簡單重復(fù)序列標(biāo)記熒光染料檢測和銀染顯影技術(shù)的比較

孫 祺，張 倩，柳 依，梁 芬，鄧譯婷，程麗莎，湯文浩，張 毅，4

（1.分子標(biāo)記（武漢）生物育種有限公司，武漢 430070；2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430100；3.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院，武漢 430070；4.武漢工程大學(xué)光學(xué)信息與模式識別湖北省重點實驗室，武漢 430205）

簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也稱為微衛(wèi)星序列，普遍存在于真核生物基因組和部分原核生物基因組中［1，2］。SSR 通常由1～6 個重復(fù)串聯(lián)的核苷酸組成，長度一般不超過100 bp［3］。作為常見的分子標(biāo)記技術(shù)，SSR 標(biāo)記技術(shù)與其他分子標(biāo)記如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD），區(qū)間-簡單重復(fù)序列（ISSR）相比，具有在基因組中廣泛分布、信息量較大、呈共顯性遺傳、序列短、容易擴(kuò)增、多態(tài)性高和特異性位點穩(wěn)定等優(yōu)點，廣泛用于遺傳圖譜，品種鑒定，遺傳多樣性和生物進(jìn)化，QTL 定位和分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域［4-6］。

聚丙烯酰胺凝膠是生化試驗常用的支持介質(zhì)，以聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)與核酸分離［7，8］，因其具有電滲作用小、分辨率高、不易擴(kuò)散、靈敏度高、易于觀察等優(yōu)點［9-11］，是遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等遺傳育種研究的重要手段，特別是在SSR、ISSR、RFLP 等分子標(biāo)記研究中具有不可替代的作用［12］。用染料和生物大分子結(jié)合形成有色復(fù)合物是聚丙烯酰胺凝膠電泳后檢測的常用方法，染色的方法有很多，如碘染，銀染，CuCl 染色，熒光染色等［13，14］。銀染法是重要的DNA 染色方法，該方法利用銀離子與核苷酸結(jié)合，并在堿性環(huán)境下使用甲醛使銀離子還原而使凝膠中的DNA 得以顯示為原理，具有高靈敏度和高分辨率得到廣泛應(yīng)用［15］。傳統(tǒng)的銀染法操作流程含有固定、漂洗、銀染、漂洗、顯色和終止6 個主要步驟［16］，操作過程復(fù)雜且需提前配制反應(yīng)溶液，使得其存在操作復(fù)雜、耗時費(fèi)力等缺點，盡管已有一些研究對銀染法進(jìn)行了改進(jìn)，但這些改進(jìn)在操作上仍存在不足［17，18］。銀離子會對人體及環(huán)境產(chǎn)生危害。相比于銀染法，熒光染料法則是在靈敏度準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上，操作更為簡便，數(shù)據(jù)整合更為方便的DNA 分子標(biāo)記檢測技術(shù)［19］。基本原理是利用熒光染料能與核苷酸結(jié)合的特點，在特定紫外光激發(fā)下顯示出熒光條帶，使得核酸分子能夠被檢測出來［19］。

水稻是中國最早開展分子遺傳學(xué)和分子育種研究的糧食作物，且SSR 標(biāo)記早已成熟應(yīng)用于水稻分子標(biāo)記輔助育種［20］。研究發(fā)現(xiàn)，在水稻基因組中，大約存在5 700～10 000 個SSR。SSR 標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于水稻遺傳背景鑒定、抗病性及香味性狀輔助育種、品種檢測等研究［21-24］。本研究運(yùn)用SSR 熒光染料法和銀染法，選用水稻抗稻瘟病標(biāo)記Pi2 對48個水稻材料進(jìn)行檢測，并對這2 種方法的檢測效果作出了比較，并總結(jié)了各自的特點，以期建立成熟的SSR 標(biāo)記熒光染料檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所選材料為水稻F2群體，由歸田園（武漢）現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司提供。2022 年種植于歸田園試驗示范基地。

所選取的SSR 標(biāo)記為抗稻瘟病SSR 標(biāo)記Pi2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 SSR 引物信息

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 選取生長10 d 的水稻幼嫩芽及下胚軸（300 mg）置于研缽中，提取DNA［25，26］。首先在裝有樣品的研缽中加入800 μL提取緩沖液（2% CTAB）研磨成勻漿；65 ℃水浴45 min 每隔15 min 取出并上下輕微搖動幾次；加入等體積的氯仿和異戊醇混合液（體積比為24∶1），搖勻；10 000 r/min 離心10 min，吸上清液并轉(zhuǎn)移到另一離心管中；加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇（用以沉淀DNA），混勻后于-20 ℃靜置30 min；10 000 r/min離心30 s，棄上清液，75%乙醇清洗2～3 次，室溫下晾干后加入200 μL ddH2O（含2 μL 10 mg/mL 的RNase）溶解DNA。待DNA充分溶解后于-20 ℃保存。

