細(xì)胞膜色譜技術(shù)在多肽類成分篩選的研究進(jìn)展

孫鐵鋒,王平,2,丁相龍,丁立鈞,姜其寶,王金國(guó)

(1.山東省中醫(yī)藥研究院,山東 濟(jì)南 250014;2.天津大學(xué)精密測(cè)試技術(shù)及儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300072;3.青島市黃島區(qū)第二中醫(yī)醫(yī)院,山東 青島 266400;4.日照市中醫(yī)醫(yī)院,山東 日照 276800;5.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355)

多肽(polypeptide)是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物,是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫作二肽,同理類推還有三肽、四肽、五肽等。通常由10～100個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫多肽[1]。它的分子結(jié)構(gòu)是氨基酸和蛋白質(zhì)之間的化合物[2-3]。許多中藥中都存在著多肽成分,對(duì)于多肽成分的研究日益受到重視,迫切需要一種有效的方法來(lái)篩選和鑒定中藥原料中的多肽有效成分,包括薄層色譜(thin-layer chromatography,TLC)、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜(gas chromatography,GC)等方法。已有研究[10]采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)幾種阿膠塊的特征肽進(jìn)行了鑒定,鑒定結(jié)果準(zhǔn)確,但過(guò)程較為復(fù)雜。最近,細(xì)胞膜色譜(cell membrane chromatography,CMC)技術(shù)的蓬勃發(fā)展為篩選和鑒定多肽提供了新思路、新方法。

細(xì)胞膜色譜是一種利用小分子配體和受體、酶和底物、抗原和抗體之間的高度特異性相互作用,或通過(guò)氫鍵、離子、疏水和親水相互作用的分子結(jié)合能力來(lái)模擬體內(nèi)藥物之間相互作用的仿生色譜方法。近年來(lái)細(xì)胞膜色譜方法應(yīng)用于藥物受體相互作用的研究和復(fù)雜樣品中有效或有害成分的篩選[14]越來(lái)越普遍,細(xì)胞膜色譜在高表達(dá)受體、工程細(xì)胞培養(yǎng)等方面取得重大成果,大大提高了藥物成分的篩選速度。本文擬將近幾年關(guān)于細(xì)胞膜色譜的原理及特點(diǎn)、分類以及在多肽類藥物成分的篩選方面的研究做個(gè)總結(jié)。

1 細(xì)胞膜色譜的原理及特點(diǎn)

在細(xì)胞膜的表面,存在著一個(gè)活性的受體和一個(gè)離子通道,它們能夠與一些藥物相結(jié)合,對(duì)第二個(gè)或者第三個(gè)信號(hào)分子起到一定的作用,引發(fā)一些生物學(xué)效應(yīng),達(dá)到藥理作用。細(xì)胞膜色譜以硅膠作為載體,將具有靶向作用的細(xì)胞膜固定在硅膠載體上,利用硅膠表面的硅羥基不可逆地強(qiáng)大的吸附作用和吸附的細(xì)胞膜之間的融合作用,從而使硅膠表面被細(xì)胞膜所覆蓋,形成具有生物活性的細(xì)胞膜固定相[15],將緩沖溶液作為流動(dòng)相,將中藥物質(zhì)添加到緩沖溶液中,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間,中藥活性物質(zhì)被保留在固定相中,無(wú)效成分經(jīng)過(guò)洗脫流出色譜柱,完成篩選過(guò)程。

細(xì)胞膜色譜技術(shù)可以使細(xì)胞膜保持完整性和酶活性,從而使得細(xì)胞膜色譜具有色譜分離、活性檢測(cè)和藥物鑒定等作用[16],可以將每味中藥的活性成分形成化學(xué)庫(kù),一個(gè)細(xì)胞膜色譜柱形成一種高通量篩選系統(tǒng),多類細(xì)胞膜色譜柱從而形成中藥的高通量篩選系統(tǒng)[17],可以進(jìn)行定性和定量分析,具有簡(jiǎn)便性、穩(wěn)定性等特點(diǎn)[18]。

