膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的生物學(xué)標(biāo)志物研究進(jìn)展

李 茹 杜賢榮 楊曉宇 劉文操

膿毒癥是機(jī)體對感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙[1]。急性腎損傷是膿毒癥的嚴(yán)重并發(fā)癥,隨著其發(fā)生率及病死率的不斷增加,每年影響世界數(shù)百萬人,導(dǎo)致30%～60%的患者死亡[2]。同時使腎臟替代治療使用率增加,機(jī)械通氣、重癥監(jiān)護(hù)病房住院時間延長,增加醫(yī)療費(fèi)用并且消耗醫(yī)療資源。因此,尋找膿毒癥相關(guān)急性腎損傷(sepsis-associated acute kidney injury,S-AKI)早期敏感的生物學(xué)標(biāo)志物至關(guān)重要;由于S-AKI機(jī)制尚不明確,常規(guī)的血肌酐和尿量在診斷和評估腎功能時存在局限性,使得S-AKI患者病死率居高不下。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)及基因工程的蓬勃發(fā)展,一些生物學(xué)標(biāo)志物在早期診斷腎損傷方面顯示出較高的特異性和敏感度,在S-AKI的診療方面有很大潛力。

一、S-AKI診斷現(xiàn)狀

根據(jù)2012年改善全球腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO)對AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]:①48h內(nèi)腎功能突然下降,血肌酐絕對值升高≥26.5μmol/L(0.3mg/dl);②血肌酐增加≥基礎(chǔ)值的1.5倍;③尿量<0.5ml/(kg·h),持續(xù)時間>6h。當(dāng)符合標(biāo)準(zhǔn)兩項(xiàng)及以上時,急性腎損傷診斷成立。目前仍然是依據(jù)血肌酐和尿量的變化來評估腎功能,然而只有腎小球?yàn)V過率降低至正常值的約30%時,血肌酐才會明顯升高,因此,以血肌酐來間接評估腎功能的方法存在滯后性[4];再者血肌酐水平受許多因素影響,包括飲食、藥物治療、肌肉質(zhì)量、性別和種族等差異,這可能導(dǎo)致嚴(yán)重低估腎功能障礙的程度,延誤治療時機(jī)。尿量同樣作為急性腎損傷的標(biāo)志,缺乏特異性和敏感度,可能是因?yàn)樯倌蚴菣C(jī)體對緊張性刺激的一種適當(dāng)?shù)纳矸磻?yīng),且尿量可能在嚴(yán)重的腎損傷時才出現(xiàn)減少[5]。因此,以肌酐和尿量為標(biāo)準(zhǔn)的AKI診斷缺乏理想的敏感度和特異性。

二、新型生物學(xué)標(biāo)志物

由于近年來對S-AKI病理生理、分子機(jī)制的不斷探索和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,發(fā)現(xiàn)了多種S-AKI早期診斷和監(jiān)測的敏感又特異的新型生物學(xué)標(biāo)志物,這些生物學(xué)標(biāo)志物不但可以在血肌酐升高之前對S-AKI的診斷提供線索,而且還能幫助了解腎損傷的部位和程度,以及預(yù)測AKI治療的效果及預(yù)后,為急性腎損傷的治療帶來了希望。

1.胱抑素C(cystatin C, CysC):CysC由有核細(xì)胞產(chǎn)生,經(jīng)腎小球過濾,然后主要在近端腎小管細(xì)胞中被重吸收和分解代謝。其在預(yù)測老年患者的心血管事件和病死率方面優(yōu)于血肌酐。因此,與血肌酐比較,CysC是更可靠的腎功能標(biāo)志物;然而它容易受到年齡、大劑量皮質(zhì)類固醇、甲狀腺功能狀況、炎癥和惡性腫瘤的影響,需要大量臨床數(shù)據(jù)深入研究[6]。由于血肌酐濃度的變化有一定的局限性,尤其是在危重癥患者臨床病程的后期,尿液中CysC濃度似乎不受S-AKI患者肌酐水平的影響,因此,CysC在S-AKI早期診斷和評估危重癥患者病情進(jìn)展方面具有巨大潛力。

