤矸石山未進行人為修復，取樣時主要植被為中華草沙蠶、鐵桿蒿和鵝絨藤；忻州窯自然恢復煤矸石山也未進行人為修復，取樣時主要植物為菊葉香藜、獨行菜和牛筋草[20]。

1.2 土壤樣品采集

2016年6月，從大同市晉華宮人工復墾煤矸石山（排矸年齡10～20a，用JH-AR表示）、晉華宮自然恢復煤矸石山（排矸年齡50～60a，用JH-NR表示）、忻州窯自然恢復煤矸石山（排矸年齡50～60a，用XY-NR表示）三座煤矸石山上各選取三個樣方。去除樣方表面的雜草植被（約2cm的表層土），按五點法采集5個15cm×15cm×10cm的次樣方，并將5個次樣方的土壤充分混勻作為一個待測土壤樣品。每個待測土壤樣品分裝成兩部分，一部分新鮮土壤放置于?80℃保存，用于土壤DNA的提??；余下土壤樣品自然風干后用于AM真菌孢子密度和土壤理化性質的測定。

1.3 項目測定

1.3.1 土壤AM真菌孢子密度

取風干土壤樣品10g于2L的燒杯中，加水充分攪拌1min，使孢子脫落。土壤懸濁液雙層篩（上篩20目，下篩400目）過濾，將400目下篩中的物質水洗轉入50mL的大離心管4000r離心3min。倒掉上清液，加入60%的蔗糖溶液，再次離心（3000r，2min），將上清液倒入400目的篩子用水清洗，然后轉至培養(yǎng)皿中在顯微鏡下觀察并分格計數(shù)。

1.3.2 土壤理化性質測定

分別對風干土壤樣品中速效磷、有機碳、全氮、pH值、EC等指標進行測定[21]。

1.4 土壤AM真菌多樣性測定

1.4.1 土壤DNA的提取

取0.5g新鮮土壤樣品采用E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.) 試劑盒提取土壤基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量，并用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度。

1.4.2 PCR擴增與產物的純化

使用AML1F(5’-ATCAACTTTCGATGGT-AGGATA GA-3’)-AML2R(5’-GAACCCAAACACTT- TGGTTTCC-3’) 引物進行第一輪PCR，擴增長度大約為795bp 的18S rRNA片段[22]。PCR反應體系按照TransStart?Fastpfu DNA Polymerase (AP221-02) 的說明書配置，每個樣品重復3次。每個反應體系中加入1μL DNA模板，輕敲混勻后放入PCR儀（ABI GeneAmp? 9700）中，反應條件設置為，95℃初始變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共進行32個循環(huán)，然后72℃保溫10min。第一次PCR產物稀釋10倍作為第二次PCR反應的模板。第二次 PCR 使用的引物是加入帶有barcode的AMV4.5NF(5’-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3’)-AMDGR(5’-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3’)，擴增長度約為300bp的18S rRNA片段[23]，體系和反應條件與第一次PCR反應一致（循環(huán)數(shù)為30）。將同一樣品的PCR產物混勻后用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收，并用Tris-HCl進行洗脫；之后用2%瓊脂糖電泳檢測。

1.4.3 MiSeq高通量測序

參照電泳的初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor? -ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，隨后根據(jù)每個樣本的測序量要求，進行相應比例混合。將相應比例混合的PCR產物交予相關生物公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.4.4 序列處理

Illumina MiSeq高通量測序測得的原始數(shù)據(jù)使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）進行篩選和優(yōu)化序列。僅包含有完整的barcode和正向引物、質量得分≥25以及長度在200～300bp（不包括條形碼和引物序列）的序列。使用Usearch v7.1優(yōu)化序列，修剪后的序列依據(jù)97%的相似度劃分OTUs。刪除序列數(shù)低于5的OTUs，從每個OTUs中選擇數(shù)量最多的序列作為代表序列。之后將物種代表序列與Maarj AM數(shù)據(jù)庫（www.maarjam.botany. ut.ee）進行比對注釋。原始數(shù)據(jù)提交到國際基因庫GenBank保存，序列號為PRJNA818836。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析檢驗不同煤矸石山土壤AM真菌多樣性指數(shù)、屬級分類單位的相對豐度和孢子密度的差異，采用Duncan多重比較檢驗不同煤矸石山差異的顯著性水平。采用皮爾森（Pearson）相關分析檢驗AM真菌多樣性指數(shù)、群落各屬、孢子密度和土壤理化性質兩兩之間的相關性。以上分析在SPSS（22.0）中進行。