2 細(xì)胞膜色譜的分類及應(yīng)用

根據(jù)所選細(xì)胞膜是否固定在色譜載體上,細(xì)胞膜色譜技術(shù)可分為細(xì)胞膜生物親和色譜技術(shù)和細(xì)胞膜固相色譜技術(shù)[19]。

細(xì)胞膜生物親和色譜法使用各種生物活性物質(zhì)(如酶、載體蛋白、細(xì)胞膜等)作為固定相。由于這種生物活性固定相可以特異性地結(jié)合參與人類生活的不同生物活性物質(zhì),生物色譜法可以用來(lái)分離和制備具有不同生物活性的物質(zhì)。目前,生物色譜法主要使用固定在色譜支架上的活性生物分子、活性細(xì)胞膜(或仿生膜)、活細(xì)胞、植物細(xì)胞(或細(xì)胞壁)[20]。

細(xì)胞膜固相色譜法是利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法[21],因細(xì)胞膜固相色譜的細(xì)胞膜上有許多不同的受體,利用親和性的生物大分子,可以特異性地選擇性地與作用組分結(jié)合,并與其進(jìn)行特殊的結(jié)合和分離,具有結(jié)合、高效、穩(wěn)定的特性,從而模擬藥物與靶點(diǎn)之間的相互作用,并將特定的組分釋放到細(xì)胞膜的靶點(diǎn)上[22]。

2.1 細(xì)胞膜固相色譜法將特定的活性細(xì)胞與植物的浸提物在合適的培養(yǎng)液中進(jìn)行混合培養(yǎng),使其與細(xì)胞膜受體特異地結(jié)合,通過(guò)洗滌、解離等方法將其釋放,然后利用層析技術(shù)對(duì)解離液中的有效組分進(jìn)行分離。這種方法能有效地減少許多非特定成分的干擾,為中藥的活性成分研究提供了一種新的途徑[23]。主要流程包括:①親和孵育;②洗脫;③提取;④色譜分離、分析、比較。

李翠芹等[24]用兔白細(xì)胞膜(WBCM)制成了WB-CMC模型,并對(duì)其在 WBCM、TLR4的作用部位進(jìn)行了研究。同時(shí),利用正相色譜法和反相柱色譜法對(duì)白術(shù)進(jìn)行了超臨界萃取,結(jié)果表明,白術(shù)中抗炎癥作用的主要化學(xué)成分是白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和烷烴。

樊宏偉等[25]通過(guò)建立血小板細(xì)胞膜色譜模型,對(duì)丹參與血小板間的相互作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)此系統(tǒng)中殘余組分與其藥效關(guān)系密切。結(jié)果顯示,血小板液-固相色譜中,主要的反應(yīng)物質(zhì)與受體、通道、 淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)等分子間的交互作用,其他成分與其藥效有明顯的關(guān)系。朱建梁等[26]以腎小球系膜細(xì)胞膜固相色譜法測(cè)定丹皮中的作用組分,并以其為固定相,選擇性地將其與腎系膜細(xì)胞結(jié)合,由此推測(cè),丹皮酚是其作用部位。

2.2 細(xì)胞膜生物親和色譜[27]通過(guò)將一種特殊的細(xì)胞膜與一種特殊的載體結(jié)合,從而形成一種與特定的活性組分相結(jié)合的細(xì)胞膜固定相,從而能夠動(dòng)態(tài)地模擬出體外藥物與體內(nèi)靶基因的相互作用,并對(duì)其合成機(jī)理進(jìn)行了深入的研究。主要過(guò)程是:①分離活性細(xì)胞膜;②固定活性細(xì)胞膜;③制備細(xì)胞膜色譜柱;④細(xì)胞膜色譜和分析[28]。

Gu等[29]用骨髓單個(gè)核細(xì)胞膜色譜法篩選黃芩抗骨質(zhì)疏松成分,提高了篩選效率。Li等[30]以硅膠為載體,以昆明種小鼠腹腔巨噬制備細(xì)胞膜固定相,通過(guò)對(duì)魚腥草進(jìn)行體外抗氧化劑的篩選,并與氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行比較,分析表明,甲基正壬酮是魚腥草中主要的抗氧化劑(MNK)。Hou等[31]制備了以硅膠為載體的MDA -MB - 231細(xì)胞膜固定相,并用2D LC - MS(二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀)分析技術(shù),篩選厚樸中抗乳腺癌成分,結(jié)果顯示,和厚樸酚和厚樸酚為其主要抗乳腺癌成分。

