杜仲藤水提物的抗炎、降血脂作用

黃 浩，青 冰，譚雨坪，廖國富，鐘 文

（1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200）

杜仲藤系夾竹桃科植物杜仲藤（Parabarium micranthum（A.DC.）Pierre）的莖皮和根皮，別名紅杜仲、藤杜仲，毛杜仲藤、土杜仲、九牛藤等，分布于廣西、廣東、云南等地，味苦、微辛，微溫，小毒，歸肝、腎經(jīng)［1，2］。具有祛風(fēng)濕、強筋骨的功能，主治風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、跌打損傷［3，4］。杜仲藤含有黃酮類、酚類、生物堿、有機酸及糖類等有效成分［5，6］，使其在抗炎、抗氧化、降脂等方面具有潛在的應(yīng)用前景。杜仲藤作為常用中藥，具有祛風(fēng)濕、強筋骨的功能，還具有抗炎、降脂和抗氧化等作用，用于各種風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、炎癥、高血脂癥等防治。鮮有杜仲藤抗炎、降血脂作用的相關(guān)研究報道，通過研究杜仲藤藥材水提物的抗炎、降血脂作用，為該藥材的進一步研究和開發(fā)應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物試劑

角叉菜膠（No.YY21752，上海源葉生物科技有限公司）；MDA（丙二醛）試劑盒（No.202101）、SOD（超氧化物歧化酶）試劑盒（No.202104）、NO（一氧化氮）試劑盒（No.202102）；醋酸地塞米松（No.210115，規(guī)格0.75 mg，浙江仙琚制藥股份有限公司）；伊文思藍（No.20210725，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；辛伐他汀片（涿州東樂制藥有限公司，批號202190404）。甘油三酯（TG）試劑盒（南京建成生物工程技術(shù)研究所，No.2104102）；總膽固醇（TC）試劑盒（南京建成生物工程技術(shù)研究所，No.2104102）；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（南京建成生物工程技術(shù)研究所，No.2104061）；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（南京建成生物工程技術(shù)研究所，No.2104092）。

1.2 器材

紫外可見分光光度計（元析UV-8000）；多功能酶標儀（Biotek SYNERGY H1M）；電子天平（良平JY10002）。

1.3 試驗動物

雄性昆明種小鼠（KM）180 只，體重18～22 g；雄性SPF 級SD 大鼠60 只，體重180～220 g，均購買于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為No.SCXK 桂2014-0002。試驗前在實驗室適應(yīng)飼養(yǎng)4 d，試驗鼠分籠飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，濕度62%±5%，室溫（23±2）℃，動物常規(guī)飼養(yǎng)，自由進食和飲水。

1.4 試驗方法

1.4.1 杜仲藤水提物的制備及高脂飼料的配方及配制 取杜仲藤粗粉5 kg，加純水回流提取2 次，第一次提取時間為1.5 h，加水倍量為10 倍，第二次提取時間為1 h，溶劑倍量為8 倍，過濾，合并濾液，減壓濃縮，再置水浴鍋上揮干水分，稱量，計算得膏率。高脂飼料購買于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，由10.0%豬油、1.0%膽固醇、0.2%膽酸鈉、3.0%蔗糖和5.0%蛋黃粉組成，在80 ℃烘箱內(nèi)烘干。

1.4.2 杜仲藤水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 飼養(yǎng)3 d 后，隨機取雄性昆明種小鼠60 只，小鼠體重18～22 g，每組10 只，隨機分為6 個試驗組，分別設(shè)空白組、模型組、陽性組（地塞米松5 mg/kg）、杜仲藤水提物高劑量組（40 g/kg）、中劑量組（20 g/kg）、低劑量組（10 g/kg）。每天1 次灌胃給藥，劑量為1 mL/50 g，連續(xù)給藥喂養(yǎng)7 d，空白組和模型組灌胃等體積純水，最后一次給藥1 h 后，除空白組外，其他試驗組在小鼠右耳正反2 面涂上10 μL 二甲苯致炎，15 min 后處死小鼠，剪下小鼠兩耳，在2 耳相同部位用6 mm 打孔器等面積打下圓耳片，精密稱重，計算腫脹度和腫脹抑制率。計算公式，腫脹度（mg）=右耳（mg）-左耳（mg），腫脹抑制率=（模型組腫脹度-給藥組腫脹度）/模型組腫脹度×100%。

