葡聚糖的環(huán)氧化修飾與表征

楊梅竹，薛亞楠，蔡 寧，齊國斌，張 寒，喻發(fā)全

（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢430073）

葡聚糖與生物組織具有良好的生物相容性，無毒，對溫度和pH值的穩(wěn)定性好［1］，經(jīng)過化學(xué)改性后，可作為一種理想的藥物載體材料。葡聚糖的環(huán)氧化是在葡聚糖的結(jié)構(gòu)單元中引入了環(huán)氧基團(tuán)。環(huán)氧化葡聚糖由于引入了環(huán)氧基團(tuán)，不僅水溶性得到提高，而且能夠很好地與帶有羥基（－OH）、氨基（－NH2）、羧基（－COOH）或巰基（－SH）官能團(tuán)的藥物、蛋白質(zhì)、DNA等［2－4］結(jié)合，形成具有特殊用途的藥物前驅(qū)體、藥物載體、基因載體等［2－6］。

作者在此以葡聚糖（Dex）為原料、1，4－丁二醇二縮水甘油醚（BDE）為雙端帶有環(huán)氧基團(tuán)的環(huán)氧化試劑，在堿性條件下將葡聚糖分子鏈修飾上環(huán)氧基團(tuán)，并考察了投料比、pH值、反應(yīng)時間等條件對環(huán)氧取代度的影響；通過改變反應(yīng)條件對環(huán)氧取代度進(jìn)行調(diào)控，得到環(huán)氧取代度可調(diào)的環(huán)氧化葡聚糖，為葡聚糖進(jìn)一步功能化修飾及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

葡聚糖（20kDa），分析純，阿拉丁試劑有限公司；1，4－丁二醇二縮水甘油醚，分析純，華威銳科試劑有限公司；氫氧化鈉（NaOH）、硼氫化鈉（NaBH4）、濃鹽酸（HCl）、五水合硫代硫酸鈉（Na2S3O3·5H2O）、酚酞，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重水（D2O），青島騰龍微波科技有限公司。所有試劑均直接使用，未經(jīng)純化處理。

透析袋（截留分子量Mw＝3500），上海晨易生物有限公司；Heal Force SUPER NW型系列超純水儀，力康科技有限公司。

1.2 環(huán)氧化葡聚糖的合成方法

按設(shè)定的反應(yīng)條件，將一定量的葡聚糖溶解到0.6mol·L－1的NaOH溶液（含2mg·mL－1NaBH4）中，攪拌下將上述溶液經(jīng)注射泵緩慢加入到過量的BDE溶液中，37℃下攪拌反應(yīng)一定時間。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入透析袋中，室溫透析3d，所得透析液經(jīng)冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物。反應(yīng)式如圖1所示。

1.3 環(huán)氧化葡聚糖的結(jié)構(gòu)表征

以重水（D2O）為溶劑，用Mercury VX－300型核磁共振波譜儀在300MHz下對環(huán)氧化葡聚糖進(jìn)行核磁共振氫譜（1HNMR）的測定。

圖1 葡聚糖的環(huán)氧化反應(yīng)Fig.1 Epoxidation of dextran

1.4 分析與檢測

1.4.1 環(huán)氧化葡聚糖分子量及其分布的測定

采用多角度激光光散射（MALLS）和尺寸排阻色譜（SEC）聯(lián)用分析系統(tǒng)（MALLS－SEC）測定環(huán)氧化葡聚糖的分子量及其分布。其中尺寸排阻色譜使用Waters－2690DHPLC裝備Ultrahydrogel 120和250柱，流動相為PBS緩沖溶液（0.5mol·L－1，pH值8.0），流速為0.6mL·min－1，柱溫為25℃。光散射數(shù)據(jù)由Wyatt DAWN DSP型多角度光散射檢測儀和Waters 2410型示差折光檢測器雙檢測系統(tǒng)獲得。