Sun等[32]以硅膠為載體,在人胚胎腎細(xì)胞(human embryonic kidney 293,HEK293)細(xì)胞膜上高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的士的寧中篩選抗EGFR成分,發(fā)現(xiàn)馬錢子的主要活性成分為馬錢子堿和士的寧。多種細(xì)胞膜模型用于篩選中藥或化合物的活性成分,如丹參、四川牡丹和當(dāng)歸。

3 細(xì)胞膜色譜在多肽類成分中的應(yīng)用

多肽(polypeptide)是一類新興生物活性有效成分,其相對(duì)分子質(zhì)量介于大分子蛋白/抗體類成分和小分子化學(xué)成分之間[33]。隨著多肽篩選技術(shù)的不斷發(fā)展,已開發(fā)出更多的多肽藥物,用于疾病的診斷、治療和預(yù)防[34]。多肽的研發(fā)已在許多系統(tǒng)疾病中顯示出多肽的藥效和潛在的商業(yè)價(jià)值,其應(yīng)用范圍包括:抗菌肽、抗氧化肽、抗腫瘤肽等。利用小分子化合物調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)間的交互作用,從而干擾細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路,從而調(diào)節(jié)機(jī)體的生命活動(dòng),從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。多肽能通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[35]。其中,抗體藥物具有較高的價(jià)格、較大的分子量和復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu),并可通過(guò)非特異性的吸收而導(dǎo)致肝臟的損害,從而限制了其臨床應(yīng)用[36]。多肽藥物易降解,細(xì)胞膜滲透性差,是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。由于該技術(shù)具有在線、高通量、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),是一種高效的組分篩選技術(shù)。

3.1 細(xì)胞膜色譜法在抗菌多肽方面的應(yīng)用抗菌肽又被稱為抗微生物肽,對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗菌作用,其本身的穩(wěn)定性和抗性很低,是一種能夠抵御微生物侵襲的高質(zhì)量的多肽。自身穩(wěn)定性較高并且產(chǎn)生抗藥性的概率相對(duì)較低,在具體的構(gòu)建過(guò)程中,是機(jī)體抵抗病原微生物侵襲、具有優(yōu)質(zhì)的抵抗微生物活性的小分子多肽[37]。大多數(shù)的抗菌肽對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌均有效,某些種類的抗菌肽還對(duì)真菌、病毒、寄生蟲等也具有殺滅作用。有研究表明,有些類型的抗菌肽具有抗DNA、RNA病毒的作用[38]?？咕姆肿雍苄?可以在很短的時(shí)間內(nèi)生成,而且它的反應(yīng)速度和傳播速度要比人體內(nèi)的免疫細(xì)胞快得多。由于其特殊的機(jī)制,能夠形成不耐菌的特點(diǎn),成為新型的抗菌藥物?？咕氖且环N免疫調(diào)節(jié)物質(zhì),它可以參與到宿主自身免疫系統(tǒng)中的其他反應(yīng)中,增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增殖和吞噬能力,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及相關(guān)免疫因子的活性,從而激活和調(diào)整免疫系統(tǒng),增強(qiáng)人體的免疫力。但是,抗菌肽在生產(chǎn)中也面臨著諸多問(wèn)題:①抗菌肽種類繁多,殺菌效果和功能不盡相同;②抗菌肽在體內(nèi)的作用機(jī)制還不明朗;③大部分的天然抗菌肽還存在著活性低、毒性大等問(wèn)題;④抗菌肽在酶的作用下會(huì)喪失生物活性,穩(wěn)定性較差。綜上可知,目前抗菌肽應(yīng)用還處于試驗(yàn)探索階段,今后還需付出諸多努力解決上述問(wèn)題,為抗菌肽的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。利用細(xì)胞膜色譜技術(shù)可以更好地發(fā)現(xiàn)廣譜的抗菌肽,探討抗菌肽的作用機(jī)理。

