骨科用絲素蛋白粘合劑的制備及性能研究

汪張偉　徐婉清　查小明

摘 要：針對傳統(tǒng)骨科用粘合材料粘合性能和生物相容性能較低的問題，提出一種新型骨科用粘合材料的制備，通過豬皮搭載拉伸實驗和生物學評價試驗對粘合材料的性能進行研究。結(jié)果表明：在溫度37 ℃條件下養(yǎng)護12 h的樣品（SFDG12），豬皮搭載拉伸強度為181.5 kPa，細胞存活率高于90%，對細胞的粘附、生長、遷移都有一定的促進作用，具有較好的粘合性能和生物相容性能，可在骨科中傷口愈合緩慢區(qū)域使用。

關(guān)鍵詞：膠合材料；骨科；生物相容性；細胞繁殖

中圖分類號：TQ931;TQ431.4 文獻標志碼：A文章編號：1001-5922（2023）06-0030-04

Preparation and performance study of orthopedic medical adhesive materials

WANG Zhangwei 1，XU Wanqing 2，ZHA Xiaoming 1

（1.The First Clinical Medical College of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China;2.Medical College of Nantong University，Nantong 226001，Jiangsu China）

Abstract：In view of the low adhesion and biocompatibility of traditional orthopaedic medical adhesive materials，a new orthopaedic medical adhesive material was prepared.The properties of the adhesive material were studied by piggy skin loading tensile test and biological evaluation test.The results show that the tensile strength of pig skin is 181.5 kPa and the cell survival rate is higher than 90% after 12 hours of curing at 37?? ℃，which can promote cell adhesion，growth and migration.It has good adhesion and biocompatibility，which can be used in orthopedic areas where wound healing is slow.

Key words：gluing materials;orthopedics;biocompatibility;cell reproduction

醫(yī)用膠合劑是目前較為常用的一種醫(yī)學材料，在軟組織和骨骼損傷這種恢復較慢的傷口中，發(fā)揮著重要的作用。但受現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)的影響，目前臨床所用的膠合劑存在膠合強度低和生物相容性較差的問題，使得醫(yī)用膠合劑的應用受到了很大的限制。為了尋找性能更優(yōu)的醫(yī)用膠合劑，部分學者也進行了很多研究，如從材料出發(fā)，研究了絲素蛋白材料的生物相容性。結(jié)果表明，絲素蛋白制作的絲素凝膠和絲素支架溶血率均低于5%，對細胞形態(tài)不產(chǎn)生影響，具備較好的生物相容性[1]。通過對絲素蛋白的組成結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)進行研究，探討了其在骨科損傷治療中的應用[2]?；诖?，本研究在以絲素蛋白為基底，設計并制備了骨科絲素蛋白－多巴胺－京尼平粘合劑，并對其性能進行研究，為骨科醫(yī)用膠合劑的發(fā)展提供數(shù)據(jù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

主要材料：羥基琥珀酰亞胺（ NHS）（AR），新素新材料；1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）（AR），源葉生物科技；碳酸鈉（AR），海之源化工；蠶繭（標準品），先蠶絲綢生物科技；體積分數(shù)75%乙醇，君雁藥業(yè)；鹽酸多巴胺（AR），昊毅新材料科技；京尼平（AR），華翔科潔生物技術(shù)；PBS緩沖液（標準品），卡諾斯科技；SBF模擬體液（pH=7.4），源葉生物科技。

主要設備：DHG101A-4電熱鼓風干燥箱，蘇珀儀器；SHZ-D磁力攪拌器，凌科實業(yè)發(fā)展；M16RS高速低溫離心機，邁皋科學儀器；ZY-9000M電子材料試驗機，卓亞儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 絲素蛋白溶液的制備

（1）將4.24 g碳酸鈉溶入2 L去離子水，煮沸放入5 g去除了污染部分的蠶繭，繼續(xù)煮沸并不斷攪拌，時間為30 min；

（2）取出絲素后，放入裝有2 L水的燒杯中，慢慢攪拌洗去絲素中的雜質(zhì)，攪拌時間為20 min。倒去燒杯中溶液，取出絲素，完成清洗過程[3]；

（3）重復“步驟（2）”清洗過程3次，撈出洗凈的絲素平鋪在錫紙上，然后置于DHG101A-4型電熱鼓風干燥箱中烘干，烘干溫度為60 ℃。隔固定時間稱重，絲素質(zhì)量不發(fā)生改變即可認為絲素已經(jīng)完全烘干；

（4）將2 g烘干后絲素填充在60 mL樣品瓶底部，然后放入8 mL濃度為9.3 mol/L的溴化鋰溶液，在DHG101A-4型電熱鼓風干燥箱中進行溶解反應，反應溫度和時間分別為60 ℃和4 h；

（5）將溶解后溶液放入透析袋中，放入SHZ-D型磁力攪拌器上，用去離子水慢慢攪拌透析2 d，在第1、4 h換一次水，然后間隔12 h換一次水。在攪拌時要注意不要讓透析袋受到破壞；

（6）將透析完成后絲素置于M16RS型高速低溫離心機內(nèi)進行離心處理，除去不溶物質(zhì)，離心轉(zhuǎn)速、溫度和時間分別為7 800 r/min、4 ℃和20 min。根據(jù)溶液澄清情況選擇離心次數(shù)，待溶液完全澄清后，再次放入透析袋中；

