尾吊模擬失重對(duì)小鼠過敏性哮喘的影響及其機(jī)制研究

甄 珍 宋錦蘋 李悠悠 杜銳凱 凌樹寬 胡利明* 李英賢*

(1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部, 北京 100124;2.中國航天員科研訓(xùn)練中心航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100094)

1 引言

航天飛行中,由于免疫功能的變化給航天員的健康帶來一系列風(fēng)險(xiǎn)[1],如發(fā)生罕見性感染,潛伏病毒激活[2]和過敏性疾病等。在長期飛行的深空探測任務(wù)中,若免疫系統(tǒng)失調(diào)狀況持續(xù)存在,極有可能會(huì)增加乘組人員的不良臨床風(fēng)險(xiǎn),對(duì)航天任務(wù)的順利實(shí)施造成巨大威脅。觀察空間飛行對(duì)免疫功能的影響及其與疾病發(fā)生之間的相關(guān)性,對(duì)制定和采取相應(yīng)措施保障航天員健康至關(guān)重要?？臻g飛行條件有限,因此常采用地面模擬失重模型進(jìn)行相關(guān)研究[3]。小鼠尾吊是常用的地面模擬失重動(dòng)物模型[4-5],由于其后肢模擬了空間飛行中的去負(fù)荷,整體模擬了血液的頭向分布、應(yīng)激等,因此能較好地模擬失重條件下的骨質(zhì)丟失、肌肉萎縮、免疫系統(tǒng)和心血管等效應(yīng)。

過敏性哮喘是一種過敏性疾病的主要模型[6],它是一種由于過敏源刺激發(fā)生的由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥,在易感者中此種炎癥可引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和咳嗽等癥狀。目前很少有關(guān)于尾吊模擬失重對(duì)過敏性疾病發(fā)生程度影響的研究。

本文旨在研究尾吊模擬失重對(duì)小鼠免疫細(xì)胞及其亞群和過敏性哮喘的影響,并通過肺組織學(xué)、肺炎性細(xì)胞滲出、脾細(xì)胞及Th 細(xì)胞分布闡明尾吊模擬失重所致的免疫失衡在過敏性哮喘中的作用機(jī)制。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選擇6～8 周齡、體重18 ～22 g 的BALB/c 雌性小鼠28 只,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證SCXK(京2021-0006)。飼養(yǎng)于中國航天員科研訓(xùn)練中心SPF 級(jí)動(dòng)物房,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為4 組,每組7 只小鼠。A 組:正常對(duì)照組(Ctrl);B 組:單純OVA 組(Ovalbumin,卵清蛋白);C 組:單純尾吊組(Hindlimb Unloading, HU,后肢去負(fù)荷);D 組:尾吊+OVA 組(HU+OVA)。

2.2 試劑與儀器

主要試劑:OVA, 佛波醇肉豆蔻酸酯(Phorbol Myristate Actetate,PMA), 離子霉素, 布雷菲德菌素A (Brefeldin-A, BFA) 購自Sigma 公司,紅細(xì)胞裂解液購自北京索來寶科技有限公司,CD4-PerCP-cy5.5, 干擾素(IFN)-γ-FITC, 白細(xì)胞介素(IL)4 -PE, IL17-APC, CD4-FITC, CD25-APC,Foxp3-PerCP-cy5.5 抗體, Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子染色套裝(Foxp3/ Transcription Factor Staining Buffer Set)購自eBioscience 公司。

主要儀器:BD FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀,Nikon ECLIPSE TS100 倒置顯微鏡,Nikon ECLIPSE Ni 正置顯微鏡,Eppendorf 5810R 離心機(jī)。

2.3 小鼠過敏性哮喘模型的誘導(dǎo)

小鼠用OVA 加佐劑氫氧化鋁造模,造模周期28 d,在第1 天用20 μg OVA 混懸液(含2 mg 氫氧化鋁)腹腔注射致敏,在第7、14 天再次用20 μg OVA 混懸液(含2 mg 氫氧化鋁)腹腔注射加強(qiáng),在第21 ～28 天期間,每天用40 μg OVA 混懸液滴鼻刺激,對(duì)照組用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline, PBS)代替OVA 混懸液進(jìn)行同樣處理,觀察小鼠外觀、精神和呼吸情況。第29 天處死小鼠。