王改玲[39]以草魚為研究對(duì)象,利用細(xì)胞膜層析技術(shù),將抗菌蛋白從體表黏液中分離出來(lái),并對(duì)其氨基酸成分進(jìn)行了質(zhì)譜分析。通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體,對(duì)鯉魚上皮細(xì)胞進(jìn)行抗菌、抗病毒、抗菌活性的研究,結(jié)果表明,用細(xì)胞膜色譜技術(shù)制備抗菌肽是可行的。

肖建輝[40]以麻瘋樹種子粉為起始材料,建立了擴(kuò)散-分層色譜法,并以解毒的麻瘋樹種子粉及其蛋白水解物改進(jìn)了擴(kuò)散-分層色譜法。通過(guò)引進(jìn)研究抗菌機(jī)制的工具和優(yōu)化現(xiàn)有篩選方法的組合和設(shè)計(jì),快速、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)和制備麻瘋樹的抗菌肽。研究表明,通過(guò)細(xì)胞膜親和色譜法可以分離麻瘋樹抗菌肽,細(xì)胞壁膜是抗菌肽(JCpep7和JCpep8)的主要抗菌目標(biāo)。

唐文婷[41]用細(xì)胞膜色譜法制備了模擬磷脂的涂布細(xì)胞膜固定相,并從卵白蛋白胃蛋白酶的水解產(chǎn)物中成功分離出一種新型的抗菌肽。采用模擬細(xì)胞膜的磷脂固相萃取與HPLC技術(shù),結(jié)果表明細(xì)胞膜固相萃取與HPLC技術(shù)適用于抗菌肽的分離。

范華寧[42]利用酪蛋白水解酶,結(jié)合固相親和萃取和高效液相色譜法構(gòu)建了細(xì)胞膜色譜柱,研究了抗菌肽的抗菌性和穩(wěn)定性,以及抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞膜組成的影響。結(jié)果表明,通過(guò)CMC分離酪蛋白衍生的抗菌肽得到的抗菌肽對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌均有抑制作用,具有一定的熱穩(wěn)定性,能耐受一定的離子強(qiáng)度,而且酪蛋白衍生的抗菌肽能破壞細(xì)菌壁膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

3.2 細(xì)胞膜色譜法應(yīng)用于抗氧化肽活性成分篩選抗氧化肽是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易吸收、穩(wěn)定性好、無(wú)免疫反應(yīng)性的天然抗氧化劑,它不僅具有很好的抗氧化作用,還能起到降低血壓、抗腫瘤的作用,因此在食品、醫(yī)藥、保健食品等方面得到了廣泛的應(yīng)用[43]。不同來(lái)源的抗氧化肽對(duì)人體的健康起到了積極的作用,在食品、藥學(xué)、生物等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。然而,在抗氧化肽作為天然抗氧化劑大規(guī)模地應(yīng)用到人類營(yíng)養(yǎng)和健康領(lǐng)域之前,仍有許多科學(xué)和技術(shù)問(wèn)題亟須解決[44]:①酶解制備的許多小肽具有相似的分子量,因此,如何有效地分離、提純目的抗氧化肽是目前亟待解決的問(wèn)題;②雖然在某些體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,抗氧化肽具有很好的抗氧化作用。然而,目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)化的方法來(lái)評(píng)價(jià)多肽的抗氧化性;③抗氧化肽的不穩(wěn)定性是制約其廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的重要因素。

玉米蛋白粉中含豐富抗氧化肽,為探究玉米蛋白粉中的抗氧化肽,姜源[46]通過(guò)生成完整的極化差分單層結(jié)構(gòu)Caco-2細(xì)胞膜模型,以AGI/LPM和HAI/LGA結(jié)構(gòu)鑒定為研究對(duì)象,分離純化了玉米抗氧化肽,事實(shí)證明,玉米衍生的五肽AGLPM(丙氨酸—甘氨酸—亮氨酸—脯氨酸—甲硫氨酸(Ala-Gly-Leu-Pro-Met)的抗氧化活性最強(qiáng)。在其(非C端或N端)肽序列中,Leu-肽的抗氧化活性可能大于Ile-肽的抗氧化活性;與非螺旋弧相比,α螺旋結(jié)構(gòu)可能在肽的抗氧化活性中發(fā)揮更大作用。

