云南省2021年豬藍(lán)耳病流行情況調(diào)查及基因序列分析

趙屹欽，張 懿，何依蓉，張 然，唐小倩

（云南省動物疫病預(yù)防控制中心，昆明 650051）

豬繁殖和呼吸障礙綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，簡稱PRRS），俗稱藍(lán)耳病，是高度接觸性傳染病，仔豬發(fā)病率可達(dá)100%，病死率超過50%，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%，育肥豬也會發(fā)生死亡，嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)秩序［1］。ORF7 作為PRRSV 基因組的開放閱讀框之一編碼衣殼蛋白（N 蛋白），具有高度保守性，常用于疫苗研發(fā)及病毒鑒定［2］。Nsp2 作為PRRSV 最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有高變異特性及多種生物學(xué)特性且應(yīng)用廣泛，在確定PRRSV 的抗原性方面有重要作用，Nsp2 蛋白的突變將直接影響抗原的進(jìn)化，因此了解Nsp2 的遺傳變異可能對鑒定特定地理區(qū)域中的PRRSV 毒株有幫助［3］。豬繁殖和呼吸障礙綜合征2017 年退出國家強(qiáng)制免疫病種，為全面準(zhǔn)確掌握云南省PRRS 病原分布、免疫效果及流行情況，2021 年全年開展血清學(xué)和病原學(xué)監(jiān)測及分子流調(diào)，以期為該病的綜合防控及疫病凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)2021 年云南省動物疫病監(jiān)測與流調(diào)計(jì)劃，每季度在各州（市）下轄各縣（市）區(qū)按照配額抽樣方法，采集豬口、鼻、肛棉拭子3 651 份，全血921 份，脾、肺、淋巴1 885 份，共6 457 份病原學(xué)檢測樣品（規(guī)模場3 196 份、散養(yǎng)戶481 份、屠宰場1 872 份、市場908 份），涉及16 個州市、207 個縣（次）、396 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)（次）、443 個村（次）、37 個規(guī)模養(yǎng)殖場（次）、237 個散養(yǎng)戶（次）、217 個屠宰場（次）、73 個市場（次），以及37 912 份血清學(xué)檢測樣品（規(guī)模場12 840 份、散養(yǎng)戶24 872 份、屠宰場200 份），涉及802 個規(guī)模養(yǎng)殖場（次）、6 202 個散養(yǎng)戶（次）、17 個屠宰場。采樣時詳細(xì)填寫免疫類型、時間、疫苗生產(chǎn)廠家、豬群健康狀況等，且盡量保證全年采集樣品覆蓋全省所有縣（市）區(qū)。

1.2 主要儀器

Thermo Fisher MultiskanTMFC 酶標(biāo)儀、賽倫DHP-9162 恒溫培養(yǎng)箱、KJ201-C 型微量振蕩器、BIOTEK405LS 微孔板全自動洗板機(jī)；高通量組織研磨機(jī)、Thermo Fisher A2 型二級生物安全柜、西安天隆96 通道全自動核酸提取儀、BIO-RAD CFX96 熒光PCR 儀、ABI SimpliAmp PCR 儀、BIO-RAD 水平電泳槽、BIO-RAD 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 抗體檢測 抗體檢測采用間接ELISA 試劑盒，購自北京天之泰生物科技有限公司。試驗(yàn)操作和結(jié)果判定按照說明書進(jìn)行。

1.3.2 病原檢測 按照《豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法》（GB-T 18090—2008）所述方法檢測。將qPCR 陽性樣品RNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳鑒定后送華大基因進(jìn)行克隆測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 對血清學(xué)、病原學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對病原學(xué)陽性樣品空間分布情況進(jìn)行整理。將獲得的測序結(jié)果用DNAStar 軟件包中的Editseq 程序進(jìn)行校對、拼接，使用MEGA6 將得到的ORF7和Nsp2基因序列與GenBank 中登錄的國內(nèi)外PRRS 病毒參考毒株及疫苗株比對并構(gòu)建進(jìn)化樹，使用Megalign 分析基因組同源性及遺傳變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)檢測

