神經(jīng)病理性疼痛中表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制研究進(jìn)展

文聲昕 吳 強(qiáng) 韓亞坤 郭珊珊 唐 奕 柯 璐 何仁亮

國際疼痛研究協(xié)會(huì)將神經(jīng)病理性疼痛(neurpathic pain,NP)定義為由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的病變或疾病引起的疼痛。其常見病因有糖尿病神經(jīng)病變、脊髓損傷、病毒感染(帶狀皰疹后神經(jīng)痛)和化療等,常見癥狀為異常疼痛、痛覺過敏、自發(fā)性疼痛和感覺異常等,這些癥狀使患者出現(xiàn)睡眠障礙、焦慮,甚至抑郁。目前治療NP包括藥物干預(yù)(抗驚厥藥和阿片類藥物)、物理治療和局部神經(jīng)阻滯,但效果有限和不良反應(yīng)增多。由于NP的發(fā)病機(jī)制尚未得到充分闡明,臨床治療效果有限,故探索NP發(fā)生的分子機(jī)制具有重要意義。在傷害性感受系統(tǒng)中,表觀遺傳修飾被認(rèn)為調(diào)控分子的長期變化,在組織損傷相關(guān)疼痛的發(fā)展和維持中起著關(guān)鍵作用[1]。Waddington在1942年提出表觀遺傳這一概念,它指的是不改變DNA序列調(diào)節(jié)基因表達(dá),并在環(huán)境刺激時(shí)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過程的調(diào)控,使個(gè)體產(chǎn)生長期的影響。表觀遺傳修飾有RNA修飾、非編碼RNA、DNA甲基化和組蛋白修飾,這些修飾方式直接或間接地影響基因表達(dá)。本文將對(duì)目前NP表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為該疾病的診療提供潛在靶點(diǎn)。

一、RNA修飾

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是表觀遺傳學(xué)中RNA甲基化的一個(gè)新興領(lǐng)域,包括以METTL3、METTL14、WTAP和KIA1429為代表的寫入蛋白介導(dǎo)甲基化過程,以FTO和ALKBH5為代表的擦除蛋白介導(dǎo)去甲基化過程,以及YTH和HNRNP為代表的閱讀蛋白介導(dǎo)甲基化識(shí)別和mRNA翻譯過程[2]。m6A修飾可被不同的m6A結(jié)合蛋白YTH結(jié)合,從而調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄、剪接、輸出、翻譯和降解來影響各種生理和病理過程。近年來證據(jù)表明,m6A修飾調(diào)控基因可能參與了NP的發(fā)展和維持[3～6]。

在完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant, CFA)誘導(dǎo)的小鼠炎性疼痛模型中,METTL3介導(dǎo)的m6A修飾通過調(diào)節(jié)pri-miR-365-3p加工來調(diào)節(jié)疼痛敏化[2]。Pan等[3]選擇性下調(diào)脊髓中METTL3,這提高了脊髓中10～11易位甲基胞嘧啶雙加氧酶1(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1, TET1)mRNA和m6A的水平,從而產(chǎn)生疼痛超敏反應(yīng)。相比之下,過表達(dá)METTL3逆轉(zhuǎn)m6A的缺失,阻斷CFA誘導(dǎo)脊髓中TET1的增加,可導(dǎo)致疼痛減弱;同時(shí)YTHDF2水平降低,脊髓TET1穩(wěn)定上調(diào),這揭示下調(diào)脊髓METTL3與YTHDF2協(xié)調(diào)的新機(jī)制,即穩(wěn)定脊髓神經(jīng)元中TET1的上調(diào),有助于調(diào)節(jié)炎性疼痛。Zhang等[4]建立保留神經(jīng)損傷(spinal nerve injury, SNI)大鼠疼痛模型,通過分析METTL3和m6A甲基化表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)大鼠比較,NP大鼠中METTL3和m6A甲基化顯著下調(diào)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),METTL3通過介導(dǎo)pri-miR-150在基因498處的m6A甲基化,與YTHDF2結(jié)合加速了miR-150的成熟。而miR-150可直接靶向腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)mRNA,最終建立METTL3/miR-150/BDNF調(diào)控通路。結(jié)合臨床帶狀皰疹患者血清標(biāo)本,證明METTL3在帶狀皰疹患者中也下調(diào)。

