嗜熱菌篩選及其腐熟菌劑制備和應(yīng)用

張智英，張 旭，林 童，解春艷，孫月雙，張旺林

（1.黃驊市自然資源和規(guī)劃局，河北黃驊 061100；2.滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所有限公司，河北滄州 061001；3.廊坊師范學(xué)院，河北廊坊 065000；4.滄州市農(nóng)林科學(xué)院，河北滄州 061001）

中國是食用菌生產(chǎn)大國，食用菌年產(chǎn)量超過4 000 萬t，占世界食用菌總產(chǎn)量的70%以上，是中國農(nóng)業(yè)的重要產(chǎn)業(yè)［1-3］。食用菌栽培基質(zhì)出菇率約為5∶1，每年產(chǎn)生食用菌基質(zhì)約2 億t。無論使用生料栽培還是熟料栽培，食用菌基質(zhì)都需高溫滅菌處理后再接種食用菌菌種，而該過程需要消耗大量的熱能，不僅增加了食用菌的生產(chǎn)成本，也增加了環(huán)境壓力。

堆肥是有機固體廢棄物無害化處理與資源化利用的重要手段，其實質(zhì)是有機物在微生物作用下分解代謝，促進有機物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時殺滅廢棄物中的病原菌等有害生物［4，5］。堆肥不僅能夠解決有機固體廢棄物帶來的環(huán)境污染，而且可以將有機肥固體廢棄物轉(zhuǎn)化為有機肥，對保持和提高土壤肥力、促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義［6-8］。但常規(guī)微生物發(fā)酵堆肥腐熟后的食用菌基質(zhì)還不能免去加熱高溫滅菌的步驟，無法實現(xiàn)腐熟發(fā)酵后的基質(zhì)直接進行食用菌接種。

嗜熱菌是生活在高溫環(huán)境中的微生物，廣泛存在于地?zé)釡厝?、火山口、人工水熱環(huán)境和高溫好氧堆肥中，其細胞和酶蛋白獨特的耐熱性和與之相適應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)，使其成為可在高溫環(huán)境中利用的重要微生物資源［9，10］。與常規(guī)微生物接種劑相比，好氧堆肥過程中添加嗜熱菌菌劑具有更高的微生物代謝活性和有機肥降解速率，能夠加快有機廢棄物堆肥進程、更徹底地完成廢棄物的無害化，在固體有機廢棄物處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和科學(xué)價值［11，12］。

本研究從溫泉樣品中分離、篩選出1 株耐高溫菌株，并對菌株進行了生物學(xué)鑒定、嗜熱性能檢測、腐熟菌劑制備及堆肥性能檢測，發(fā)現(xiàn)該嗜熱菌高溫適應(yīng)性強，適合的溫度范圍廣，能夠分泌纖維素酶和蛋白酶，能夠分解固體有機物料中的纖維素類物質(zhì)。堆肥腐熟后的食用菌基質(zhì)栽培試驗發(fā)現(xiàn)，該嗜熱菌腐熟菌劑能夠有效改善平菇栽培基質(zhì)的出菇情況，本研究可為食用菌栽培提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

嗜熱菌篩選試驗樣品采集于臺灣省文山溫泉。種子均購自中國科學(xué)研究院（入袋發(fā)芽率≥80%），試驗前需進行種子發(fā)芽率的測定，檢驗其是否滿足80%以上標(biāo)準(zhǔn)。其他試驗試劑均采購于中國醫(yī)藥集團有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

DHG 電熱鼓風(fēng)干燥箱（一恒科學(xué)儀器有限公司），YP6000N 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器公司），SPX-250 型生化培養(yǎng)箱，HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，SKD-1000 型全自動凱氏定氮儀，TDZ4-WS 型電動離心機，LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制 ZoBell2216E 固體培養(yǎng)基，蛋白胨5.00 g、酵母膏1.00 g、磷酸高鐵0.01 g、瓊脂18.00 g，陳海水定容至1 L，用5%煮沸氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.8。121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基，酵母提取物5.00 g、蛋白胨10.00 g、氯化鈉10.00 g，去離子水定容至1 L，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。固體LB 培養(yǎng)基需添加18.00 g 瓊脂。