2.4 小鼠尾吊模擬失重

在過敏性哮喘造模第15 ～28 天,小鼠頭低位尾部懸吊,保持軀干與地面夾角為30°,共尾吊14 d。

尾吊步驟如下:將醫(yī)用膠布剪成條狀,兩端粘貼于小鼠尾部兩側(cè),形成一個(gè)可通過掛鉤的環(huán)狀結(jié)構(gòu),約0.5 cm 左右,再用醫(yī)用膠布纏繞固定,將之固定于小鼠尾部中間靠后位置,以防止醫(yī)用膠布脫落。將鐵鏈上的鉤子穿過醫(yī)用膠布環(huán),完成后將鐵鏈的末端懸掛在尾懸吊裝置的轉(zhuǎn)輪上,并且視小鼠軀干與水平面的角度(保證頭低位30°尾懸吊)來調(diào)整鐵鏈的長短,每天定時(shí)檢查懸掛情況,隨時(shí)調(diào)整保持角度不變。小鼠尾吊模擬失重實(shí)驗(yàn)圖見圖1。

圖1 小鼠尾吊模擬失重實(shí)驗(yàn)圖Fig.1 Experimental diagram of tail-suspended mouse

2.5 小鼠肺部灌洗與肺組織切片染色

頸椎脫臼處死小鼠,小心剪開胸部,結(jié)扎左側(cè)支氣管,0.5 mL 磷酸鹽緩沖液PBS 灌洗右側(cè)肺組織,共3 次,合并3 次灌洗液,取灌洗液細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。取未灌洗側(cè)肺組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片成3 μm 厚,采用蘇木精和伊紅(Hematoxylin-eosin Staining, HE)染色,顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤等組織學(xué)變化。

2.6 小鼠脾細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞亞群檢測

取出脾臟,研磨制備單細(xì)胞懸液,經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后,計(jì)數(shù)脾細(xì)胞。取1×107個(gè)細(xì)胞用50 ng/mL PMA+ 1 μg/mL 離子霉素混合液激活4 h, 同時(shí)5 μg/mL BFA 阻斷, 經(jīng)表面分子CD4-PerCP-cy5.5 抗體(后續(xù)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色)或CD4-FITC, CD25-APC 抗體(后續(xù)核內(nèi)Foxp3染色)染色后,經(jīng)Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子染色套裝破膜破核,胞內(nèi)分別進(jìn)行IFNγ-FITC、IL4-PE 和IL17-APC 及核內(nèi)Foxp3-PerCP-cy5.5 抗體染色,熒光抗體用量均為5 μL。其中,CD4+細(xì)胞為Th 細(xì)胞群,CD4+IFN γ+細(xì)胞群為Th1 細(xì)胞亞群,CD4+IL4+細(xì)胞群為Th2 細(xì)胞亞群,CD4+IL17+細(xì)胞群為Th17 細(xì)胞亞群,CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞群為Treg細(xì)胞亞群。流式細(xì)胞儀檢測Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用軟件GraphPad Prism 9.0.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用雙因素方差分析,數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(ˉ±sˉx)表示,P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 整體狀況變化

在用OVA 混懸液滴鼻刺激后,單純OVA 組小鼠表現(xiàn)體形消瘦、毛發(fā)豎起、煩躁不安、呼吸困難、擦鼻,尾吊+OVA 組小鼠同樣有上述表現(xiàn),癥狀顯著較單純OVA 組減輕。

正常對(duì)照組和單純尾吊組小鼠均精神正常、無消瘦、毛發(fā)無豎起、無呼吸困難和擦鼻。

3.2 肺組織學(xué)變化

圖2 為肺組織切片HE 染色圖,與正常對(duì)照組相比,單純尾吊組小鼠肺組織學(xué)無明顯炎性細(xì)胞滲出和肺泡壁增厚現(xiàn)象;而OVA 誘導(dǎo)小鼠肺組織炎性細(xì)胞大量增加,以支氣管周圍更為顯著。肺泡壁增厚,細(xì)胞間質(zhì)滲出增加,尾吊條件下OVA 誘導(dǎo)小鼠與OVA 相比,肺組織特別是支氣管周圍炎性細(xì)胞明顯減少,肺泡壁變薄,細(xì)胞間質(zhì)滲出減少。