m6A去甲基化酶FTO在周圍神經(jīng)損傷背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)中產(chǎn)生Runx1而上調(diào),通過消除Ehmt2 mRNA、穩(wěn)定Ehmt2 mRNA/G9a表達(dá)和沉默受損DRG中μ阿片受體(mu-opioid receptor, MOR)表達(dá),引起神經(jīng)損傷疼痛超敏反應(yīng)。鑒于FTO抑制劑甲氯芬那酸為非甾體抗炎藥,阻斷FTO可能在神經(jīng)性疼痛管理中具有潛在的臨床應(yīng)用[5]。在脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation, SNL)模型中,脊髓神經(jīng)元中基質(zhì)金屬蛋白酶24(matrix metalloproteinase24,MMP24)表達(dá)上調(diào)。甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序和RNA免疫沉淀測(cè)定表明,m6A減少神經(jīng)性疼痛條件下MMP24 mRNA的富集。此外,FTO與脊髓神經(jīng)元中的MMP24共定位,并在SNL后與脊髓中MMP24 mRNA結(jié)合增加[6]?？傊?在各種疼痛模型中,RNA m6A修飾介導(dǎo)了痛覺敏化的多種調(diào)節(jié)機(jī)制。這些研究不僅揭示了神經(jīng)性疼痛背后的表觀遺傳學(xué)機(jī)制,而且還為治療提供了新思路。

二、非編碼RNA

人類基因組中僅2%由蛋白質(zhì)編碼基因組成,其余約98%是非編碼基因。非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)是一組不編碼功能蛋白的RNA,具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯和穩(wěn)定性的特點(diǎn)。ncRNA主要包括microRNA(miRNA)、長ncRNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)和小核仁RNA(snoRNA)。許多研究發(fā)現(xiàn),miRNA、lncRNA和circRNA與NP的病理過程有關(guān)[7～10]。

miRNA與靶mRNA結(jié)合或直接與蛋白質(zhì)相互作用來負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA主要通過與非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合來控制基因的表達(dá),導(dǎo)致mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯。在NP誘發(fā)的疼痛基因中,80%受miR-183家族的調(diào)控。此外,miR-18a、miR-19a、miR-19b和miR-92a簇成員的過表達(dá)可引起機(jī)械性異位痛,而阻斷這些miRNA可減少神經(jīng)損傷引起的機(jī)械性異位痛。miR-17-92簇主要通過下調(diào)DRG中的多個(gè)KV通道來引起疼痛[7]。lncRNA linc00311在NP大鼠脊髓中表達(dá)顯著上調(diào),降低其可抑制STAT3活化而下調(diào)免疫炎性細(xì)胞因子及(Ca2+)i水平,從而降低疼痛閾值[11]。Du等[8]鑒定了一種保守的lncRNA,命名為神經(jīng)損傷特異性lncRNA(NIS-lncRNA)。

DRG中ELF1是一種與NIS-lncRNA啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,能誘發(fā)NIS-lncRNA上調(diào),從而促進(jìn)受損的DRG神經(jīng)元中Fus觸發(fā)CCL-2基因表達(dá),有助于神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的傷害性超敏反應(yīng)的發(fā)展和維持。由此可見,NIS-lncRNA可能是NP的內(nèi)源性引發(fā)劑,可為NP的診療提供潛在靶點(diǎn)。另外,神經(jīng)損傷誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)特異性富集的長鏈非編碼RNA(DS-lncRNA)的下調(diào)促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄輔因子RALY與RNA聚合酶Ⅱ(RNP Ⅱ)和Ehmt2基因啟動(dòng)子的結(jié)合,增加Ehmt2 mRNA和G9a蛋白的表達(dá),下調(diào)包括Oprm1 mRNA和MOR在內(nèi)的許多疼痛相關(guān)基因,并引起神經(jīng)性疼痛[9]。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,SNL大鼠3、7、10、14天后脊髓中circAnks1a的表達(dá)明顯上調(diào)。

SNL大鼠的疼痛行為可以通過siRNA下調(diào)circAnks1a來緩解,其機(jī)制是通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子B的表達(dá)以降低SNL大鼠脊髓的興奮性來緩解NP。Cao等[12]使用患有帶狀皰疹后神經(jīng)痛(post herpetic neuralgia, PHN)患者的皮膚來研究PHN中miRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PHN患者皮膚中的miR-4506、hsa-miR-1258和hsa-miR-330-5p上調(diào)超過5倍。綜上所述,ncRNA的發(fā)現(xiàn)為NP的診斷和治療帶來了新的前景,關(guān)于作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

三、DNA甲基化

DNA甲基化通過多種機(jī)制抑制基因轉(zhuǎn)錄。甲基-cpg結(jié)合域(methylated DNA binding domain, MBD)蛋白家族作為轉(zhuǎn)錄抑制因子或輔助抑制因子的對(duì)接位點(diǎn),在胞嘧啶的第5碳上添加一個(gè)甲基,產(chǎn)生5-甲基胱氨酸(5mC),這一過程由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNA methyltransferase 1, DNMT1)、DNMT3a和DNMT3b催化,它們建立并維持了基因組甲基化模式。而5-甲基胞嘧啶(5mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)是由TET介導(dǎo),促進(jìn)DNA去甲基化[13]。哺乳動(dòng)物基因組中,70%～80%的CpG被甲基化,作為一種更穩(wěn)定的表觀遺傳修飾,其可以沉默或下調(diào)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子,這種不同的基因表達(dá)調(diào)節(jié)可影響疼痛和鎮(zhèn)痛。