1.4.2 環(huán)氧化葡聚糖環(huán)氧取代度的測定

參照文獻(xiàn)［7］測定產(chǎn)物中環(huán)氧基團(tuán)的含量，進(jìn)而對葡聚糖的環(huán)氧取代度進(jìn)行表征：

1.4.3 環(huán)氧化葡聚糖在水中穩(wěn)定性的測定

將樣品配制成0.01mol·L－1的水溶液，4℃靜置，通過檢測環(huán)氧基團(tuán)隨時間的變化情況考察其在水中的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)氧化葡聚糖的結(jié)構(gòu)表征

原料葡聚糖和產(chǎn)物環(huán)氧化葡聚糖的核磁共振氫譜見圖2。

圖2 葡聚糖（a）和環(huán)氧化葡聚糖（b）的核磁共振氫譜（D2O為溶劑）Fig.2 1 HNMR Spectra of dextran（a）and epoxy－activated dextran（b）using D2O as solvent

由圖2可以看出，3.4～4.0ppm處的4個峰（峰a～d）分別對應(yīng)于葡聚糖骨架上的質(zhì)子信號峰；而產(chǎn)物核磁譜圖中的3.2ppm（峰e）、2.8ppm（峰f）、2.6ppm（峰g）與1.5ppm（峰h）處則出現(xiàn)了不同于葡聚糖骨架的特征峰，它們分別歸屬于側(cè)鏈中與氧原子相連的亞甲基側(cè)鏈末端環(huán)氧基團(tuán)中的次甲基與亞甲基以及側(cè)鏈中亞甲基的質(zhì)子信號峰。表明環(huán)氧基團(tuán)被成功地引入到葡聚糖的側(cè)鏈中，并且由于BDE側(cè)鏈的引入使3.4ppm（峰d）處信號峰強(qiáng)度增強(qiáng)。通過計算側(cè)鏈末端環(huán)氧基團(tuán)中的特征信號峰（峰g或f）與葡聚糖骨架單元中特征信號峰（峰a或b）的積分面積比可以得到產(chǎn)物的環(huán)氧取代度。同時，由于交聯(lián)副產(chǎn)物的生成，使得峰h的積分面積增大。通過計算產(chǎn)物中峰h與峰g或f的積分面積比可以得到產(chǎn)物中交聯(lián)產(chǎn)物的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該產(chǎn)物中約有25%交聯(lián)副產(chǎn)物，使得側(cè)鏈的有效環(huán)氧化率有所降低。

2.2 環(huán)氧化葡聚糖的分子量及其分布（表1）

表1 葡聚糖和環(huán)氧化葡聚糖的分子量及其分布Tab.1 Molecular weight and its distribution of dextran and epoxy－activated dextran

由表1可以看出，由于側(cè)鏈基團(tuán)的引入，產(chǎn)物環(huán)氧化葡聚糖的分子量相對于原料葡聚糖而言有所增加，分子量分布寬度也有所變大；且對應(yīng)的GPC淋出曲線均呈單峰分布（圖略），證明所得產(chǎn)物中沒有產(chǎn)生大的交聯(lián)物。

2.3 反應(yīng)條件對環(huán)氧取代度的影響

2.3.1 投料比（Dex與BDE的摩爾比，下同）對環(huán)氧取代度的影響

在堿性條件下，醇羥基引發(fā)BDE上的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)；再將活性環(huán)氧基團(tuán)引入到葡聚糖的側(cè)鏈中，得到環(huán)氧化葡聚糖。通過采用過量BDE的方法，減少交聯(lián)葡聚糖副產(chǎn)物的生成。

在37℃、不同pH值條件下反應(yīng)4h得到的環(huán)氧化葡聚糖的環(huán)氧取代度隨投料比的變化見圖3。

圖3 不同pH值條件下，投料比對環(huán)氧取代度的影響Fig.3 Effect of molar ratio of Dex to BDE on epoxy degree at different pH values