剛果紅羧甲基纖維素培養(yǎng)基，磷酸氫二鈉1.20 g、磷酸二氫鉀0.90 g、硫酸鎂0.50 g、氯化鉀0.50 g、酵母浸粉0.50 g、酸水解酪蛋白0.50 g、剛果紅0.20 g、羧甲基纖維素鈉5.00 g、瓊脂15.00 g，去離子水定容至1 L，121 ℃高溫高壓滅菌15 min。

1.3.2 菌種初步篩選 從臺灣省文山溫泉區(qū)采集溫泉樣品，溫泉溫度72 ℃。將樣品逐級稀釋，分別取稀釋后的樣品100 μL 涂布于ZoBell2216E 固體培養(yǎng)基上，60 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中培養(yǎng)。挑取生長迅速的菌落在LB 平板上進行5 次劃線分離純化獲得嗜熱菌純培養(yǎng)菌株。將菌株進行5 次平板傳代后，每個菌株挑取5 個單菌落在60 ℃下培養(yǎng)，確定菌株高溫生長特性的遺傳穩(wěn)定性，獲得穩(wěn)定遺傳的嗜熱菌株。

1.3.3 纖維素酶活篩選 將篩選獲得的嗜熱菌株在LB 培養(yǎng)基上、60 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h 后分別接種于剛果紅羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上，測量60 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 后嗜熱菌的菌落直徑和水解圈直徑，篩選菌株。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定 按照細菌基因組DNA 提取試劑盒方法提取菌株基因組DNA，以原核生物通用引物27f 上游（5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3＇）和1492r 下游（5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇）引物擴增16S rRNA 基因。電泳檢測擴增產(chǎn)物的純度和大小，將擴增長度正確的PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，并在NCBI 進行BLAST對比。

1.3.5 腐熟菌劑制備 菌種活化，將-80 ℃保存的篩選菌株劃線接種于LB 平板上，50 ℃培養(yǎng)24 h。種子培養(yǎng)，用接種環(huán)刮去LB 平板上的菌株的菌苔并接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，50 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。二級種子發(fā)酵，將上述種子培養(yǎng)液按5%的接種量接種于裝有10 L LB 液體培養(yǎng)基的種子罐中，50 ℃、200 r/min 下發(fā)酵培養(yǎng)24 h。擴大培養(yǎng)，得到的二級種子發(fā)酵液按3%的接種量接種于裝有LB 液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，50 ℃、200 r/min下發(fā)酵2 d。噴霧干燥，向擴大培養(yǎng)的發(fā)酵液中加入輕質(zhì)碳酸鈣，再對發(fā)酵液進行噴霧干燥，獲得含有嗜熱菌的腐熟菌劑。參照農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)（GB 20287—2006）［13］的方法進行嗜熱菌腐熟菌劑的檢測。

1.3.6 腐熟菌劑堆肥效果檢測 以含水量55%～65%、C/N 為20∶1，將雞糞與適量秸稈進行混合，按0.5%接種量添加腐熟菌劑，進行好氧堆肥，以接種不含嗜熱菌的腐熟菌劑的處理為陽性對照、不接種腐熟菌劑的處理為陰性對照。每天測量堆體溫度，發(fā)酵初期堆體每3 d 翻堆1 次，溫度超過60 ℃后每天翻堆，翻堆前測定堆溫，并于堆溫降至40 ℃后測定堆肥的C/N 比、有機質(zhì)、種子發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)判定堆肥的腐熟度。

1.3.7 C 含量檢測 采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法［14］測定堆肥基質(zhì)中C 的含量。

1.3.8 N 含量檢測 采用凱氏定氮法［15］測定堆肥基質(zhì)中N 含量。

1.3.9 有機質(zhì)檢測 采用重鉻酸鉀容量法［16］對堆肥基質(zhì)中的有機質(zhì)進行檢測。

1.3.10 種子發(fā)芽率指數(shù) 將堆肥后的基質(zhì)與去離子水1∶10（m/V）混合均勻，振蕩30 min，室溫浸提1 h，3 500 r/min 離心10 min，取上清液備用。在含有濾紙片的培養(yǎng)皿中均勻地點播白菜種子，加入10 mL 上清液，25 ℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h，以去離子水為對照，測定種子發(fā)芽率及發(fā)芽種子根長，計算種子發(fā)芽指數(shù)（GI）［17］：