利用R（4.0.2），使用多維尺度分析（Nonmetric multidimensional scaling, NMDS）基于Bray-Curtis 距離算法分析不同煤矸石山AM真菌群落組成的差異，采用置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance）檢驗不同煤矸石山土壤AM真菌群落組成的差異性。

2 結果與分析

2.1 不同地點和復墾方式煤矸石山土壤AM真菌多樣性指數(shù)對比

由表1可知，AM真菌測序的覆蓋率均達到了99.99%以上，表明測序結果能夠很好地反映土壤AM真菌群落組成的真實情況。晉華宮人工復墾煤矸石山土壤AM真菌Chao指數(shù)和香農?威納指數(shù)顯著高于忻州窯自然恢復煤矸石山，兩者與晉華宮自然恢復煤矸石山差異不顯著；三座煤矸石山間土壤AM真菌覆蓋率、Ace指數(shù)以及Simpson指數(shù)差異均不顯著。

2.2 不同地點和復墾方式煤矸石山土壤AM真菌Illumina MiSeq序列對比

由圖1可知，三座煤矸石山土壤樣本中AM真菌的OTUs稀釋曲線都達到了平臺區(qū)，表明試驗的測序量足以覆蓋每個樣方的AM真菌群落。在晉華宮人工復墾煤矸石山的三個樣方（JH-AR1、JH-AR2、JH-AR3）中分別測得31659條、33913條和40388條屬于AM真菌的有效序列，在97%的相似度下分別劃分為39、38和28個OTUs；在晉華宮自然恢復煤矸石山的三個樣方（JH-NR1、JH-NR2、JH-NR3）中分別測得34567條、39217條、43967條屬于AM真菌的有效序列，在 97%的相似度下分別劃分為40、31和13個OTUs；在忻州窯自然恢復煤矸石山的三個樣方（XY-NR1、XY-NR2、XY-NR3）中分別測得35130條、38728條和40661條屬于AM真菌的有效序列，在97%的相似度下分別劃分為11、19和12個OTUs。

試驗在97%序列相似度下共得到67個AM真菌OTUs，其中晉華宮人工復墾和自然恢復煤矸石山分別有52和50個AM真菌OTUs，忻州窯自然恢復煤矸石山有23個OTUs。三座煤矸石山共有OTUs為15個；晉華宮人工復墾和自然恢復兩座煤矸石山共有的OTUs為38個，分別占兩座煤矸石山總OTUs的73%和76%；晉華宮自然恢復煤矸石山和忻州窯自然恢復煤矸石山共有的OTUs為19個，晉華宮人工復墾煤矸石山和忻州窯自然恢復煤矸石山共有的OTUs為16個。晉華宮人工復墾煤矸石山、晉華宮自然恢復煤矸石山和忻州窯自然恢復煤矸石山特有的OTUs分別為11、10和3個（圖2）。

表1 不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌群落多樣性指數(shù)的比較

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準誤(n=3)。同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示三座煤矸石山之間差異顯著（P<0.05）。JH-AR指晉華宮人工復墾煤矸石山，JH-NR指晉華宮自然恢復煤矸石山，XY-NR指忻州窯自然恢復煤矸石山。下同。

Note: Values are means ± stand error (n=3). Different lowercases in the same column represent significance among three different coal gangue hills according Duncan test following significant ANOVA (P<0.05). JH-AR is artificial restoration coal gangue hill of Jinhua palace in Datong city; JH-NR is natural restoration coal gangue hill of Jinhua palace in Datong city; XY-NR is natural restoration coal gangue hill of Xinzhou kiln. The same as below.