1.DNMT觸發(fā)DNA甲基化沉默基因表達(dá):周圍神經(jīng)損傷通過激活受損DRG感覺神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)錄因子CREB來上調(diào)DNMT1的表達(dá)。這種上調(diào)與Kcna2啟動(dòng)子和5′-非翻譯區(qū)域內(nèi)某些CpG位點(diǎn)的DNA甲基化水平升高相關(guān),而Kv1.2是NP發(fā)生的關(guān)鍵因素,DNMT1可能有助于NP的發(fā)展[14]。Zhao等[15]建立SNL和慢性壓迫性損傷(chronic compress injury, CCI)動(dòng)物模型,證明通過激活轉(zhuǎn)錄因子OCT1能增加受損DRG神經(jīng)元中DNMT3a的表達(dá),阻斷這種增加可阻止神經(jīng)損傷引起的Kcna2表達(dá),從而減輕NP。相反,在沒有神經(jīng)損傷的情況下,模擬這種增加會(huì)降低Kcna2啟動(dòng)子活性,降低Kv電流,增加DRG神經(jīng)元的興奮性并導(dǎo)致脊髓中樞敏化和神經(jīng)性疼痛癥狀,這表明DNMT3a可能通過抑制DRG中的Kcna2表達(dá)而導(dǎo)致NP。

Liu等[16]進(jìn)一步研究DNMT3a介導(dǎo)的miR-214-3p表觀遺傳學(xué)抑制作用,發(fā)現(xiàn)其增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中CSF1的產(chǎn)生,繼而在SNL模型大鼠中誘導(dǎo)了神經(jīng)炎癥和疼痛行為。此外,DNMT3b在SNL模型中下調(diào),引起GPR151基因啟動(dòng)子的去甲基化,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子5(Krüppel-like factor 5, KLF5)與G蛋白偶聯(lián)受體151(G-protein coupled receptor 151,GPR151)啟動(dòng)子的結(jié)合,并進(jìn)一步增加脊髓神經(jīng)元中GPR151的表達(dá)。增加的GPR151可能通過激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和增加疼痛相關(guān)基因表達(dá)而促成NP的發(fā)生[17]。有研究表明,周圍神經(jīng)損傷通過DRG中DNA甲基化來下調(diào)MOR和Kv1.2的表達(dá),從而誘發(fā)NP[13]。

2.DNA去甲基化TET1調(diào)控甲基化水平:DNA去甲基化TET1過表達(dá)通過調(diào)控MOR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平,增加MOR的表達(dá),從而改善神經(jīng)損傷導(dǎo)致的痛覺過敏和嗎啡耐受[18]。值得一提的是,化療引起的神經(jīng)性疼痛是癌癥治療的常見劑量限制性不良反應(yīng),但其潛在機(jī)制在很大程度上是未知的。Deng等[19]構(gòu)建大鼠奧沙利鉑疼痛模型,使用全基因組表達(dá)微陣列和基因本體分析確定脊髓背角中序列特異性DNA結(jié)合蛋白HOXA6上調(diào)。其通過TET1介導(dǎo)的SOX10啟動(dòng)子去甲基化導(dǎo)致NP。紫杉醇誘導(dǎo)的雙孔結(jié)構(gòu)域K+通道1.1 (K2p1.1)的下調(diào)是由DRG中啟動(dòng)子DNA甲基化增加引發(fā)NP。損傷的DRG中TET1過表達(dá)可能通過挽救K2p1.1的表達(dá)來減輕化療引起的神經(jīng)性疼痛[20]。

5-氮雜胞苷是一種目前被許可用作化療的DNMT抑制劑,基于其降低MeCP2水平的功效,它也可用作鎮(zhèn)痛劑。然而,鎮(zhèn)痛效果只有在鞘內(nèi)給藥時(shí)才能達(dá)到,因此限制了其潛在的治療用途。另一方面,降低DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致疼痛過敏,因?yàn)槭苡绊懙腃pG位點(diǎn)(啟動(dòng)子與內(nèi)含子區(qū)域)將對(duì)基因表達(dá)的變化產(chǎn)生不同的影響[21]。綜上所述,DNMT可能與基因啟動(dòng)子結(jié)合,導(dǎo)致基因甲基化或去甲基化,從而加重或緩解NP,這將為NP的治療提供新的指導(dǎo)。給予基因特異性siRNA或慢病毒治療是未來的一種前瞻性治療選擇。