1.3.11 平菇栽培 將平菇栽培基質(zhì)按平菇生長要求進行配制［18］，并將物料含水量調(diào)整至60%，按0.5%接種量添加“1.3.5”制備的嗜熱菌腐熟菌劑，進行堆垛發(fā)酵，堆垛底部寬度1.5 m，高度1.2 m，頂部呈龜背型。以不接種腐熟菌劑的平菇栽培基質(zhì)為對照，每天測量堆垛溫度。

將經(jīng)過嗜熱菌腐熟菌劑處理、不加菌劑處理（對照）及高溫蒸汽滅菌處理的3 種平菇栽培基質(zhì)進行裝袋后接種平菇，接種方法和接種量相同，測定了不同處理下的基質(zhì)物料的出菇率和染菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱菌菌種的篩選及鑒定

初步篩選獲得穩(wěn)定遺傳的嗜熱菌株11 株，對11株嗜熱菌進行纖維素酶活篩選，發(fā)現(xiàn)有1 株嗜熱菌在剛果紅羧甲基纖維素平板上生長明顯，培養(yǎng)3 d 菌落直徑為0.42 cm、水解圈直徑1.04 cm，D/d 值為2.48，具有高溫分泌纖維素酶的能力。

將此嗜熱菌在不同培養(yǎng)溫度（28、37、45、55、65、75、85 ℃）的LB 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48 h 后，發(fā)現(xiàn)45、55、65、75 ℃培養(yǎng)的LB 平板上有嗜熱菌菌落出現(xiàn)，且以55 ℃和65 ℃2 個溫度生長最為旺盛，表明該菌株的最適生長溫度為55～65 ℃，生長溫度為45～75 ℃，有著較廣的溫度適應(yīng)性。通過顯微鏡觀察該嗜熱菌形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陽性，菌體長桿狀（圖1 a），中生或端生芽孢，且65 ℃培養(yǎng)24 h 可見直徑為1.5～2.5 mm 的菌落，菌落呈圓形、乳白色、邊緣規(guī)則、中央突起（圖1 b）。

圖1 嗜熱菌顯微鏡觀察結(jié)果（a）和平板培養(yǎng)（b）

將擴增的PCR 產(chǎn)物送測并在NCBI 中進行BLAST 比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與Bacillus smithii菌株的16S rRNA 基因序列相似性高達99%。綜合菌落形態(tài)及部分生理特征和16S rRNA 序列，可以確定該菌株屬于Bacillus smithii，命名為B.smithiiBV-2，并于2018 年12 月15 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌株保藏號為CGMCC No.18652。

2.2 嗜熱菌腐熟菌劑堆肥效果檢測

對制備的腐熟菌劑質(zhì)量進行檢測，結(jié)果表明，上述菌劑有效活菌數(shù)≥2×108cfu/g，符合農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)（GB 20287—2006）［13］的規(guī)定，以雞糞堆肥檢測該嗜熱菌腐熟菌劑效果。

BV-2 接種劑對堆肥溫度的影響結(jié)果見表1。由表1 可知，堆肥接種BV-2 后，最高溫度可達81 ℃，達到高溫期的時間為發(fā)酵后3 d，超過55 ℃的高溫期為7 d、超過65 ℃的高溫期為5 d；接種常溫腐熟菌劑最高溫度為68 ℃，達到高溫期的時間為建堆后4 d，超過55 ℃的高溫期為10 d、超過65 ℃的高溫期為2 d；不接種腐熟菌劑的最高溫度為59 ℃，超過55 ℃的高溫期為4 d。說明BV-2 接種劑可明顯促進堆肥前期發(fā)酵升溫，并能提高堆肥溫度、加快有機物料的腐熟轉(zhuǎn)化，使堆肥的進程加快。