PCR 反應(yīng)采用10 μL 反應(yīng)體系。模板DNA（50 ng/μL）1 μL，2×Taq Master Mix 5 μL，引物（10 μmol）0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，反應(yīng)試劑均為分子標(biāo)記（武漢）生物育種有限公司自主研發(fā)；PCR 擴(kuò)增程序為預(yù)變性94 ℃3 min，變性94 ℃30 s，退火56 ℃30 s，延伸72 ℃45 s，變性、退火、延伸3 個步驟重復(fù)35 個循環(huán)，再進(jìn)行延伸72 ℃5 min，25 ℃保存10 min。反應(yīng)完成后，加入8～10 μL Loading buffer，4 ℃放置備用。

1.2.2 聚丙酰胺凝膠電泳 將提前洗凈晾干的長玻璃和凹玻璃兩側(cè)各用1 個夾子夾住，組成膠槽。燒杯中先加入約100 mL PAGE 膠，再加入360 μL 10%AP 和36 μL TEMED 并迅速混勻，將混合液注入膠槽，灌膠過程盡量避免產(chǎn)生氣泡；再插入點樣梳子，深入約為3 mm；靜置約10～20 min。

在正極槽（底下）中加入600 mL 1×TBE 緩沖液，組裝上配好凝膠的玻璃板，負(fù)極槽上加入800 mL 0.5×TBE 緩沖液直至覆蓋了凝膠上方。緩慢拔出梳子，將凝膠上方多余的膠用槍沖洗干凈，并將氣泡清除，每孔加入0.8～1.5 μLDNA 樣品，采用55 W 恒定功率電泳30 min 左右，至第一條Loading buffer 指示帶（二甲苯青帶，約相當(dāng)于260 bp 雙鏈DNA）跑至膠板的2/3 處（距底部1/3 處）時停止電泳。

1.2.3 SSR 標(biāo)記顯影 熒光染料染色顯影，電泳結(jié)束后緩慢撬開玻璃板，取出凝膠，經(jīng)過蒸餾水漂洗后，轉(zhuǎn)移至0.01%核酸染料（染料由分子標(biāo)記（武漢）生物育種有限公司自主研發(fā)）中泡染10～20 min。泡然結(jié)束后用蒸餾水漂洗1 遍，隨后將聚丙酰胺凝膠至于凝膠成像儀（Bio-Rad）中進(jìn)行拍照。

銀染顯影，將凝膠用蒸餾水漂洗2 遍，放入0.1% 的AgNO3染液中銀染10 min（1 000 mL 蒸餾水中加入1 g AgNO3），期間將銀染槽至于搖床上輕輕搖晃。銀染結(jié)束后用蒸餾水沖洗凝膠（5～10 s），隨后將凝膠浸在顯影液（1.5%NaOH，0.6%甲醛）中，顯影3～5 min，直至DNA 條帶出現(xiàn)。最后取出凝膠，用蒸餾水沖洗2 遍，室溫下自然干燥，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種染色原理分析

銀染法是重要的DNA 染色法，其原理是利用銀離子可與核苷酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，在堿性環(huán)境下，用甲醛能使銀離子還原成銀褐色顆粒，從而使凝膠中的DNA 及RNA 都染成黑褐色得以顯帶。熒光染料染色法則是利用熒光染料能與核苷酸結(jié)合的特點，在特定紫外光激發(fā)下顯示出熒光條帶，使得核酸分子能夠被檢測出來。

2.2 2 種染色方法效果分析

利用水稻SSR 標(biāo)記Pi2 檢測48 個樣本的基因型，結(jié)果見圖1。2 種染色方法均可以很好呈現(xiàn)標(biāo)記帶型，但銀染顯影法的靈敏度相對更高。其中熒光染色方法膠圖背景干凈、清晰，標(biāo)記DNA 帶型明顯，結(jié)果容易判讀（圖1a），而銀染法膠圖背景上有許多模糊條帶，對標(biāo)記DNA帶型的讀取有一定干擾（圖1b）。

圖1 熒光染色成像（a）和銀染法成像（b）

2.3 2 種檢測方法的效益比較

對銀染法和熒光法的成本及其工作效率進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。由表2 可知，2 種方法的儀器基本相同，銀染法與熒光染料法完成1 個SSR 反應(yīng)的試劑費(fèi)用分別為1.30、0.93 元。因此，單純從藥品消耗估計經(jīng)費(fèi)預(yù)算，熒光染料法低于銀染法。由于微衛(wèi)星熒光標(biāo)記技術(shù)與凝膠成像系統(tǒng)組合，其檢測效率也顯著高于銀染法，同時由于熒光標(biāo)記染色技術(shù)先進(jìn)，不會出現(xiàn)銀染不足或銀染過度導(dǎo)致無法分辨基因型的現(xiàn)象，且熒光染料法的雜帶干擾少，便于后期讀帶，對試驗人員的要求低。在本研究規(guī)模和操作系統(tǒng)下，熒光法的工作效率是銀染法的2.2 倍，考慮到工資成本，熒光染料法較銀染法更為經(jīng)濟(jì)。從環(huán)保性方面，由于銀染需要用到重金屬及揮發(fā)性甲醛，對試驗人員及環(huán)境影響較大。