圖2 代表性肺組織切片HE 染色圖(200×,比例尺=50 μm)Fig.2 Representative histological section of lung stained with HE(200×,scale bar=50 μm)

3.3 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)變化

支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)的變化如圖3 所示。與正常對(duì)照組相比,單純尾吊組小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)量無顯著性變化(P＞0.05)。OVA 誘導(dǎo)小鼠較對(duì)照顯著增加(P＜0.001),與之相比,尾吊條件下OVA 誘導(dǎo)小鼠的肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)量大為下降,且差異具有顯著性(P＜0.001)。

圖3 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)的變化Fig.3 Changes of total cell numbers in BALF

3.4 脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群的變化

脾細(xì)胞總數(shù)與Th 細(xì)胞亞群分布結(jié)果如圖4所示。與正常對(duì)照組相比,單純尾吊組小鼠脾細(xì)胞總數(shù)和Th 細(xì)胞各亞群分布無顯著變化。而OVA 誘導(dǎo)小鼠的脾細(xì)胞總數(shù)顯著升高,與正常對(duì)照組和尾吊條件下OVA 誘導(dǎo)組均有顯著性差異(P＜0.001,P＜0.01)。Th1 細(xì)胞亞群百分比較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05),Th2 和Th17 細(xì)胞亞群百分比較對(duì)照有升高趨勢(shì)。尾吊條件下OVA 誘導(dǎo)小鼠的脾細(xì)胞總數(shù)、Th1、Th2 和Th17 亞群百分比較單純OVA 組均下降。OVA 誘導(dǎo)小鼠Treg 細(xì)胞亞群百分比明顯升高,尾吊條件下OVA 誘導(dǎo)小鼠的Treg 百分比較單純OVA 組升高幅度更大,且差異具有顯著性(P＜0.05)。

圖4 脾細(xì)胞總數(shù)與Th 細(xì)胞亞群分布的變化Fig.4 Changes in the total numbers of splenocyte and the distribution of Th cell subsets

4 討論

大量研究表明,航天飛行可導(dǎo)致航天員免疫功能顯著變化[1,7-9],表現(xiàn)為白細(xì)胞分布及細(xì)胞因子分泌改變,NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞功能下降。正常的免疫系統(tǒng)是機(jī)體健康的保障,免疫系統(tǒng)的改變會(huì)增加疾病的易感性。已有研究報(bào)導(dǎo)航天飛行中航天員感染性疾病[7]、自身潛在病毒激活[10-11]、過敏性疾病的發(fā)生[11-13];過敏性疾病的發(fā)病與免疫失衡密切相關(guān);航天飛行中T 淋巴細(xì)胞亞群Th1、Th2、Th17、Treg 分布失衡[7,14]。

小鼠尾吊是常見的地面模擬失重動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?但其對(duì)Th 淋巴細(xì)胞亞群的分布報(bào)導(dǎo)尚不明確,對(duì)過敏性疾病的影響研究也僅見一例[15]。

采用OVA 誘導(dǎo)過敏性哮喘的小鼠模型,觀察尾吊模擬失重對(duì)過敏性哮喘的作用,發(fā)現(xiàn)OVA 刺激后,整體上表現(xiàn)體形消瘦、毛發(fā)豎起、煩躁不安、呼吸困難、擦鼻。組織上能造成肺組織發(fā)生顯著的炎性滲出和炎性反應(yīng),尤其以支氣管周圍更加顯著,間質(zhì)增厚,支氣管肺泡灌洗液炎性細(xì)胞大量增加,表明了支氣管和肺組織的炎癥發(fā)生,這些變化影響正常行使肺臟通氣換氣功能。而與正常對(duì)照組相比,單純尾吊小鼠無整體上體形消瘦、毛發(fā)豎起、精神正常、無呼吸困難和擦鼻等表現(xiàn),同時(shí)無支氣管和肺組織的明顯變化,支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞也沒有增加,說明尾吊模擬失重對(duì)小鼠的呼吸系統(tǒng)包括支氣管和肺組織無明顯損傷。但尾吊能明顯改善OVA 造成的過敏性哮喘癥狀、支氣管和肺組織炎性變化及灌洗液中炎性細(xì)胞的滲出。