BV-2 接種劑對堆肥腐熟度的影響見表2。由表2 可知，堆肥接種BV-2 后，堆肥中有機質(zhì)含量高于陰性和陽性對照，C/N 低于陰性和陽性對照，腐熟完成后測定不同堆肥處理下的種子發(fā)芽指數(shù)，其中BV-2 處理的種子發(fā)芽指數(shù)為94.2%、普通常溫發(fā)酵菌劑的種子發(fā)芽指數(shù)為89.7%，而不接種處理種子發(fā)芽指數(shù)僅為64.5%。說明BV-2 接種劑的應(yīng)用能夠加快有機物料的腐熟，保存有機物料中的營養(yǎng)成分。

表2 BV-2 接種劑對堆肥腐熟度的影響

2.3 嗜熱菌腐熟菌劑應(yīng)用

將平菇栽培基質(zhì)按平菇生長要求進行配制，以不接種腐熟菌劑的平菇栽培基質(zhì)為對照。試驗發(fā)現(xiàn)接種腐熟菌劑24 h 后堆體溫度升至50 ℃，最高溫度達到85 ℃后開始降溫。堆肥接種嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑后，最高溫度可達85 ℃，達到高溫期的時間為發(fā)酵后2 d，超過50 ℃的高溫期為4 d，超過65 ℃的高溫期為2 d。而不接種菌劑對照組的發(fā)酵最高溫度為64 ℃，超過50 ℃的高溫期為3 d，再次說明BV-2腐熟菌劑可明顯促進平菇栽培基質(zhì)發(fā)酵升溫，并提高物料的溫度、加快物料的熟化和滅菌進程。

通過測定不同處理后的基質(zhì)物料的出菇率和染菌率，并與已公開專利CN109609412A［19］中的嗜熱菌Bacillus smithiiThs1 制備的菌劑進行效果比較，結(jié)果如表3 所示。嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑處理的基質(zhì)染菌率為2.5%，低于高溫滅菌處理（4.2%）和對照（10.4%），說明嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑處理能夠有效殺死或抑制平菇栽培基質(zhì)中的雜菌，降低平菇的染菌率。

表3 不同處理方法基質(zhì)的染菌率和出菇率

從出菇情況進行統(tǒng)計，其中嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑處理基質(zhì)的出菇率為118.2%，高于高溫滅菌（108.6%）和空白對照（94.8%）。已公布的嗜熱菌Bacillus smithiiThs1 接種劑處理基質(zhì)的出菇率為103.3%，染菌率為6.7%，均比嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑處理的基質(zhì)效果差，說明嗜熱菌BV-2 能夠有效改善平菇栽培基質(zhì)的出菇情況。

3 小結(jié)

本研究從臺灣省文山溫泉區(qū)采集溫泉樣品中篩選出1 株耐高溫且具有高纖維素酶活的嗜熱菌菌株，經(jīng)過鑒定此嗜熱菌屬于Bacillus velezensis，革蘭氏陽性，好氧、菌體長桿狀、中生或端生芽孢。以此嗜熱菌制備的腐熟菌堆肥最高溫度可達81 ℃，有機質(zhì)含量和種子發(fā)芽指數(shù)比常規(guī)腐熟菌劑均提高約1.05 倍。此外，以該腐熟菌劑栽培的平菇出菇率比高溫滅菌、不添加腐熟菌劑及已有的Bacillus smithiiThs1 腐熟菌劑栽培的平菇出菇率都高，且染菌率僅為2.5%。本研究篩選的嗜熱菌BV-2 可應(yīng)用于有機固體廢棄物的高溫堆肥處理，縮短堆肥發(fā)酵周期，提高堆肥處理效率，提高堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量，且該嗜熱菌腐熟發(fā)酵處理得到的食用菌基質(zhì)可以完全代替高溫蒸汽滅菌處理得到的基質(zhì)，具有營養(yǎng)成分高、染菌率低、顯著增加食用菌出菌率的特性，改善傳統(tǒng)食用菌栽培基質(zhì)高溫高壓滅菌的弊端。