鐵皮石斛主要成分及其含量檢測方法的研究

馮柳娟，劉凱月，全海倩

（深圳市深業(yè)航天食品與環(huán)境檢測科技有限公司，廣東深圳 518040）

鐵皮石斛長期以來作為中藥材應(yīng)用，2020年國家衛(wèi)健委發(fā)布通知將鐵皮石斛列為藥食同源管理。研究表明，鐵皮石斛中含有多糖、生物堿、氨基酸、揮發(fā)性成分、微量元素等成分，主要的活性物質(zhì)是多糖類化合物，具有生津養(yǎng)陰的作用[1]。多糖具有抗氧化、清除自由基、保護心肌細胞的作用。鐵皮石斛多糖能顯著提高外周白細胞數(shù)，促進淋巴細胞產(chǎn)生移動抑制因子，可有效提高機體免疫力[2]。醇溶性浸出物中包含了生物堿等物質(zhì)，生物堿是抗腫瘤的重要成分。甘露糖為鐵皮石斛多糖水解后的主要單糖，可以提高人體免疫力[3]。以鐵皮石斛作為研究對象，對其主要成分及其含量檢測方法進行分析，進一步了解鐵皮石斛的價值。

1 材料和方法

1.1 儀器

Ultimate 3000 型液相色譜儀，Thermo fisher 公司產(chǎn)品；UV-1800PC 型紫外分光光度計，上海翱藝科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；GZX-DH202-1-BS 型電熱恒溫干燥箱，上海捷呈實驗儀器有限公司產(chǎn)品；SX2-4-10TP 型箱式電阻爐、HWS24 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；H2050R 型離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；FA1104 型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料

索式提取器；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司提供；100 %甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品，中檢所提供；鹽酸氨基葡萄糖（CNW）；1- 苯基- 3 - 甲基- 5 - 吡唑啉酮（分析純）；甲醇（色譜純）；氫氧化鈉（分析純）；鹽酸（優(yōu)級純）；三氯甲烷（分析純）；乙醇（優(yōu)級純）；苯酚（分析純）；濃硫酸（分析純）；乙腈（色譜純）；乙酸銨（優(yōu)級純），鐵皮石斛，深圳市農(nóng)科集團研究院提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 鐵皮石斛樣品的處理

將鮮條于90 ℃條件下殺青8 h，粉碎后過三號篩（50 目），同時測定粉碎后的水分含量。將干品直接粉碎后過三號篩（50 目），同時測定其水分含量。計算醇溶性浸出物、多糖、甘露糖含量（需按干燥品計）。將全部鐵皮石斛樣品粉碎過篩，以保證樣品的均勻性、代表性及結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 水分、灰分、醇溶性浸出物含量及其檢測方法

《中國藥典》2020年版中鐵皮石斛水分的測定采用干燥失重法，灰分采用灼燒法，醇溶性浸出物采用熱浸法，并規(guī)定水分不得超過12.0%，總灰分不得超過6.0%，醇溶性浸出物不得少于6.5%[4]。該項目對多批次鐵皮石斛的水分、灰分、醇溶性浸出物進行測定，測定水分和灰分前的稱量瓶或坩堝連續(xù)2 次稱重的差異不超過0.3 mg，醇溶性浸出物最好直接采購95%的乙醇作為提取溶液，自行配制的乙醇會影響試驗結(jié)果，提取溫度80 ℃左右，提取時冷凝回流管與錐形瓶連接處要避免冷凝水蒸汽滴入錐形瓶中，否則影響試驗結(jié)果。結(jié)果表明，市售干燥鐵皮石斛的水分含量為8.0%～12.0%，灰分含量為3%～4%，鐵皮石斛鮮條水分為80%左右，總灰分含量0.9%左右，醇溶性浸出物含量為4.0%～12.0%。