圖1 不同煤矸石山土壤各平行樣本中叢枝菌根真菌OTUs稀釋曲線

注：JH-AR1、JH-AR2、JH-AR3分別為晉華宮人工復墾煤矸石山的三個平行樣本；JH-NR1、JH-NR2、JH-NR3分別為晉華宮自然恢復煤矸石山的三個平行樣本；XY-NR1、XY-NR2、XY-NR3分別為忻州窯自然恢復煤矸石山的三個平行樣本。

Note: JH-AR1, JH-AR2, JH-AR3 are three parallel samples of artificial restoration coal gangue hill of Jinhua palace; JH-NR1, JH-NR2, JH-NR3 are three parallel samples of natural restoration coal gangue hill of Jinhua palace; JH-NR1, JH-NR2, JH-NR3 are three parallel samples of natural restoration coal gangue hill of Xinzhou kiln.

2.3 不同地點和復墾方式煤矸石山土壤AM真菌群落組成對比

試驗共發(fā)現(xiàn)3個鑒定到屬的AM真菌屬級分類單元，包括球囊霉屬（）、多樣孢囊霉屬（）和類球囊霉屬（），不能分類到已知屬名的OTUs被定義為Unknow。其中球囊霉屬（）在三座煤矸石山中均為最優(yōu)勢屬。晉華宮人工復墾煤矸石山土壤中的球囊霉屬（）相對豐度顯著高于忻州窯自然恢復煤矸石山，而晉華宮自然恢復煤矸石山土壤中的球囊霉屬（）相對豐度與前兩者無顯著差異；多樣孢囊霉屬（）和類球囊霉屬（）僅在晉華宮自然恢復煤矸石山土壤中鑒定到（表2）。

圖2 不同地點煤矸石山土壤樣本中AM真菌OTUs韋恩圖

2.4 不同地點和復墾方式煤矸石山土壤AM真菌孢子密度對比

孢子作為真菌的一種重要繁殖體，其在土壤中的豐度常用孢子密度來反映，本試驗中AM真菌孢子密度用每10g土壤中含有的孢子個數(shù)來表示。不同地點煤矸石山土壤樣本中的AM真菌孢子密度差異顯著，晉華宮人工復墾煤矸石山土壤的AM真菌孢子密度顯著高于忻州窯自然恢復煤矸石山，晉華宮自然恢復煤矸石山土壤AM真菌孢子密度與其余兩座煤矸石山差異不顯著（圖3）。

表2 不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌各屬相對豐度

圖3 不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌孢子密度

2.5 不同地點和復墾方式煤矸石山土壤環(huán)境因子影響對比

2.5.1 影響土壤AM真菌群落組成差異的因子分析

AM真菌群落的多維尺度分析（NMDS）和多元置換方差分析（PERMANOVA）結果表明，晉華宮兩種恢復方式煤矸石山之間土壤AM真菌群落沒有明顯分開，差異也不顯著；而兩者與忻州窯煤矸石山之間土壤AM真菌群落明顯分開，差異達到顯著水平（R2=0.23，P=0.04）。土壤全氮（R2=0.63，P=0.045）、土壤有機碳（R2=0.75，P=0.009）和AM真菌孢子密度（R2=0.75，P=0.016）與煤矸石AM真菌群落組成顯著相關（圖4）。

圖4 不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌群落NMDS分布

注：橢圓代表不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌群落95%置信區(qū)間水平下的變異。TN表示全氮，TOC表示有機碳，Spores表示AM真菌孢子密度。

Note：Ellipses in the plots represent 95% confidence intervals around AM fungi community in different coal gangue hills.TN represents total nitrogen, TOC represents total organic carbon, Spores represent spore density.