3.3 細(xì)胞膜色譜應(yīng)用于腫瘤靶向多肽的篩選小分子抗癌肽高度多樣化,其結(jié)構(gòu)多樣性決定了抗癌途徑和機(jī)制的多樣性[47]。肽化合物可以直接或間接作用于腫瘤細(xì)胞,以調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)和凋亡,抑制腫瘤相關(guān)的物質(zhì)或信號(hào),并促進(jìn)凋亡相關(guān)的物質(zhì)或信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)[48],蛋白肽可以增加巨噬細(xì)胞的吞噬能力,促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。從植物和微生物中分離和合成的多肽可以通過(guò)生物或化學(xué)合成來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤發(fā)展。肽具有高度的針對(duì)性,不良影響少,而且容易分離和修改,今后分離、修飾和合成新的抗癌肽藥物是有很大希望的。對(duì)多肽抗癌機(jī)制的研究還不夠全面,缺乏相關(guān)的臨床和藥理研究,其固有的免疫和適應(yīng)性免疫機(jī)制也沒有得到很好的闡釋,因此需要進(jìn)一步研究,為開發(fā)新的抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。

納米醫(yī)學(xué)輸送系統(tǒng)面臨的兩個(gè)問(wèn)題是對(duì)腫瘤組織的靶向性差和滲透性差。傳統(tǒng)理論認(rèn)為,納米藥物可以通過(guò)實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect,EPR)效應(yīng)在腫瘤中富集,但最近的研究表明,基于EPR的富集率只有0.7%。特別值得關(guān)注的是通過(guò)細(xì)胞膜色譜法篩選腫瘤靶向肽,Lv等[49]開發(fā)了一種基于偽細(xì)胞膜色譜法的腫瘤靶向肽的篩選方法,根據(jù)靶標(biāo)能與細(xì)胞膜表面的受體特異性結(jié)合的原則篩選靶標(biāo)肽序列。通過(guò)固相合成法合成了大量的隨機(jī)多肽庫(kù),通過(guò)固相萃取法對(duì)合成的多肽庫(kù)進(jìn)行方便快捷的篩選,并對(duì)保留在細(xì)胞膜表面的多肽序列進(jìn)行測(cè)序,最終得到目標(biāo)多肽。

Chen等[50]建立了一種新穎的二維比較細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)用于篩選復(fù)雜的中草藥中與肝癌相關(guān)的特異性靶向多肽受體結(jié)合的配體。在構(gòu)建高表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3))的肝癌細(xì)胞株SK-Hep1-GPC3的基礎(chǔ)上,負(fù)載SK-Hep1-GPC3/CMC柱。黏多糖I被保留SK-Hep1-GPC3/CMC色譜柱上,經(jīng)表面等離子體共振檢測(cè),與GPC3的親和力為4.33 μmol·L-1。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,黏液蛋白酶I對(duì)SK-Hep1-GPC3細(xì)胞的IC為18.01 μmol·L-1,從而根據(jù)柱上的保留行為篩選黃芩抗腫瘤的多肽成分。

溫浙盛等[51]建立了腫瘤脂質(zhì)體細(xì)胞膜色譜模型。通過(guò)建立可直接用于體外表達(dá)多肽的DNA文庫(kù),用核糖體表達(dá)法篩選特異性抗腫瘤肽,并用MTT法檢測(cè)所篩選肽的體外抗腫瘤作用。結(jié)果表明,通過(guò)體外核糖體表達(dá)和脂質(zhì)體從設(shè)計(jì)的肽庫(kù)中成功地篩選出了部分肽。

4 總結(jié)