同時(shí),OVA 刺激后,小鼠脾細(xì)胞總數(shù)明顯升高,Th1、Th2 和Th17 亞群占Th 細(xì)胞百分比升高,表明炎性反應(yīng)能力增強(qiáng),促進(jìn)了過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展。Treg 細(xì)胞主要具免疫抑制作用,能夠抑制Th1、Th2、Th17 細(xì)胞的炎性反應(yīng),起到維持免疫平衡的作用,能減少免疫炎性的損害[16-18]。而Treg 細(xì)胞亞群百分比在OVA 刺激后均有升高,但尾吊條件下,Treg 細(xì)胞亞群升高更為顯著,說明尾吊對(duì)OVA 刺激的炎性反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用,尾吊本身對(duì)脾細(xì)胞總數(shù)和Th1、Th2、Th17 淋巴細(xì)胞亞群分布無明顯影響,但尾吊能明顯改變OVA 造成的脾細(xì)胞總數(shù)變化和Th 淋巴細(xì)胞亞群分布,表明尾吊模擬失重減輕了OVA 造成的免疫炎性反應(yīng)。

本文研究表明,尾吊模擬失重減緩OVA 所致小鼠過敏性哮喘的病癥,而這與小鼠Treg 細(xì)胞數(shù)目升高有關(guān)。表明免疫功能的平衡程度與過敏性哮喘發(fā)生與發(fā)展具有一定相關(guān)性。

真實(shí)飛行中,航天員的免疫功能對(duì)航天環(huán)境非常敏感,過敏性疾病發(fā)生可能性增加,2016 年,一名國際空間站航天員的個(gè)案研究記錄了太空飛行期間出現(xiàn)皮疹和非典型過敏癥狀[12]。

隨著飛行條件和飛行時(shí)長不同,航天員免疫功能呈動(dòng)態(tài)變化,免疫系統(tǒng)是否發(fā)生失衡,采取何種對(duì)抗措施來維持其平衡,與航天員是否發(fā)生過敏性疾病有重要關(guān)聯(lián)性。本文研究結(jié)果尾吊模擬失重減輕了過敏性疾病的程度,與預(yù)想不一致。這可能是由于不同的尾吊時(shí)間對(duì)小鼠免疫功能的影響不同,導(dǎo)致了對(duì)過敏性哮喘的不同調(diào)節(jié)。也有可能與OVA 通過鼻飼致敏的過程有關(guān),頭低位尾吊減緩了OVA 對(duì)肺的直接刺激。在下一步的研究中,應(yīng)觀察不同尾吊時(shí)間對(duì)免疫功能和過敏性疾病的影響,再者也需要同時(shí)觀察其他過敏性模型對(duì)尾吊模擬失重的反應(yīng),以更全面地闡明在在未來太空飛行中,過敏性疾病的發(fā)生以及與免疫功能的相關(guān)性,更準(zhǔn)確地來保障航天員健康工作。

5 結(jié)論

在整體水平上,尾吊模擬失重顯著改善OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠的外觀、精神和呼吸變化;在組織水平上,尾吊模擬失重明顯減少OVA 誘導(dǎo)造成的支氣管肺組織炎性變化,支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞的滲出明顯下降;在細(xì)胞水平上,尾吊模擬失重減緩了OVA 誘導(dǎo)的機(jī)體免疫炎性細(xì)胞的增加,相反進(jìn)一步促進(jìn)了免疫抑制性T 細(xì)胞比例的升高。因此,OVA 刺激條件下,模擬失重將導(dǎo)致機(jī)體免疫功能發(fā)生改變,對(duì)過敏性哮喘的病情有一定影響。