2.5.2 影響AM真菌多樣性、各屬水平的土壤理化性質分析

煤矸石山土壤中AM真菌多樣性、各屬水平與土壤理化性質各指標之間的皮爾森（Pearson）相關性分析結果如表3所示。由表可知，AM真菌多樣性指數(shù)（覆蓋率、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和香農?威納指數(shù)）與土壤速效磷（僅Chao指數(shù)和香農?威納指數(shù)）和AM真菌孢子密度呈顯著正相關關系，與土壤全氮（僅覆蓋率和香農?威納指數(shù)）、有機碳（Ace指數(shù)除外）呈顯著負相關關系。球囊霉屬（）與土壤速效磷和AM真菌孢子密度均呈顯著正相關關系，多樣孢囊霉屬（）和類球囊霉屬（）與土壤理化性質及AM真菌群落多樣性指數(shù)之間均無顯著相關關系。

表3 不同煤矸石山土壤AM真菌多樣性指數(shù)、各屬水平及土壤理化性質指標之間相關性

注：*表示P≤0.05，**表示P≤0.01。

Note:*is P≤0.05，**is P≤0.01.

3 結論與討論

3.1 討論

無論采用傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法還是高通量測序技術研究都發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬（）在大多數(shù)生態(tài)環(huán)境中其出現(xiàn)頻率和相對豐度均為最高的AM真菌類群，為優(yōu)勢屬[24?26]。本研究采用高通量測序技術，在調查的所有煤矸石山中，發(fā)現(xiàn)球囊霉屬（）相對豐度最高，為優(yōu)勢屬。最近對晉華宮煤矸石山不同植物根際土壤AM真菌的研究也發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬（）占據(jù)主導地位[26]。這些結果表明球囊霉屬（）具有廣泛的環(huán)境適應性，這可能與球囊霉屬（）有較強的養(yǎng)分吸收能力、繁殖能力及侵染植物的能力有關[27]。

晉華宮人工復墾煤矸石山AM真菌僅鑒定出球囊霉屬（），而自然恢復煤矸石山還鑒定出多樣孢囊霉屬（Diversispora）和類球囊霉屬（Paraglomus），表明人工復墾方式由于修復年限較短，損失了一些稀有AM真菌屬。Ezeokoli等[28]在采煤區(qū)根系和根際土壤中也發(fā)現(xiàn)了這兩個AM真菌屬，其相對豐度也較低，盡管不同復墾年限采煤區(qū)植物根際土壤AM真菌多樣性無顯著差異，而群落組成差異顯著。然而，本研究中晉華宮兩種恢復方式的煤矸石山之間AM真菌多樣性和群落組成均無顯著差異，且共有的AM真菌OTUs達到38個，占比較高，分別達到兩座煤矸石山總OTUs的73%～76%，表明人工復墾10～20a煤矸石山土壤AM真菌群落可達到與自然恢復50～60a煤矸石山較為一致的效果。與本研究結果類似，侯湖平等[29]對徐州市不同復墾年限煤矸石山土壤細菌的研究發(fā)現(xiàn)，與未受煤矸石影響的對照土壤相比，復墾區(qū)土壤在各個分類水平上的細菌數(shù)量均減少，且群落多樣性也降低；而隨著復墾年限的增加，復墾區(qū)與對照土壤的貼近度越來越高。本課題組之前對煤矸石山植物群落的研究也發(fā)現(xiàn)，相比自然恢復50～60a的煤矸石山，盡管人工復墾10～20a煤矸石山植物種類較少，但兩者植物群落差異不顯著[20]。AM真菌是與植物共生的一種真菌，它只能利用宿主植物提供的碳，不能離體培養(yǎng)，其分布極大程度受植被類型的制約。Krüger等[17]在捷克采煤區(qū)的研究顯示，相比非生物因素，AM真菌群落組成主要受植物群落影響。甄莉娜等[26]調查了大同市晉華宮礦煤矸石山區(qū)禾本科、菊科、豆科和藜科植物根際土壤的AM真菌多樣性，發(fā)現(xiàn)禾本科和藜科根際AM真菌OTUs數(shù)量較多，而豆科和菊科根際AM真菌OTUs數(shù)較少；禾本科根際AM真菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)最高，多樣性和豐富度最高。本研究中晉華宮兩種恢復方式煤矸石山優(yōu)勢植物一致，均為禾本科中華草沙蠶，這可能是兩座煤矸石山AM真菌群落差異不顯著的原因。