2.腎損傷因子-1:腎損傷因子-1(kidney injury molecule-1, KIM-1)是一種跨膜糖蛋白,包含細(xì)胞外免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域,在正常健康人的腎臟中低表達(dá)。然而其在缺血再灌注損傷后上調(diào),特別是在腎損傷48h后近端腎小管上皮細(xì)胞中明顯升高,這提示KIM-1似乎是S-AKI的高度敏感的標(biāo)志物[7]。研究證實(shí),當(dāng)腎小管進(jìn)行性損傷時血清KIM-1持續(xù)升高,其可能增加慢性腎臟疾病發(fā)展的風(fēng)險,而尿液KIM-1也顯示出與腎損傷具有一定的相關(guān)性[8]。因此,KIM-1是急性腎小管損傷的早期敏感指標(biāo)。

3.中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白:中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipids transport proteins, NGAL)是脂質(zhì)載體蛋白超家族的一種糖蛋白,主要在中性粒細(xì)胞表面表達(dá),同時在其他細(xì)胞類型(如腎細(xì)胞和肝細(xì)胞)中也少量存在,是近年來研究較為熱門的方向。在正常情況下,NGAL通過腎小球過濾,并在近端小管被重吸收。如果腎小管系統(tǒng)在缺血性或腎毒性腎損傷期間受到影響,NGAL的表達(dá)會迅速上調(diào),因此,在腎損傷發(fā)作后3h,即可在尿液中檢測到NGAL。研究表明,與促炎性細(xì)胞因子比較,血漿NGAL水平似乎與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)有更強(qiáng)的相關(guān)性,所以在全身炎性反應(yīng)患者中,由于中性粒細(xì)胞減少,仍可能出現(xiàn)較低的血漿NGAL水平。如果腎小管系統(tǒng)受到影響,伴有中性粒細(xì)胞減少癥的AKI患者的尿NGAL水平也可能顯著升高,因此,在炎癥活動或腎損傷時NGAL水平皆會出現(xiàn)波動[9]。

近年來,NGAL與鐵調(diào)素(鐵穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子)一起被發(fā)現(xiàn)在S-AKI預(yù)后不良的患者中明顯升高,提示NGAL結(jié)合鐵載體在抗菌作用方面具有潛在的研究價值。有研究表明,尿NGAL水平升高反映了近端小管功能障礙或損傷導(dǎo)致濾過NGAL重吸收減少,而在S-AKI期間,其表達(dá)也在腎小管系統(tǒng)中上調(diào),并發(fā)現(xiàn)其敏感度優(yōu)于CysC和KIM-1等生物學(xué)標(biāo)志物,是S-AKI的獨(dú)立危險因素,對S-AKI早期診斷有重要的價值[10]。

4.可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1:髓樣細(xì)胞1所表達(dá)的觸發(fā)受體(triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)是一種先天性免疫性受體,與無菌性和非無菌性炎癥疾病中的炎癥密切相關(guān)。該受體的2種亞型分別為膜型(mTREM-1)和可溶性型(sTREM-1),已經(jīng)在幾種細(xì)菌性疾病和膿毒癥的免疫性疾病機(jī)制中進(jìn)行了大量研究。由于炎癥是幾種細(xì)菌感染的結(jié)果,因此,抑制該受體被認(rèn)為是治療膿毒癥的可靠方法[11]。在正常人尿液中,sTREM-1水平極低,難以檢測出來,而在膿毒癥患者的尿液中可以被檢測到,所以尿液中sTREM-1水平成為目前AKI早期診斷的熱門研究方向。有研究者對膿毒癥患者尿液中的sTREM-1水平進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測及分析,提示尿液sTREM-1水平是膿毒癥患者發(fā)生AKI的獨(dú)立危險因素[12]。

5.肝型脂肪酸結(jié)合蛋白:肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver-type fatty acid binding protein, L-FABP)是一種相對分子質(zhì)量為14kDa的胞質(zhì)蛋白,主要在肝臟中表達(dá),在腎臟、腸、胃和肺中也有少量表達(dá)[13]。有研究顯示,尿液L-FABP水平在一些急性腎臟疾病,如缺血再灌注損傷/低灌注、膿毒癥和腎毒性藥物誘導(dǎo)的AKI中升高,提示尿液L-FABP可用于早期診斷監(jiān)測S-AKI[14]。更有實(shí)驗(yàn)表明,尿液L-FABP與AKI中蛋白質(zhì)重吸收受損密切相關(guān),因此,尿液L-FABP被認(rèn)為是腎小管損傷的特異性標(biāo)志物[15]。導(dǎo)致L-FABP尿排泄增加的確切病理生理途徑尚不明確,需要進(jìn)一步探索。