1.4.3 杜仲藤水提物對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 隨機選取雄性昆明種小鼠60 只，按體重隨機分為6 組，每組10 只，分組、給藥方法同1.4.2。最后1 次灌胃給藥1 h 后，空白組給予生理鹽水（1 mL/100 g）尾靜脈注射，同時使用生理鹽水（0.2 mL/20 g）注射小鼠腹腔；其他試驗組給予0.3%伊文思藍溶液（1 mL/100 g）尾靜脈注射，同時使用0.6%冰醋酸溶液（0.2 mL/20 g）注射小鼠腹腔，15 min 后處死小鼠，注射生理鹽水6 mL 沖洗腹腔，輕揉腹部1 min，剪開小鼠腹腔吸取腹腔液，離心10 min（2 500 r/min），吸取上清液至比色皿中，在590 nm處，使用紫外可見分光光度計測定其吸光度［7］。

1.4.4 杜仲藤水提物對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹及炎性部位中MDA、SOD、NO 含量的影響 選取雄性昆明種小鼠60 只，按體重隨機分為6 組，每組10 只，分組、給藥方法同1.4.2。最后1 次灌胃給藥1 h 后，空白組給予注射生理鹽水0.02 mL 到小鼠右后足趾部皮下，其他試驗組注射1%角叉菜膠溶液0.02 mL到小鼠右后足趾部皮下致炎，致炎15 min 后處死小鼠，剪取后雙足相同部位，稱重，并計算腫脹抑制率。隨后剪碎右足，取4 mL 生理鹽水浸泡［7］。手動研磨勻漿后，離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，取離心后的上清液凍存于-20 ℃條件下。試驗操作參照試劑盒說明書，使用Elisa（酶聯(lián)免疫吸附測定）方法測定MDA、NO 含量和SOD 活性。

1.4.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 剖取小鼠足跖組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定脫鈣、脫水、包埋、切片、HE 染片后封片，觀察踝關(guān)節(jié)病理改變情況并拍照。

1.4.6 杜仲藤水提物對SD 雄性大鼠高脂血癥的影響 隨機取SD 雄性大鼠60 只，分為6 個試驗組，每組10 只，隨機分為陽性組（辛伐他?。⊿im）、模型組、空白組和杜仲藤水提物高、中、低劑量組?？瞻捉M飼以基礎(chǔ)飼料和飲用自來水，模型組、陽性組（辛伐他?。⊿im）和杜仲藤水提物高、中、低劑量組飼以高脂飼料和飲用自來水。陽性組（辛伐他?。⊿im）根據(jù)體重以每天10 mL/kg 的量給予辛伐他汀溶液（0.4 mg/mL）；杜仲藤水提物高劑量組（40 g/kg）、中劑量組（20 g/kg）、低劑量組（10 g/kg）以每天10 mL/kg 的量給予藥材水提物的CMC-Na 溶液，模型組和空白組根據(jù)體重給予10 mL/kg 的CMC-Na 溶液［8］。每3 d 稱1 次體重，28 d 后，禁食不禁水12 h，腹主動脈取血，分離血清10 min（3 000 r/min），按照試劑盒說明書，全自動生化儀測定血清中指標TC、TG、LDL-C 和HDL-C 的含量水平。

1.5 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 21.0 軟件，數(shù)據(jù)資料結(jié)果以均數(shù)±標準差的形式表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲藤水提物對小鼠耳腫脹的影響

杜仲藤水提物對小鼠耳腫脹的影響結(jié)果見表1。由表1 可知，與模型組相比，除低劑量組外，陽性組、杜仲藤水提物中、高劑量組均小鼠耳腫脹有顯著抑制作用（P＜0.05）；與陽性組相比，模型組、杜仲藤水提物低劑量組小鼠耳腫脹度顯著增高（P＜0.05）。陽性組、杜仲藤水提物中、高劑量組腫脹抑制率均顯著高于模型組（P＜0.05）。

表1 小鼠耳腫脹結(jié)果（n=10）

2.2 杜仲藤水提物對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響

杜仲藤水提物對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響結(jié)果見表2。由表2 可知，與模型組相比，杜仲藤水提物高、中、低劑量組均能顯著抑制冰醋酸引起的小鼠腹腔毛細血管通透性增加（P＜0.05）；與陽性組相比，模型組、杜仲藤水提物低劑量組均能顯著抑制冰醋酸引起的小鼠腹腔毛細血管通透性增加（P＜0.05），杜仲藤水提物高、中劑量組抑制冰醋酸引起的小鼠腹腔毛細血管通透性增加不顯著（P＞0.05）。