一個地區(qū)的群落如何裝配及哪些物種可以共存是生態(tài)學的中心問題。AM真菌的物種多樣性及群落組成受多種生物和非生物因子如植被、土壤、人為干擾、氣候和地理距離等的影響[19,30]，但是它們的相對重要性極大地依賴于空間尺度，在不同尺度上，有不同的裝配因子起作用。在較小的尺度上AM真菌群落主要是由植物種類決定，在較大尺度上AM真菌群落組成主要受空間距離、土壤、溫度和植物群落類型等影響[15,31]。對全球1014個植物根部樣品AM真菌空間分布格局的研究表明，空間距離是影響AM真菌群落組成的主要因素[15]。本研究中除晉華宮人工復墾煤矸石山AM真菌群落Chao指數(shù)、香農?威納指數(shù)顯著高于忻州窯自然恢復煤矸石山外，三座煤矸石山其余的AM真菌多樣性指數(shù)間差異不顯著，然而晉華宮兩座煤矸石山與忻州窯自然恢復煤矸石山之間AM真菌群落明顯分開，差異也達到顯著水平，這表明相比AM真菌多樣性，群落組成可能更敏感捕捉到環(huán)境的變化。另外，由于晉華宮自然恢復煤矸石山與忻州窯自然恢復煤矸石山恢復時間基本一致，表明空間距離可能對兩座煤矸石山AM真菌群落組成產生重要影響。Jansa等[32]在瑞士農田土壤中發(fā)現(xiàn)，相比管理方式，土壤因子和空間距離是影響AM真菌群落主要因素，與本研究結果一致?？臻g距離較遠的煤矸石山間由于各種氣候條件等不同，導致其土壤因子、植被類型等有較大差異。之前研究發(fā)現(xiàn)晉華宮煤矸石山優(yōu)勢植物為中華草沙蠶，而忻州窯煤矸石山優(yōu)勢植物為菊葉香藜。另外，本研究發(fā)現(xiàn)土壤全氮、有機碳和AM真菌孢子密度是造成晉華宮和忻州窯兩個地點煤矸石山AM真菌群落組成差異的主要驅動因子。李曉亮在西藏色季拉山研究發(fā)現(xiàn)海拔主要通過影響土壤pH和速效磷從而間接影響AM真菌多樣性和群落組成；在森林、草地和農田土壤中發(fā)現(xiàn)，不同利用方式主要通過影響土壤pH從而影響AM真菌群落[25]，本研究中，空間距離可能通過影響土壤全氮、有機碳和AM真菌孢子密度影響晉華宮和忻州窯兩個地點煤矸石山AM真菌群落組成。

3.2 結論

在調查的所有煤矸石山中，球囊霉屬（）是相對豐度最高的AM真菌類群，為優(yōu)勢屬。晉華宮人工復墾10～20a煤矸石山土壤AM真菌群落可達到與自然恢復50～60a煤矸石山較為一致的效果。晉華宮與忻州窯兩個地點煤矸石山土壤AM真菌群落差異較大，土壤全氮、有機碳含量和AM真菌孢子密度是驅動AM真菌群落組成差異的主要因子。AM真菌作為生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，其與植物、土壤環(huán)境變化息息相關，本研究結果表明AM真菌群落變化有潛力成為反映煤矸石山生態(tài)系統(tǒng)恢復力的一類生物指標。

[1] 畢銀麗,吳王燕,劉銀平.叢枝菌根在煤矸石山土地復墾中的應用[J].生態(tài)學報,2007,27(9):3738-3743.

Bi Y L,Wu W Y,Liu Y P.Application of arbuscular mycorrhizas in land reclamation of coal spoil heaps[J].Acta Ecologica Sinica,2007,27(9):3738-3743.(in Chinese)

[2] 魏遠,顧紅波,薛亮,等.礦山廢棄地土地復墾與生態(tài)恢復研究進展[J].中國水土保持科學,2012,10(2):107-114.