由圖3可以看出，隨著BDE用量的增加，產(chǎn)物的環(huán)氧取代度明顯升高。這是因為，BDE兩端各帶有一個環(huán)氧基團(tuán)，為保證葡聚糖側(cè)鏈上引入環(huán)氧基團(tuán)，BDE上只能有一端環(huán)氧基團(tuán)參加反應(yīng)，因此，BDE的用量要過量。當(dāng)BDE用量較少時，兩端環(huán)氧基團(tuán)均參加反應(yīng)的幾率增大，從而使交聯(lián)副產(chǎn)物的比例提高，環(huán)氧化目標(biāo)產(chǎn)物的量相應(yīng)減少；增加BDE用量，反應(yīng)體系中環(huán)氧基團(tuán)過量程度提高，交聯(lián)反應(yīng)的幾率就會減小，環(huán)氧取代度相應(yīng)升高。因此，通過增加BDE的用量，可以有效提高產(chǎn)物的環(huán)氧取代度，降低交聯(lián)幾率。綜合考慮，確定適宜的投料比n（Dex）∶n（BDE）為1∶30。

2.3.2 pH值對環(huán)氧取代度的影響

在37℃、投料比n（Dex）∶n（BDE）＝1∶30的條件下，反應(yīng)4h得到的環(huán)氧化葡聚糖的環(huán)氧取代度隨pH值的變化見圖4。

圖4 pH值對環(huán)氧取代度的影響Fig.4 Effect of pH value on epoxy degree

由圖4可以看出，環(huán)氧取代度隨pH值的增大先升高后降低；在pH值為12.6～12.7時，環(huán)氧取代度達(dá)到最高。這是因為，增大pH值，有利于誘導(dǎo)環(huán)氧基的開環(huán)，與葡聚糖的反應(yīng)變得容易，環(huán)氧取代度相應(yīng)升高；但進(jìn)一步增大pH值，可使剩余的環(huán)氧基團(tuán)相繼開環(huán)，甚至可進(jìn)一步誘導(dǎo)葡聚糖間的交聯(lián)，反而導(dǎo)致環(huán)氧取代度降低。因此，確定適宜的pH值為12.6。

2.3.3 反應(yīng)時間對環(huán)氧取代度的影響

在37℃、n（Dex）∶n（BDE）＝1∶30、pH值為12.6的條件下，反應(yīng)不同時間（2～48h）得到的環(huán)氧化葡聚糖的環(huán)氧取代度見圖5。

圖5 反應(yīng)時間對環(huán)氧取代度的影響Fig.5 Effect of reaction time on epoxy degree

由圖5可以看出，環(huán)氧取代度隨反應(yīng)時間的延長先升高后降低；在反應(yīng)12h時，環(huán)氧取代度達(dá)到最高；12h以后，由于反應(yīng)基本完成，隨反應(yīng)時間的繼續(xù)延長，產(chǎn)物側(cè)鏈中的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生進(jìn)一步開環(huán)反應(yīng)，使交聯(lián)反應(yīng)的幾率增大，從而導(dǎo)致環(huán)氧化目標(biāo)產(chǎn)物不斷減少，環(huán)氧取代度相應(yīng)降低。因此，確定適宜的反應(yīng)時間為12h。

2.4 環(huán)氧化葡聚糖在水中的穩(wěn)定性（圖6）

圖6 環(huán)氧化葡聚糖在4℃水中的穩(wěn)定性Fig.6 The stability of epoxy－activated dextran in water at 4℃

由圖6可以看出，30d內(nèi)環(huán)氧化葡聚糖中環(huán)氧基團(tuán)的含量基本保持不變，說明低溫下（4℃）環(huán)氧化葡聚糖在水中的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

以葡聚糖（Dex）為原料、1，4－丁二醇二縮水甘油醚（BDE）為環(huán)氧化試劑，在堿性條件下，通過BDE的開環(huán)反應(yīng)得到環(huán)氧基團(tuán)修飾的環(huán)氧化葡聚糖，并且通過改變反應(yīng)條件可得到取代度可控、穩(wěn)定的環(huán)氧化葡聚糖，在37℃、投料比n（Dex）∶n（BDE）＝1∶30、pH＝12.6、反應(yīng)時間為12h的條件下，環(huán)氧取代度高達(dá)16%，且4℃的低溫下環(huán)氧化葡聚糖在水中的穩(wěn)定性良好。

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