6.組織金屬蛋白酶抑制劑-2和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7:腎小管細(xì)胞在AKI發(fā)生前會出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行自我保護(hù),即分泌一種阻滯蛋白使細(xì)胞周期停止,然而在AKI期間持續(xù)的細(xì)胞周期停滯可能導(dǎo)致適應(yīng)性修復(fù)不良,最終導(dǎo)致纖維化。研究證實(shí),胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7(insulin-likegrowth factor binding protein-7, IGFBP-7)和組織金屬蛋白酶抑制劑-2(insulin-likegrowth factor binding protein-2, IGFBP-2)通過阻斷周期蛋白依賴性蛋白激酶復(fù)合物的作用,參與了G1細(xì)胞周期阻滯的細(xì)胞應(yīng)激早期階段,已被確定為早期檢測腎損傷高度敏感和特異的生物學(xué)標(biāo)志物[16]。IGFBP-7聯(lián)合TIMP-2在心臟手術(shù)后人群中的臨床應(yīng)用也得到了進(jìn)一步的研究[17]。有研究發(fā)現(xiàn),TIMP-2聯(lián)合IGFBP-7對中、重度AKI的敏感度為81.2%,該組合對AKI的早期診斷優(yōu)于NGAL、KIM-1、L-FABP等已知的生物學(xué)標(biāo)志物[18]。因此,TIMP-2聯(lián)合IGFBP-7在膿毒癥相關(guān)AKI的早期診斷中具有至關(guān)重要的作用。

7.可溶性δ樣蛋白1(soluble delta-like 1,sDLL1):與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)的血管滲漏是膿毒癥的標(biāo)志,而血管內(nèi)皮完整性降低的原因是病原體成分、炎癥相關(guān)宿主因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞和活化循環(huán)免疫細(xì)胞相互作用的復(fù)雜反應(yīng)[19]。內(nèi)皮功能障礙是S-AKI的重要機(jī)制,內(nèi)皮細(xì)胞受到炎癥刺激時產(chǎn)生一氧化碳,導(dǎo)致血管擴(kuò)張、自我調(diào)節(jié)失調(diào)和內(nèi)皮功能障礙,內(nèi)皮細(xì)胞之間的分泌蛋白和黏附因子相互作用以及內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞之間允許白細(xì)胞通過的復(fù)雜相互作用介導(dǎo),從而導(dǎo)致腎小管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,最后形成AKI[20]。因此,S-AKI的發(fā)展與血管內(nèi)皮完整性密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮完整性的一個信號通路是Notch級聯(lián),其通過Notch配體與其相應(yīng)的Notch受體的結(jié)合而被激活[21]。有研究顯示,Notch配體的可溶形式sDLL1在膿毒癥患者的血液中含量很高,這為S-AKI患者早期診斷提供了新的方向。

為了研究感染相關(guān)患者sDLL1的影響,Moll等[22]在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中用血液培養(yǎng)的人臍靜脈細(xì)胞進(jìn)行研究,由于sDLL1刺激可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活進(jìn)而使內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)構(gòu)和屏障功能喪失,因此,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激的人臍靜脈細(xì)胞激活和內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加,其可以通過阻斷與sDLL1受體結(jié)合從而使Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著降低,證實(shí)了LPS介導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙中的級聯(lián)反應(yīng),結(jié)果表明,在細(xì)菌感染和LPS識別過程中,sDLL1激活的Notch信號與血管通透性相關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)sDLL1在膿毒癥患者中的變化,有研究者進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,在膿毒癥患者中,血液中可溶性Notch配體sDLL1的升高特別明顯[23]。另有研究確定了sDLL1對AKI檢測的預(yù)測價值,使其成為重癥監(jiān)護(hù)AKI患者的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[24]。目前AKI患者尿液中sDLL1的相關(guān)研究較少,無確切證據(jù)表明尿液中sDLL1與AKI的相關(guān)性,還需開展進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

8.外泌體:健康人和患有不同疾病的人釋放到循環(huán)/體液中的外泌體成分(蛋白和RNA)是不同的,它是由原核細(xì)胞和真核細(xì)胞釋放的納米大小的包被有雙層結(jié)構(gòu)的小囊泡,富含多種生物活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、核苷酸和脂質(zhì)[25]。外泌體廣泛存在于各種體液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中,其通過這些活性成分向靶細(xì)胞穿梭從而介導(dǎo)機(jī)體的生理和病理過程[26]。有研究表明,多種細(xì)胞來源的外泌體在急性和慢性腎臟疾病中可以發(fā)揮有益的作用,特別是來源于間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體在臨床試驗(yàn)中對腎病的預(yù)防和治療有顯著療效。