CMC技術(shù)自誕生以來(lái),從一維到多維,從脫機(jī)到在線,再?gòu)亩喟悬c(diǎn)轉(zhuǎn)成特異性靶點(diǎn)[52],與傳統(tǒng)方法相比,CMC克服了“分離-評(píng)價(jià)”模式的缺點(diǎn),在復(fù)雜樣品中目標(biāo)組分的高通量篩選方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。采用CMC技術(shù)與HPLC、 MS技術(shù)相結(jié)合,可以有效地篩選和鑒別有效組分。CMC技術(shù)具有在線、高通量和自動(dòng)化等特點(diǎn),是一種新型的有效組分篩選技術(shù)。已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、抗心血管疾病、抗前列腺增生等活性成分的篩選[53-54],篩選準(zhǔn)確度逐漸提高,提高了篩選的效率。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展如大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞,已被用于在體外過(guò)表達(dá)受體蛋白,從而能夠構(gòu)建具有高水平表達(dá)特異性受體的細(xì)胞系。近年來(lái),研究人員利用現(xiàn)代分子生物學(xué)工具構(gòu)建了穩(wěn)定且高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞系,其受體包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1(FGFR1)和FGFR4 。利用相應(yīng)受體的選擇性拮抗劑作為對(duì)照樣品,成功建立了高表達(dá)的CMC模型,發(fā)現(xiàn)了苦參、當(dāng)歸、蓼、黃芪、烏頭和黃葉的活性成分。高表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建可以實(shí)現(xiàn)CMSP類型具有更強(qiáng)的特異性和選擇性的無(wú)限擴(kuò)展,從而大大提高了該方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。

傳統(tǒng)篩選方法在分析通量、分析效率、分析內(nèi)涵上均存在重大缺陷,嚴(yán)重制約了從復(fù)雜體系中篩選多肽類活性成分的發(fā)展,而CMC作為一種高通量篩選系統(tǒng)可從成千上萬(wàn)的多肽類成分中快速篩選出具有特殊生物活性的化合物。將組合化學(xué)技術(shù)與藥物高通量篩選技術(shù)相結(jié)合,可使一次合成成千上萬(wàn)的多肽成為可能,這也將是多肽類藥物開發(fā)的重要途徑。一般多肽的濃度較低,成分復(fù)雜,尤其是雜質(zhì)的理化性質(zhì)和目標(biāo)多肽十分相似,分離純化比較困難,CMC細(xì)胞膜表面的特異性受體可高選擇性地與作用組分結(jié)合,從而達(dá)到理想的分離純化效果。利用新興肽類技術(shù)將被CMC篩選純化出的多肽類活性成分應(yīng)用到制藥中,包括多功能肽、細(xì)胞穿透肽和多肽偶聯(lián)藥物,將大大拓展治療性多肽藥物的應(yīng)用范圍。

細(xì)胞膜色譜存在一定的缺陷,因其是在離體的條件下篩選中藥活性物質(zhì),因此不能模擬活性物質(zhì)在體內(nèi)的結(jié)合情況,不能排除非特異性現(xiàn)象[55];細(xì)胞膜色譜是以受體學(xué)說(shuō)為原理的,只對(duì)于一些有特定靶點(diǎn)的藥物有篩選作用,存在一定的限制。在篩選不同的活性物質(zhì)時(shí)需要更換不同的細(xì)胞膜固定相,固定相的制備比較煩瑣,且保存時(shí)間不長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)的精密度欠缺,難以得到推廣。由于CMC柱的受體容量有限,高含量/親和性化合物可能會(huì)導(dǎo)致柱超載,從而導(dǎo)致忽略其他陽(yáng)性候選物[56]。為克服上述效應(yīng),充分發(fā)掘生物活性物質(zhì),采用了基于化學(xué)成分的二維CMC技術(shù)和化學(xué)成分敲除技術(shù),具有良好選擇性、穩(wěn)定性和再現(xiàn)性,結(jié)合組分敲除方法,克服了色譜柱過(guò)載問(wèn)題,提高了篩選效率。天然植物藥中成分復(fù)雜,應(yīng)用天然藥物分離提取方法篩選其中特定的有效成分周期長(zhǎng),命中率相對(duì)較低,而CMC法不經(jīng)分離步驟,直接在模型上確定藥物的某種活性成分,具有方法快速、簡(jiǎn)捷、命中率高的特點(diǎn)。因此,細(xì)胞膜色譜法可作為一種高通量的藥物篩選方法用于從中藥復(fù)雜體系中篩選出藥物的活性成分。