四、組蛋白修飾

組蛋白修飾是對(duì)核小體N-端組蛋白尾部的轉(zhuǎn)錄后修飾(post-transcriptional modifification, PTM),可調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。組蛋白乙?；饕l(fā)生在H3和H4 N-端保守的賴氨酸殘基上,由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)催化進(jìn)行。這種可逆的乙?；揎椬饔每墒谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)改變,并對(duì)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響[22, 23]。組蛋白甲基化是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histonemethyl transferase, HMT)完成的。甲基化可發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上,疼痛過程中不同程度的組蛋白甲基化增加了組蛋白修飾和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的復(fù)雜性[24, 25]。

1.組蛋白乙?；瘜?duì)痛覺敏化發(fā)揮重要調(diào)節(jié)機(jī)制:在紫杉醇引起的NP模型中,脊髓背角中活化T細(xì)胞的核因子(NFATc2)可直接上調(diào)CXCL14的表達(dá),這是通過NFATc2和p300之間相互作用增加了CXCL14啟動(dòng)子區(qū)域中組蛋白H4的乙?；４送?敲除脊髓背角的CXCL14顯著減弱了紫杉醇誘導(dǎo)的NP[22]。組蛋白H3賴氨酸9乙酰化(H3K9ac)可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene-related peptide, CGRP),神經(jīng)損傷后表達(dá)H3K9ac的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加。抑制CGRP可減輕NP的發(fā)展,同時(shí)抑制CCI大鼠中H3K9ac、CX3CR1和IL-1β的表達(dá)[23]。另外在SNL模型中,CXCL13被激活引起疼痛,其機(jī)制是受損DRG神經(jīng)元中鋅指蛋白382(ZNF382)的下調(diào),這破壞了HDAC1和SET結(jié)構(gòu)域[26]。

組蛋白乙酰化可通過溴區(qū)結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域(bromodomain and extra terminal domain, BET)蛋白募集,對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的脊髓神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵作用,結(jié)合HDAC和BET抑制劑靶向神經(jīng)性疼痛可能代表一種新的治療選擇[27]。Borgonetti等[28]研究SUM52和SUM35的新型雙重HDAC/BRD4抑制劑在小鼠SNI模型中的藥理學(xué)特征,結(jié)果顯示,作為多靶點(diǎn)藥物的單個(gè)分子同時(shí)調(diào)節(jié)BET和HDAC活性,可為NP緩解帶來希望。丙戊酸是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑,可通過STAT1/NF-κB和JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能并抑制脊髓神經(jīng)炎癥[29]。

2.組蛋白甲基化參與了痛覺敏化的形成:zeste同源物2(EZH2)增強(qiáng)子對(duì)H3賴氨酸27(H3K27me3)的三甲基化是一種表觀遺傳標(biāo)記,可調(diào)節(jié)周圍神經(jīng)損傷后炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[24]。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1, CARM1)是組蛋白精氨酸甲基化的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子,鞘內(nèi)注射BC-1215(一種新型Fbxo3抑制劑)可阻止CARM1泛素化,從而阻斷K+通道基因沉默并改善神經(jīng)損傷后的異常性疼痛[25]。另外,G9a(由Ehmt2編碼)是組蛋白3賴氨酸9甲基轉(zhuǎn)移酶,負(fù)責(zé)基因沉默的關(guān)鍵染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑,G9a抑制劑(UNC0638)可用于增強(qiáng)阿片類藥物在治療慢性神經(jīng)性疼痛中的鎮(zhèn)痛作用。由此可見,組蛋白乙?；c去乙?；?、甲基化與去甲基化通過不同的調(diào)節(jié)機(jī)制參與NP的發(fā)生,這些都將是NP治療和預(yù)防的重要研究對(duì)象。

目前,表觀遺傳修飾參與NP形成的分子機(jī)制尚不明確。然而,越來越多的證據(jù)表明,RNA修飾、DNA甲基化和組蛋白修飾通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性反應(yīng)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活、離子通道等在NP的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。目前的研究大都基于動(dòng)物模型的探索,并且表觀遺傳修飾之間交叉仍然難以明確,研究人員需要在更高級(jí)動(dòng)物模型中探索其他的表觀遺傳調(diào)控模式,可使用全基因組方法,例如染色質(zhì)免疫沉淀,然后進(jìn)行深度測(cè)序(ChIP-seq),以繪制在神經(jīng)性疼痛的基因和非基因區(qū)域的范圍。隨著對(duì)NP的表觀遺傳修飾及其分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷增加,NP的有效治療和預(yù)防前景更加廣闊。