表2 熒光染料法和銀染法檢測1 個樣品所需成本比較 （單位：元）

3 討論

SSR 標(biāo)記現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動植物研究的許多領(lǐng)域，由于其多態(tài)性好、數(shù)量多、易于檢測和低成本，被認(rèn)為是用于分子遺傳及分子標(biāo)記輔助選擇等研究最具競爭性的標(biāo)記。已有超過35 000 個SSR 標(biāo)記開發(fā)并映射到大豆所有的20 個連鎖群［27］。許多植物物種，如水稻，玉米，大麥等都開發(fā)了相關(guān)的SSR 標(biāo)記［28-30］。在國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的新標(biāo)準(zhǔn)中，48 對均勻分布在水稻24 條染色體上的SSR 被發(fā)布出來，王志奎等［31］采用水稻這48 對SSR 引物研究這些標(biāo)記與雜種優(yōu)勢相關(guān)性，研究表明，主要經(jīng)濟(jì)性狀與一些特定引物對應(yīng)的特定條帶表現(xiàn)出較強(qiáng)雜種優(yōu)勢，分子指紋帶型可以為雜種優(yōu)勢的預(yù)測提供一定的指導(dǎo)意義。此外，葉凱等［32］利用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的這48 個水稻SSR 和其實驗室開發(fā)的52 個水稻SSR 標(biāo)記對江蘇水稻品種的真實性進(jìn)行鑒定，研究表明，利用2 套標(biāo)記整合后的93 個標(biāo)記可區(qū)分所有有表型差異的品種，可以將這93 個標(biāo)記用于江蘇水稻品種的真實性鑒定。這些標(biāo)記為品種權(quán)的保護(hù)和鑒定提供重要的技術(shù)支持。

針對SSR 標(biāo)記檢測采用的主要方法有瓊脂糖凝膠電泳檢測法、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法和毛細(xì)管電泳熒光檢測法等。隨著二代測序的發(fā)展，在植物中采用測序技術(shù)對SSR 標(biāo)記進(jìn)行開發(fā)也已取得了顯著的成果［33］。在這些SSR 標(biāo)記檢測法中，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)由于其檢測靈敏度和分辨率高的特點，特別適合SSR 這樣的小片段檢測，并且因其操作簡單、所耗時間短、檢測快捷有效在SSR 檢測中廣泛應(yīng)用［34］。銀染法和熒光染料法是聚丙烯酰胺凝膠電泳后常用的顯影方法。銀染技術(shù)具有可與同位素相比擬的高靈敏度而廣泛使用［35］。然而銀染法操作繁瑣，對試驗操作者要求較高，并且銀染法所用的試劑對環(huán)境污染較大，對試驗人員健康也會產(chǎn)生影響。此外，銀染法的顯影時間不易掌控，若時間過短，DNA 條帶顯影不清晰，而過度顯影則會導(dǎo)致膠圖背景黑、噪音大，嚴(yán)重干擾結(jié)果讀取。盡管銀染法的改進(jìn)方法有很多，但這些銀染法的具體操作差異較大，使得初次使用者難以作出最佳選擇。而SSR熒光染料檢測技術(shù)操作簡單，試劑安全，染色后背景干凈干擾小，結(jié)果易讀取，可以開發(fā)圖像識別軟件用機(jī)器讀帶，使得工作效率大為提高。

銀染法和熒光染色檢測方法對SSR 標(biāo)記產(chǎn)物都能夠準(zhǔn)確檢測，且均具有較高的靈敏度。從染色效果來看，熒光染料檢測方法與銀染法都能檢測出相應(yīng)的條帶，但熒光染料檢測法，綜合成本低、效率高、所用試劑更為安全穩(wěn)定、對環(huán)境友好、操作方便，不會對人類、環(huán)境造成毒害。因此，熒光染料檢測方法作為SSR 篩選的染色方法，在分子標(biāo)記研究中更具有廣泛的推廣價值。

4 結(jié)論

本研究通過選取抗稻瘟病SSR 標(biāo)記Pi2，利用48份水稻材料，對熒光染料檢測和銀染顯影技術(shù)2 種方法的優(yōu)缺點進(jìn)行探討。結(jié)果表明，2 種檢測方法均具有較高靈敏度，檢測出的條帶清晰可見。本研究研發(fā)的熒光染料檢測結(jié)果出現(xiàn)的條帶清晰度更高。從成本和環(huán)境保護(hù)角度來看，本研究提出的熒光染料檢測技術(shù)優(yōu)于銀染顯影技術(shù)。