表2 小鼠毛細血管通透性的試驗驗結(jié)果（n=10）

2.3 杜仲藤水提物對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹及炎性部位中MDA、SOD、NO 含量的影響

2.3.1 杜仲藤水提物對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響 與模型組相比，陽性組、杜仲藤水提物高、中、低劑量組均對化學(xué)試劑角叉菜膠造成的小鼠足跖腫脹有顯著抑制作用（P＜0.05）；與陽性組比較，模型組、杜仲藤水提物低劑量組小鼠耳腫脹度均顯著增高（P＜0.05），杜仲藤水提物高、中劑量組小鼠耳腫脹度增高不顯著（P＞0.05）；與模型組相比，陽性組、杜仲藤水提物高、中劑量組均能顯著增加腫脹抑制率（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 杜仲藤水提物對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹試驗結(jié)果

2.3.2 杜仲藤水提物對角叉菜膠致小鼠足跖炎性部位中MDA、SOD、NO 含量的影響 從表4 可以看出，與模型組相比，陽性對照組、杜仲藤水提物高、中、低劑量組均能顯著降低小鼠足跖炎性部位中MDA、NO含量（P＜0.05）、顯著增高SOD 含量水平（P＜0.05），這表明杜仲藤水提物能顯著降低MDA、NO 含量，提高SOD 活力；與陽性組相比，杜仲藤水提物低劑量組能顯著升高小鼠足跖炎性部位中MDA、NO 含量（P＜0.05）、顯著降低SOD 含量（P＜0.05）。

表4 杜仲藤水提物對角叉菜膠致小鼠足跖炎性部位的MDA、SOD、NO 含量的影響

2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察

對各個組別小鼠足跖組織進行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，空白組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，關(guān)節(jié)腔無滲出，滑膜細胞整齊排列；陽性組和杜仲藤水提物高劑量組關(guān)節(jié)軟骨光滑，關(guān)節(jié)腔內(nèi)見少量滲出物，滑膜細胞整齊，見少許炎性細胞浸潤；隨著杜仲藤水提物劑量的增加，癥狀有一定緩解。

圖1 組織形態(tài)學(xué)觀察

2.5 建立大鼠高脂血癥模型

高脂飼料建立大鼠高脂血癥模型，高脂飼料30 d 后的模型大鼠體重增值、TC、TG 顯著高于空白組，HDL-C 顯著低于空白組（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表5。

2.6 杜仲藤水提物對SD 大鼠高脂血癥的影響

與模型組大鼠相比，陽性組、杜仲藤水提物高、中、低劑量組均能顯著降低大鼠血清的TC、TG 和LDL-C 含量（P＜0.05），HDL-C 含量變化不明顯。與陽性組相比，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C 含量顯著升高（P＜0.05），HDL-C 含量變化不明顯；空白組大鼠血清中TC 和LDL-C 含量顯著降低（P＜0.05），TG 和HDL-C 含量變化不明顯（表6）。

表6 高脂血癥大鼠TC、TG、HDL-C 和LDL-C 含量水平的結(jié)果 （單位：mmol/L）

3 小結(jié)

NO 是機體中重要的炎癥介質(zhì)，能夠誘導(dǎo)機體促炎因子的產(chǎn)生。SOD 具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)的抗氧化酶及其清除自由基的首要物質(zhì)。杜仲藤水提物通過降低MDA、NO 含量，提高SOD 含量發(fā)揮抗炎作用。杜仲藤水提物在機體炎癥中均顯示出良好的抗炎活性，具有明顯的抗炎作用。

杜仲藤藥材提取物抗炎、降血脂作用相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，杜仲藤提取物有明顯的抗炎、降血脂調(diào)節(jié)作用。杜仲藤水提物都能明顯降低大鼠血清中的TC、TG 和LDL-C 含量、增加HDL-C 含量，表明杜仲藤可能含有某種或一類活性成分刺激免疫系統(tǒng)、促進血液的凈化能力，加快清除血液垃圾等生物學(xué)功能，對生物組織產(chǎn)生的降血脂作用起很好的機體調(diào)節(jié)功能。該研究為杜仲藤的臨床應(yīng)用的有效性及安全性提供科學(xué)理論依據(jù)；不僅在探討杜仲藤對炎癥及其降血脂作用方面有重要的理論價值，還可通過杜仲藤提取物的有效成分，發(fā)現(xiàn)新的抗炎、降血脂的活性單體對重大疾病防治作用，也將為探索相關(guān)炎癥、降血脂相關(guān)疾病的藥物防治提供更好的解決途徑。