Wei Y,Gu H B,Xue L,et al.Review of studies on reclamation and ecological restoration of abandoned land of mine[J]. Science of Soil and Water Conservation,2012,10(2):107- 114.(in Chinese)

[3] 張成梁.山西陽泉自然煤矸石山生境及植被構建技術研究[D].北京:北京林業(yè)大學,2008.

Zhang C L.The habitat and vegetation constructing for Spontaneous combustion gangue pile in Yangquan city, Shanxi province[D].Beijing:Beijing Forestry University, 2008.(in Chinese)

[4] Püschel D,Rydlová,Sudová R,et al.The potential of mycorrhizal inoculation and organic amendment to increase yields of Galegaorientalis and Helianthus tuberosus in a spoil-bank substrate[J].Journal of Plant Nutrition and Sol Science,2011,174(4):664-672.

[5] Sheoran V,Sheoran A S,Poonia P.Soil reclamation of abandoned mine land by revegetation a review[J]. International Journal of Soil,Sediment and Water,2010, 3(2):1-20.

[6] 岳衡,李閃閃,段雅欣,等.深松耕對寧南山區(qū)馬鈴薯田土壤細菌多樣性的影響[J].中國農業(yè)氣象,2021,42(12): 998-1008.

Yue H,Li S S,Duan Y X,et al.Effect of subsoil plowing on soil bacterial diversity in potato fields in mountainous areas of Southern Ningxia[J].Chinese Journal of Agrometeorology, 2021,42(12):998-1008.(in Chinese)

[7] Lanfranco L,Bonfante P,Genre A.The mutualistic interaction between plants and arbuscular mycorrhizal fungi[J]. Microbiology Spectrum,2016,4(6).

[8] Simard S W,Beiler K J,Bingham M A,et al.Mycorrhizal networks:mechanisms,ecology and modelling[J].Fungal Biology Reviews,2012, 26(1):39-60.

[9] 羅巧玉,王曉娟,林雙雙,等.AM真菌對重金屬污染土壤生物修復的應用與機理[J].生態(tài)學報,2013,33(13):3898- 3906．

Luo Q Y,Wang X J,Lin S S,et al.Mechanism and application of bioremediation to heavy metal polluted soil using arbuscular mycorrhizal fungi[J].Acta Ecologica Sinica,2013,33(13):3898-3906．

[10] 畢銀麗.叢枝菌根真菌在煤礦區(qū)沉陷地生態(tài)修復應用研究進展[J].菌物學報,2017,36(7):800-806.

Bi Y L.Research advance of application of arbuscular mycorrhizal fungi to ecological remediation in subsided land of coal mining areas[J].Mycosystema,2017,36(7): 800-806.(in Chinese)

[11] Omirou M,Ioannides M,Ehaliotis C.Mycorrhizal inoculation affects arbuscular mycorrhizal diversity in watermelon roots,but leads to improved colonization and plant response under water stress only[J].Applied Soil Ecology,2013, 63(1):112-119.

[12] Rillig M C,Mummey D L.Mycorrhizas and soil structure[J]. New Phytologist,2006,171(1):41-53.

[13] 牛天心.補連塔煤礦采陷區(qū)叢枝菌根真菌種類分布及土壤因子的研究[D].呼和浩特:內蒙古大學,2015.

Niu T X.The study on the distribution of AMF species and soil factors in mining subsidence area of bulianta coal mine[D].Hohhot:Inner Mongolia University,2015.(in Chinese)

[14] Cui X,Hu J,Wang J,et al.Reclamation negatively influences arbuscular mycorrhizal fungal community structure and diversity in coastal saline-alkaline land in Eastern China as revealed by Illumina sequencing[J].Applied Soil Ecology, 2016,98:140-149.

[15] Davison J,Moora M,?pik M,et al.Global assessment of arbuscular mycorrhizal fungus diversity reveals very low endemism[J].Science,2015,349(6251):970-973.