對37 912份樣品進(jìn)行檢測，抗體陽性率77.29%，具體結(jié)果見表1。由表1 可知，2021 年云南省豬藍(lán)耳病抗體陽性率在70%以上，說明退出國家強(qiáng)制免疫計(jì)劃后，該省大部分養(yǎng)殖場（戶）仍在對豬群進(jìn)行主動免疫，有較強(qiáng)防控意識。但根據(jù)國家相關(guān)要求［4］，后續(xù)應(yīng)根據(jù)不同防控階段，制定實(shí)施科學(xué)免疫方案，逐步實(shí)現(xiàn)從免疫控制到免疫退出，有效控制、逐步消滅高致病性豬藍(lán)耳病。

表1 2021 年豬藍(lán)耳病血清學(xué)監(jiān)測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 病原學(xué)檢測

對564 個場點(diǎn)的6 457 份樣品進(jìn)行檢測，病原學(xué)陽性188 份，陽性率2.91%；陽性場點(diǎn)112 個，場陽性率19.86%，具體結(jié)果見表2。陽性樣品分布在16 個州市53 個縣。由表2 可知，2021 年云南省豬藍(lán)耳病病原學(xué)陽性率總體維持在較低水平，防控工作取得顯著成效，但除農(nóng)貿(mào)市場外均能監(jiān)測到病毒核酸陽性，特別是屠宰場場陽性率高達(dá)38.71%，說明污染面依然較廣，防控難度大，發(fā)生散發(fā)疫情的風(fēng)險仍然存在。后續(xù)應(yīng)以養(yǎng)殖場（戶）為防治主體，疫病凈化為防治重點(diǎn)，不斷完善生物安全體系，嚴(yán)格落實(shí)免疫預(yù)防、監(jiān)測凈化、檢疫監(jiān)管、應(yīng)急處置、無害化處理等綜合防治措施，積極開展場群或區(qū)域凈化工作，壓縮流行范圍，逐步實(shí)現(xiàn)凈化目標(biāo)［5，6］。

表2 2021 年豬藍(lán)耳病病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 分子流調(diào)

選取2 個陽性樣品測序毒株進(jìn)行ORF7基因系統(tǒng)發(fā)育分析，所選毒株之間同源性為98.5%，與云南省2017—2020 年毒株的同源性為98.1%～98.5%。所選毒株與國外參考毒株同源性為88.6%～92.9%（圖1）。

圖1 ORF7 基因系統(tǒng)發(fā)育分析

選取13 個陽性樣品測序毒株進(jìn)行Nsp2基因系統(tǒng)發(fā)育分析，所選毒株之間同源性為97.7%～100%，與云南省2017—2020 年毒株的同源性為93.2%～97.3%。所選毒株與國外參考毒株同源性為93.9%～97.3%（圖2）。

圖2 Nsp2 基因系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

分子流調(diào)結(jié)果顯示，云南省PRRSV 流行株依然屬于美洲株JXA1 分支。其中ORF7基因與國外流行毒株同源性最低不到90%，表明美洲型PRRSV N蛋白核苷酸發(fā)生了變異，與劉志玲等［7］、賈懷杰等［8］研究結(jié)果相吻合，要嚴(yán)防美洲變異流行株傳入中國；Nsp2基因?qū)儆赑RRSV 全基因組高變區(qū)，毒株復(fù)雜但此次監(jiān)測云南省流行株變異相對保守，部分核苷酸位點(diǎn)突變對疫苗保護(hù)力及編碼蛋白表達(dá)的影響有待進(jìn)一步研究。

相較于北方以規(guī)?；B(yǎng)殖為主的畜牧體系，南方特別是農(nóng)村點(diǎn)狀散養(yǎng)為主的畜牧體系使得凈化防控難度加大，提高散養(yǎng)戶科學(xué)飼養(yǎng)意識，加強(qiáng)生豬調(diào)運(yùn)監(jiān)管需要多方共同努力［9，10］。后續(xù)仍需持續(xù)做好PRRS 的監(jiān)測流調(diào)工作，及時、全面、準(zhǔn)確掌握云南省PRRS 的病原分布、流行情況及免疫效果，以期為云南省未來有序分批開展PRRS 的凈化提供參考與數(shù)據(jù)支持。