湖北省獼猴桃周年病害病原菌鑒定分析

鄧 蕾，潘 慧，李文藝，趙昆松，鐘彩虹，李 黎

（1.中國科學院植物種質創(chuàng)新與特色農業(yè)重點實驗室/中國科學院獼猴桃產業(yè)技術工程實驗室/中國科學院武漢植物園，武漢 430074；2.湖北省農業(yè)農村廳果茶辦公室，武漢 430000）

獼猴桃果實富含維生素、氨基酸及多種礦質元素，營養(yǎng)豐富，是中國山區(qū)農民精準脫貧的特色優(yōu)勢樹種。湖北省地處長江中游，位于北緯29°05＇—33°20＇，東經108°30＇—116°10＇，氣候溫暖濕潤，自然條件優(yōu)越，獼猴桃種質資源豐富，蘊藏量大，新西蘭早期選育的品種如海沃德等均起源自湖北省宜昌市夷陵區(qū)霧渡河鎮(zhèn)［1］。豐富且優(yōu)異的獼猴桃資源優(yōu)勢對發(fā)展湖北省山區(qū)經濟具有重要的現實意義。4 個已形成的獼猴桃生產區(qū)（秦巴山、幕阜山、武陵山及大別山生產區(qū)）的面積占全省栽培面積80%以上，主要分布在咸寧赤壁、宜昌夷陵、隨州曾都、廣水、恩施建始、咸豐、鶴峰、黃岡英山等地［2］。至2019 年，全省60 多個縣市的130 多家企業(yè)種植獼猴桃，種植總面積約1.33 萬hm2，結果面積約5 000 hm2，年產量約6 萬t，每公頃平均產值75 000 元，年農業(yè)產值超15億元，栽培品種主要有金魁、紅陽、金桃、金艷及建香等［3］。湖北省獼猴桃種植面積占全國獼猴桃栽培面積近10%，在中國主產區(qū)中排名第十位。

雖然湖北省在獼猴桃資源收集、評價和種質創(chuàng)新等方面的研究處于全國領先水平，但全省獼猴桃產業(yè)水平、品種結構、栽培管理及營銷策略等明顯落后于陜西省、四川省等地［4］。2018 年8 月湖北省農業(yè)農村廳展開了農業(yè)科技創(chuàng)新行動——“特色水果生態(tài)高效栽培與采后處理項目”，并出臺了《湖北省推進獼猴桃產業(yè)高質量發(fā)展實施方案》，省財政撥付專項資金支持該省各縣市發(fā)展獼猴桃，力爭在2022年將湖北省獼猴桃產業(yè)打造成繼柑橘、桃、梨之后的第四大特色水果產業(yè)。得益于該政策，湖北省一些貧困地區(qū)依靠獼猴桃種植帶動脫貧致富效果顯著，其中建始、宜昌、咸寧、浠水等市縣均已形成了一定的獼猴桃產業(yè)規(guī)模，并取得了較好的經濟效益。

然而，在獼猴桃產業(yè)迅猛發(fā)展的同時，多項研究報道湖北省獼猴桃病害問題日益突出，亟需盡快啟動全面病害調研及鑒定工作。楊清平等［5］研究發(fā)現湖北省獼猴桃主要病害有潰瘍病、花腐病、黑斑病、根腐病、黃化病及根結線蟲病等，并分別就各種病害的危害癥狀、發(fā)生規(guī)律及有機病害治理技術進行了介紹。鄭麗等［6］結合生產實踐經驗制定了湖北省獼猴桃綠色生產技術，其中包括了潰瘍病、褐腐病、褐斑病、藤腫病等病害，葉蟬、蝽象、金龜子、小綠葉蟬及介殼蟲等蟲害的防治方法。戢小梅等［7］調查發(fā)現，武漢市獼猴桃病蟲害主要為軟腐病、褐斑病及蝙蝠蛾。然而，以上研究均以病害癥狀觀察、總結經驗為主，尚未開展全面系統(tǒng)的病原菌鑒定。在此基礎上，2019—2020 年，中國科學院武漢植物園對湖北省赤壁、十堰、武漢、咸豐、宜昌及建始市6 個地區(qū)進行了周年感病樣本的采集及病菌類型鑒定，了解各地區(qū)的病害類型及危害程度，為后期開展病害預測及制定綜合防治方案奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 獼猴桃感病樣本采集

2019—2020 年4 月、6 月及11 月，分別對赤壁、十堰、武漢、咸豐、宜昌及建始市6 個地區(qū)共計49 個獼猴桃園區(qū)進行了春季、夏季及秋冬季病害調查及樣本采集工作（表1）。主要栽培品種均為紅陽、金艷、東紅、翠玉等，具體園區(qū)所在地區(qū)見表1。采樣期間，觀察到獼猴桃細菌性潰瘍病、真菌性軟腐病、灰斑病、褐斑病、黑斑病、根腐病及炭疽病等癥狀（圖1）。