[16] Roy J,Reichel R,Bruggemann N,et al.Succession of arbuscular mycorrhizal fungi along a 52-year agricultural recultivation chronosequence[J].FEMS Microbiology Ecology, 2017,93,fix102.

[17] Krüger C,Kohout P,Janou?ková M,et al.Plant communities rather than soil properties structure arbuscular mycorrhizal fungal communities along primary succession on a mine spoil[J].Frontiers in Microbiology,2017(8):719.

[18] van der Heijden M G A,Klironomos J N,Ursic M,et al.Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity, ecosystem variability and productivity[J].Nature, 1998,396 (6706):69-72.

[19] 向丹,徐天樂,李歡,等.叢枝菌根真菌的生態(tài)分布及其影響因子研究進展[J].生態(tài)學報,2017,37(11):3597-3606.

Xiang D,Xu T L,Li H,et al.Ecological distribution of arbuscular mycorrhizal fungi and the influencing factors[J]. Acta Ecologica Sinica,2017,37(11):3597-3606.(in Chinese)

[20] 李俠,邵洋,王潤梅,等.不同恢復方式煤矸石山植物群落差異及影響因子[J].土壤通報,2018,49(6):1370-1376.

Li X,Shao Y,Wang R M,et al.Plant community diversity and its impact factors in coal gangue hill under different restoration patterns[J].Chinese Journal of Soil Science, 2018,49(6):1370-1376.(in Chinese)

[21] 鮑士旦.土壤農化分析[M].北京:中國農業(yè)出版社,2000.

Bao S D.Soil agro-chemistrical analysis[M].Beijing:China Agriculture Press,2000.(in Chinese)

[22] Lee J,Lee S,Young J P W.Improved PCR primers for the detection and identification of arbuscular mycorrhizal fungi[J].FEMS Microbiology Ecology,2008,65(2):339-349.

[23] Sato K,Suyama Y,Saito M,et al.A new primer for discrimination of arbuscular mycorrhizal fungi with polymerase chain reaction-denature gradient gel electrophoresis[J]. Grassland Science,2005,51(2):179-181.

[24] 王發(fā)園,劉潤進,林先貴,等.幾種生態(tài)環(huán)境中AM真菌多樣性比較研究[J].生態(tài)學報,2003,23(12):2666-2671.

Wang F Y,Liu R J,Lin X G,et al.Comparison of diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in different ecological environments[J].Acta Ecologica Sinica,2003,23(12):2666- 2671.(in Chinese)

[25] 李曉亮.藏東南地區(qū)海拔和土地利用方式對叢枝菌根真菌多樣性和群落結構的影響[D].北京:中國農業(yè)大學,2015.

Li X L.Influence of elevation and land use types on diversity and community composition of arbuscular mycorrhizal fungi in southeast Tibet[D].Beijing:China Agricultural University,2015.(in Chinese)

[26] 甄莉娜,劉麗珍,牛艷,等.煤矸石山不同植物根際土壤AM真菌群落多樣性分析[J].草地學報,2022,30(8):2009- 2018.

Zhen L N,Liu L Z,Niu Y,et al.Analysis of AM Fungi Community diversity in rhizosphere soil of different vegetation in Coal Gangue Mountain[J].Acta Agrestia Sinica, 2022,30(8):2009-2018.(in Chinese)

[27] Hassan S D,Boon E,St-Arnaud M.Molecular biodiversity of arbuscular mycorrhizal fungi in trace metal-polluted soils[J].Molecular Ecology,2011,16: 3469-83.

[28] Ezeokoli O T,Mashigo S K,Maboeta M S,et al.Arbuscular mycorrhizal fungal community differentiation along a post-coal mining reclamation chronosequence in South Africa:a potential indicator of ecosystem recovery[J]. Applied Soil Ecology,2020,147:103429.

[29] 侯湖平,王琛,李金融,等.煤矸石充填不同復墾年限土壤細菌群落結構及其酶活性[J].中國環(huán)境科學,2017,37(11): 4230-4240.