研究表明,外泌體中的微小RNA(microRNA,miRNA)可以反映損傷和纖維化狀態(tài),如miR-9a、miR-16、miR-200a和miR-141的釋放[27]。尿液是外泌體研究中最常用的生物體液,尿液中外泌體的研究成為近幾年的熱門話題;還有其他如Na+/H+交換器異構(gòu)體3也有望成為S-AKI相關(guān)的外泌體生物學(xué)標(biāo)志物[28]。

9.非編碼RNA:超過80%的人類基因組被轉(zhuǎn)錄成沒有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA,這種功能基因組轉(zhuǎn)錄物被稱為非編碼RNA。非編碼RNA主要包括miRNA、長非編碼RNA、環(huán)狀RNA、小核仁RNA、P元件誘導(dǎo)的睪丸肥大相關(guān)RNA和轉(zhuǎn)移RNA。不同的非編碼RNA通過特定的機(jī)制發(fā)揮作用,越來越多的證據(jù)表明,非編碼RNA在AKI中起重要作用。然而,非編碼RNA調(diào)節(jié)AKI炎癥相關(guān)基因表達(dá)的具體機(jī)制尚未完全闡明。

外泌體中包含的miRNA對S-AKI的早期診斷具有一定的價值,如外泌體miR-19b-3p(可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng));研究發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)的AKI動物模型中腎小管上皮細(xì)胞外泌體miR-19b-3p比對照組顯著增加了59.7倍,可作為S-AKI潛在的生物學(xué)標(biāo)志物[29]。Ji等[30]研究表明,miR-320-3p是S-AKI患兒死亡的獨(dú)立危險因素;還有研究表明,尿液中miR-452的增加可能是膿毒癥患者早期檢測AKI的有效生物學(xué)標(biāo)志物[31]。

三、膿毒癥相關(guān)急性腎損傷研究的局限性及展望

本研究所涉及的新型生物學(xué)標(biāo)志物,包括TIMP-2聯(lián)合IGFBP-7、NGAL、KIM-1和CysC等,可以使用常規(guī)診斷測定法進(jìn)行測量,從而在短的周轉(zhuǎn)時間(少于1h)內(nèi)提供準(zhǔn)確的結(jié)果,但仍需進(jìn)一步研究來證實(shí)這些生物學(xué)標(biāo)志物的敏感度和特異性。但外泌體因其種類繁多,如蛋白和核酸測量較為復(fù)雜,檢查項(xiàng)目繁多且技術(shù)要求高,加之費(fèi)用高昂,不適用于基層單位早期診斷S-AKI?？傊?由于受當(dāng)前技術(shù)要求的限制,研究者致力于開發(fā)更快速、有效且實(shí)用的方法。

S-AKI的早期診斷和有效治療是降低患者病死率的關(guān)鍵。然而目前使用的生物學(xué)標(biāo)志物(膿毒癥:降鈣素原、乳酸清除率、C反應(yīng)蛋白;AKI:血肌酐、尿量)顯示了關(guān)于膿毒癥和AKI的診斷和預(yù)后的局限性,因此,尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物迫在眉睫。盡管大多數(shù)AKI生物學(xué)標(biāo)志物提供了關(guān)于腎小管系統(tǒng)損傷有價值的信息,然而監(jiān)測血清和尿液外泌體如非編碼RNA等可以出現(xiàn)更加精準(zhǔn)、敏感的信息,更可靠地用于評估涉及腎小球和腎小管源性腎損傷的整體腎損傷。此外,這些標(biāo)志物的增加可以指導(dǎo)開始腎臟替代治療的時機(jī),從而有效減輕腎損傷并改善S-AKI的預(yù)后,因此可以為S-AKI的早期診斷和治療提供保障。新型生物學(xué)標(biāo)志物CysC、KIM-1、NGAL、sTREM-1、L-FABP、TIMP-2和IGFBP-7、sDLL1、外泌體、非編碼RNA提供了一種用于監(jiān)測炎癥狀況且非侵入性的檢測指標(biāo),由于S-AKI是一種異質(zhì)性的臨床綜合征,單獨(dú)測量單一標(biāo)志物不足以達(dá)到準(zhǔn)確診斷和監(jiān)測的目的。因此,涉及各種血清和尿液生物學(xué)標(biāo)志物的多標(biāo)志物方法和臨床參數(shù)的聯(lián)合應(yīng)該應(yīng)用于S-AKI的早期診斷。