圖1 湖北省部分獼猴桃栽培園區(qū)的主要病害感病癥狀

續(xù)表1

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)

1.2.1 細菌性病原菌的分離和培養(yǎng) 運用打孔器取3 片直徑為1 cm 的病健交界處葉片組織，70%乙醇消毒后置于含400 μL 10 mmol/L MgSO4和2 粒鋼珠的1.5 mL 離心管中進行勻漿及梯度稀釋，取100 μL濃度為10-4mmol/L 的菌懸液涂布在KB 固體培養(yǎng)基上，置于27～28 ℃培養(yǎng)2 d 后劃線分離。取陰性單菌落保存，每個樣本重復3 次。

1.2.2 真菌性病原菌的分離和培養(yǎng) 對于感病葉片，運用打孔器取3 片直徑1 cm 的病健交界處葉片組織，70%乙醇消毒。對于感病果實，切取病健交界處的果肉組織。隨后，分別將上述組織置于25 ℃的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，待菌落出現后挑取菌絲尖端于新PDA 平板上純化直至獲得純菌株，每個樣本重復3 次。

1.3 病原菌的分子生物學鑒定

1.3.1 細菌菌落PCR挑選新鮮菌落于20 μL 無菌水中98 ℃裂解10 min，吸取2 μL 上清液作為DNA模板。根據Rees-George 等［8］方法，運用Psa 特異引物PsaF1（5＇-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3＇）和PsaR2（5＇-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3＇）對各菌株進行分子鑒定。反應體系為10 μL，其中含Mg2+的10×PCR buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，1.10 g/mL DMSO 0.2 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，菌落模板2 μL，100 μmol/L PsaF1 和PsaR2引物各0.1 μL，無菌去離子水6.3 μL。PCR 擴增反應程序為94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。利用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR 擴增產物，Psa 菌株可擴增出280 bp 的目的條帶。

1.3.2 真菌ITS 鑒定 在25 ℃條件下，將真菌純菌株在PDA 平板上培養(yǎng)5 d 后取5 塊直徑5 mm 的菌餅置于40 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)5～8 d 后收集菌絲。提取基因組，將DNA 置于-20 ℃下備用。采用核糖體基因組轉錄間隔區(qū)通用引物ITS4/ITS5（ITS5：5＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3＇ ；ITS4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）對DNA 進行PCR 擴增。反應體系為40 μL，其中含Mg2+的10×PCR buffer 4 μL，100 μmol/L 引物各0.2 μL，5U/μLTaq酶0.25 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，1.10 g/mL DMSO 0.8 μL，DNA模板2 μL，無菌去離子水31.75 μL。PCR 擴增反應程序為94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶為600 bp 的PCR 產物送華大基因公司測序，并將測序結果在NCBI 中進行Blast 源性相似差異性分析，以確定該菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃感病癥狀分析

在部分獼猴桃栽培園區(qū)觀察到疑似細菌性潰瘍病及真菌性軟腐病、灰斑病、褐斑病、黑斑病、炭疽病和根腐病的感病癥狀（圖1）［9，10］。潰瘍病感病癥狀：葉片上出現不規(guī)則褐色斑點，部分品種的感病葉片伴隨3～5 mm 明顯的黃色暈圈。褐斑病感病癥狀：葉片上出現3～15 mm 近圓形至不規(guī)則形的褐色病斑，病斑中央顏色比邊緣淺，呈靶點狀。黑斑病感病癥狀：葉片背面或果實表面著生黑色絨毛狀霉斑，后期感病部分果肉呈褐色壞死狀并形成錐形硬塊。炭疽病感病癥狀：葉緣略向葉背卷縮，病斑中間為灰白色，邊緣深褐色。軟腐病感病癥狀：發(fā)病部位出現大拇指壓痕斑，凹陷部病部中心果肉呈乳白色，周圍果肉呈黃綠色水漬狀。

2.2 細菌性病原菌的鑒定結果

春季細菌性病原菌的鑒定結果顯示，大部分獼猴桃栽培園葉片樣本均攜帶細菌性潰瘍病病原菌（圖2）。

圖2 部分獼猴桃感病園區(qū)樣本PsaF1/PsaR2 菌落PCR擴增結果

2.3 真菌性病原菌的測序結果及預測病害

在各獼猴桃栽培園區(qū)感病樣本上均分離到多種真菌（圖3），代表性的真菌菌株有鏈格孢菌、葡萄莖枯病菌、小孢擬盤多毛孢、球黑孢菌、葡萄座腔菌、菜豆間座殼菌等。夏季及秋冬季的具體菌株種類及各采樣點的預測病害見表1。

圖3 6 種代表性真菌菌株的菌落形態(tài)