Hou H P,Wang C,Li J R,et al.Variation of bacterial community structure and enzyme activities in reclaimed soil filled with coal gangues along a relamation chronosequence[J].China Environmental Science,2017,37 (11):4230-4240.(in Chinese)

[30] 楊海水,熊艷琴,王琪,等.AM真菌物種多樣性:生態(tài)功能、影響因素及維持機制[J].生態(tài)學報,2016,36(10):2826- 2832.

Yang H S,Xiong Y Q,Wang Q,et al.Arbuscular mycorrhizal fungal species diversity:ecological functioning, determinants and assembling mechanisms[J].Acta Ecologica Sinica, 2016,36(10):2826-2832.(in Chinese)

[31] Valyi K,Mardhiah U,Rillig M C,et al.Community assembly and coexistence in communities of arbuscular mycorrhizal fungi[J].The ISME Journal,2016,10(10):2341-2351.

[32] Jansa J,Erb A,Oberholzer H R,et al.Soil and geography are more important determinants of indigenous arbuscular mycorrhizal communities than management practices in Swiss agricultural soils[J].Molecular Ecology,2014,23(8): 2118-2135.

Community Response of Arbuscular Mycorrhizal Fungi to Restoration Managements and Sites in Coal Gangue Hills

LI Xia1, YE Cheng-cheng2, ZHANG Yong-fang1, ZHANG Xun1, HUO Li-juan3,SU Shi-ming4

（1.College of Agronomy and Life Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, China; 2.Wenzhou Good Agri-Products Development Service Center, Wenzhou 325000; 3.School of Environmental Science and Engineering, Taiyuan University of Science andTechnology, Taiyuan 030024; 4.Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Environment, Ministry of Agriculture and Rural, Beijing 100081)

Illumina MiSeq high-throughput sequencing approach was applied to investigate arbuscular mycorrhizal fungi (AM fungi) community and relevant soil factors were analyzed in coal gangue hills with different restoration patterns (i.e., artificial restoration and natural restoration coal gangue hill of Jinhua palace in Datong City; natural restoration coal gangue hill of Xinzhou kiln). The results showed: α-diversity (Chao index and Shannon-Weiner index) of AM fungi community differed significantly between artificial restoration coal gangue hill of Jinhua palace and natural restoration coal gangue hill of Xinzhou kiln, but comparable α-diversity was observed between artificial restoration and natural restoration coal gangue hill of Jinhua palace. A total of 67 AM fungal OTUs assigned to 3 genus were recovered withbeing the predominant genus in all three coal gangue hills, whileandpopulations were exclusive tonatural restoration coal gangue hill of Jinhua palace in Datong city. Integrated the permutational multivariate analysis and nonmetric multidimensional scaling analysis suggested that AM fungi community were similar between the two restorations of Jinhua palace coal gangue hill, while the community significantly differed between coal gangue hill of Jinhua palace and Xinzhou kiln. The AM fungal community appeared to significantly correlate with soil total nitrogen, soil organic matter and AM fungi spore density. In conclusion, artificial restoration for 10-20 years can exert a comparable effect on AM fungal community as natural restoration 50-60 years in coal gangue hill of Jinhua palace. AM fungal community of the two locations showed great variance, and soil total nitrogen, soil organic matter and soil AM fungi spore density were the main driving factors.

Coal gangue hill; Arbuscular mycorrhizal fungi community;; Illumina MiSeq high-throughput sequencing

10.3969/j.issn.1000-6362.2023.04.003

李俠,葉誠誠,張永芳,等.不同地點和復墾方式煤矸石山土壤中叢枝菌根真菌群落變化[J].中國農業(yè)氣象,2023,44(4):285-294

2022?05?17

國家自然科學基金（41807130）；山西省應用基礎研究計劃項目（201901D111306）；大同市平城區(qū)重點研發(fā)計劃項目（202003）；大同市重點研發(fā)項目（2020044）

葉誠誠，農藝師，主要從事農產品加工與質量安全研究，E-mail：chchye@cau.edu.cn

李俠，E-mail：lixia810504@163.com