鐵皮石斛鮮條和干品水分、灰分含量見表1，醇溶性浸出物含量結(jié)果見圖1。

表1 鐵皮石斛鮮條和干品水分、灰分含量/%

圖1 醇溶性浸出物含量結(jié)果

2.3 鐵皮石斛多糖含量及其檢測方法

多糖含量是評判鐵皮石斛的品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，鐵皮石斛多糖的提取方法有熱水浸提法、酸提取法、堿提取法、有機溶劑提取法、酶提取法等，常通過微波或超聲輔助。該項目石斛多糖的測定采用苯酚硫酸法，利用強酸將用熱水提取出來的多糖水解成單糖（包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等），再與顯色物質(zhì)反應(yīng)，測其吸光度即可測得多糖的含量，顏色越深，多糖含量越高[5]。稱干燥試樣約0.3 g，加水200 mL，100 ℃水浴冷凝回流2 h，冷卻后定容至250 mL，過濾，取濾液2 mL 于離心管中，加入無水乙醇10 mL，搖勻后冷藏1 h，取出恢復(fù)室溫后以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心20 min，能達到較好的離心效果，棄去上清液，為了結(jié)果更加準(zhǔn)確，同一提取液可吸取2～3 個樣液進行沉淀離心，保證結(jié)果的精密度，沉淀加入體積分數(shù)為80%的乙醇洗滌離心2 次，不溶物用熱水溶解后定容至25 mL。取待測液1 mL 與具塞刻度試管中，加入質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚溶液1 mL，再加入濃硫酸5 mL，沸水浴中加熱20 min，冰浴中冷卻5 min，于紫外波長488 nm處測定吸光度，同時測定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?！吨袊幍洹?020年版中規(guī)定多糖不得少于25.0%[4]，試驗結(jié)果表明不同年限的石斛的多糖含量有差異，含量在20%～60%。

多糖含量結(jié)果見圖2。

圖2 多糖含量結(jié)果

2.4 鐵皮石斛甘露糖含量、甘露糖和葡萄糖峰面積比及其檢測方法

目前，測定甘露糖的主要方法有高效液相色譜法。該項目采用索氏提取法提取甘露糖，高效液相色譜儀上機。因《藥典》中直接將提取后的濾紙筒加水煎煮容易導(dǎo)致溶液爆沸飛濺，試驗采用濾紙包裹樣品，經(jīng)索氏提取后將樣品用水轉(zhuǎn)移至燒杯中進行煎煮，可減少攪拌的時間及防止爆沸；用三氯甲烷洗滌，可直接采用渦旋振蕩，靜置后棄去下層溶液，反復(fù)3 次，直至上層溶液清澈透明。

儀器條件：進樣量10 μL；色譜柱C18（150×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；流動相為乙腈- 0.02 mol/L 的乙酸銨溶液（20∶80）；二極管陣列檢測器，檢測波長250 nm。根據(jù)甘露糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。在上述色譜條件下，出峰順序依次為PMP、甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、葡萄糖，甘露糖的保留時間為16.280 min。

HPLC 色譜圖見圖3。

圖3 HPLC 色譜圖

《中國藥典》2020年版中規(guī)定甘露糖含量為13.0%～38.0%，甘露糖和葡萄糖峰面積比范圍為2.4～8.0[4]。試驗結(jié)果表明，甘露糖含量為10.0%～30.0%，甘露糖和葡萄糖峰面積比為1.0～5.0。

甘露糖含量結(jié)果見圖4，甘露糖和葡萄糖峰面積比結(jié)果見圖5。

圖4 甘露糖含量結(jié)果

圖5 甘露糖和葡萄糖峰面積比結(jié)果

3 結(jié)論

試驗最后對12 批次的鐵皮石斛的醇溶性浸出物含量、多糖含量、甘露糖含量、甘露糖含量與葡萄糖峰面積比進行分析，結(jié)果顯示醇溶性浸出物含量高其多糖含量不一定低，多糖含量高其甘露糖含量不一定高，這與鐵皮石斛的種植環(huán)境、采收時間及種植年限等有關(guān)。

鐵皮石斛醇溶性浸出物含量、多糖含量、甘露糖含量、甘露糖含量與葡萄糖峰面積比見表2。

表2 鐵皮石斛醇溶性浸出物含量、多糖含量、甘露糖含量、甘露糖含量與葡萄糖峰面積比

近年來，鐵皮石斛種植越來越廣，但不同的生產(chǎn)條件對其品質(zhì)有重要的影響，結(jié)合鐵皮石斛的多批次的檢測結(jié)果，總結(jié)鐵皮石斛檢測過程中注意的要點，試驗結(jié)果可為鐵皮石斛的產(chǎn)品品質(zhì)評價提供參考依據(jù)。