3 小結與討論

協同創(chuàng)新是指以知識增值為核心，為了實現重大科技創(chuàng)新，政府、企業(yè)、知識生產機構（高校、研究機構）、中介機構和用戶共同開展的大跨度整合的創(chuàng)新組織模式。針對湖北省獼猴桃產業(yè)發(fā)展的重大需求，湖北省政府聯合中國科學院武漢植物園、湖北省農業(yè)科學院果樹茶業(yè)研究所及華中農業(yè)大學協同創(chuàng)新整合現有資源，將新的研究技術運用到生產實踐中，助力湖北省獼猴桃產業(yè)快速穩(wěn)步發(fā)展。此次調查結果顯示，湖北省獼猴桃春季病害主要為細菌性潰瘍病，夏季及秋冬季主要病害有真菌性軟腐病、褐斑病、灰斑病、炭疽病、黑斑病及根腐病，與貴州六盤水、浙江泰順等地的病害規(guī)律基本一致［11，12］。

調研發(fā)現，湖北省產業(yè)存在抗性品種結構不合理，未形成區(qū)域化布局的問題。部分種植戶因部分紅心品種風味好、經濟價值高，在選擇品種時未綜合考慮種植地生態(tài)環(huán)境與品種適應性，因此，湖北省部分高海拔園區(qū)大規(guī)模種植潰瘍病易感品種，如紅陽，且將園區(qū)建在風口處或山坳中間，冬季極低溫較低，導致潰瘍病發(fā)生嚴重，對該病害的防治已成為湖北省獼猴桃產業(yè)中的關鍵問題。因此，建議將易感區(qū)域的老園區(qū)品種重新改接成高抗且耐粗放管理的品種，如翠玉、金魁等；新發(fā)展園區(qū)根據園區(qū)實際情況選擇合適的栽培品種，并應根據品種特性進行園區(qū)管理及病蟲害防治工作。此外，該病菌主要由帶菌苗木及花粉運輸傳播，部分園區(qū)對病蟲害防治意識不足，隨意從疫區(qū)引進接穗及花粉材料，導致潰瘍病發(fā)生嚴重。該病害的感病癥狀發(fā)生在枝干高發(fā)期、花期及開花后、葉片發(fā)病高峰及采果后、落葉前及冬季清園幾個時期，可根據“兩前兩后”三位一體精準防控技術進行周年防治［13，14］。

獼猴桃病害的類型和發(fā)生程度與園區(qū)管理存在緊密聯系。此次調研發(fā)現，部分園區(qū)栽植密度過大、濕度大、郁蔽、棚架低矮、冬季修剪及清園不仔細，導致葉部及果實的真菌病害嚴重；部分園區(qū)根頸或嫁接口栽植過深、起壟方式錯誤、土壤板結、排水不暢，導致根腐嚴重。其中，果實軟腐病是獼猴桃產業(yè)中較嚴重的真菌病害，在枝條上潛伏越冬，翌年早春花期時侵染花蕾，幼果形成時由花蕾轉移至幼果上，潛伏在表皮下，一般在貯藏期間才逐漸顯現病癥［15］。已確定的果實軟腐病菌種類包含葡萄座腔菌（B.dothidea）、擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsissp.）、擬莖點霉菌（Diaporthesp.）、鏈格孢菌（A.alternata）［16，17］、球黑孢（N.sphaerica）［18］及小新殼梭孢菌（N.parvum）等［19］。湖北省多個采樣點均鑒定出上述致病菌，可見多個園區(qū)內潛伏著軟腐病菌，需對該病進行重點防治。此外，擬盤多毛孢菌會引起灰斑?。?0］，鏈格孢菌及棒曲霉菌（Corynespora cassiicola）會引起褐斑病［21］，稻黑孢N.oryzae和D.glomerata會引起黑斑病和褐斑?。?2，23］；鐮刀菌（F.lateritium）會引起根腐?。?4］；膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、C.boninense會導致炭疽病發(fā)生［25］，對于發(fā)現了上述真菌病菌的園區(qū)也需要進行針對性的防治。

總體而言，對湖北省獼猴桃病害進行了周年調查及主要病原菌類型鑒定，為各區(qū)域后期進行準確的病害預測預報及高效的綜合防治奠定了理論基礎?；诒狙芯拷Y果，建議湖北省通過技術培訓增加種植戶對園區(qū)管理及病蟲害防控方面的知識，指導種植戶選用優(yōu)質抗病品種和砧木，做好園區(qū)管理，控制產量，培育樹勢，注意土壤改良、加強排水設施及修剪、減少獼猴桃種植或套作密度、避免栽植過深，抓住采果后及冬春季治療關鍵期進行防治，農業(yè)防治與化學/生物防治結合，減少病害對湖北省獼猴桃產業(yè)的危害。