（7）在聚乙二醇溶液中透析濃縮，得到絲素蛋白溶液（SF）。

1.2.2 粘合劑的制備

（1）將NHS和EDC放入制備的絲素蛋白溶液中，在冰浴條件中進行攪拌，攪拌時間為30 min。攪拌結(jié)束后按照絲素蛋白羧基∶多巴胺=6∶1的摩爾比放入鹽酸多巴胺，繼續(xù)攪拌1 h；

（2）將混合溶液繼續(xù)放入透析袋中，放入冰箱中進行透析，透析溫度和時間分別為4 ℃和1 d，得到絲素蛋白-多巴胺粘合劑；

（3）按照絲素蛋白羧基∶京尼平=1∶2的摩爾比加入京尼平溶液，避光攪拌30 min，得到絲素蛋白－多巴胺－京尼平粘合劑（SFDG）。

1.2.3 豬皮樣品的制備

提前將豬皮樣品制備成1 cm2大小，然后用10 μL粘合劑均勻覆涂在豬皮表面，然后將2片豬皮合在一起，用5 g砝碼壓制，使豬皮結(jié)合的更為緊密，壓制時間為10 s，得到豬皮粘合樣品[5]。將樣品用紗布包裹后置于模擬體液溶液中，然后放入DHG101A-4型電熱鼓風干燥箱中，在溫度37 ℃條件下進行養(yǎng)護。將養(yǎng)護0 h的樣品編號為SFDG0，養(yǎng)護12 h的樣品編號SFDG12。

1.3 性能測試

1.3.1 粘合性能

用電子材料試驗機對樣品進行拉伸強度測試，表征粘合劑的粘合性能[6]。

1.3.2 體外降解性能

將待測樣品冷凍干燥后，制備成5 mm3大小的正方體，并對制作的樣品進行稱重，按照浴比1∶100將樣品放入模擬體液中進行降解（SBF模擬體液pH=7.4，Pronase E模擬體液質(zhì)量濃度為10 mg/mL），每天更換降解液，隔天將樣品撈出烘干稱重[7-8]。

殘留率表達式為[9]：

Rm=（Mdt/Mi）×100%（1）式中：Rm為降解率；Mdt為相應天數(shù)后烘干后質(zhì)量；Mi為初始質(zhì)量。

1.3.3 細胞存活率試驗

將不同質(zhì)量冷凍干燥后的樣品粉末放入EP管，然后置于超凈臺上用紫外光照射，在照射時要注意每隔4 h搖晃一次樣品，保證樣品光照均勻，照射時間為24 h。在試驗開始前，將樣品在體積分數(shù)為75%的乙醇溶液中浸泡10 min，然后在M16RS型高速低溫離心機的作用下進行離心處理，離心轉(zhuǎn)速和時間分別為800 r/min和5 min。去掉上清液后用PBS溶液清洗3次，然后配制成不同含量的加藥細胞培養(yǎng)基。將溶解后3T3小鼠成纖維細胞放入9 mL正常細胞培養(yǎng)基中，并用槍頭輕輕吹打，使之混合均勻。將混合液置于高速低溫離心機中進行離心處理，去除離心液后放入1 mL含待測樣品的細胞培養(yǎng)液，混合均勻。用血球計數(shù)板計數(shù)法計算細胞含量。

1.3.4 細胞遷移試驗

提前將6孔板上布滿細胞，劃痕并用PBS溶液清洗，去除刮下的細胞，放在相應濃度的加藥培養(yǎng)基內(nèi)，置于溫度為37 ℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時拍照取樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 粘合性能評價

本研究制備的粘膠劑主要用于骨科，人體正常溫度為37 ℃，通過豬皮搭載拉伸強度探究在該溫度下粘膠劑的粘合性能，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，在該溫度條件下，養(yǎng)護時間在1 h內(nèi)，SF的豬皮搭載拉伸強度約為1 kPa左右，隨時間的延伸，豬皮搭載拉伸強度逐漸增加。當養(yǎng)護時間增加到9 h時，豬皮搭載拉伸強度隨之增加到58.5 kPa，繼續(xù)增加時間，豬皮搭載拉伸強度慢慢趨于平衡；當時間達到12 h時，豬皮搭載拉伸強度可以達到66.5 kPa。研究發(fā)現(xiàn)，SF豬皮搭載拉伸強度是由SF的固化程度決定的[10-11]。當養(yǎng)護時間小于等于3 h時，SF在豬皮間以溶液的形式存在;養(yǎng)護時間達到5 h時，SF才開始慢慢的成膜，豬皮搭載拉伸強度隨之提升。經(jīng)過多巴胺和京尼平處理后，養(yǎng)護時間為12 h時，豬皮搭載拉伸強度達到181.5 kPa。結(jié)果表明，多巴胺、京尼平對提升SF的粘合強度產(chǎn)生了積極的作用。這是因為在SF體系內(nèi)引入多巴胺后，二者產(chǎn)生反應，產(chǎn)物不溶于水，在兒茶酚基的作用下，粘合劑與粘合界面的連接性更強，因此豬皮搭載拉伸強度有所上升。而京尼平的加入使得SF分子作用力有所增加，進而對粘合劑的粘合強度有所增加[12]。養(yǎng)護時間為12 h時，豬皮搭載拉伸強度更好，因此后續(xù)試驗主要對SFDG0（對照組）和SFDG12（試驗組）進行研究。

2.2 體外降解性能評價

體外降解性能的是粘合劑生物學安全性的重要指標，為了探究本研究制備的粘合劑體外降解性，選擇SFDG0樣品和SFDG12樣品，分別浸泡在SFB模擬體液和Pronase E模擬體液中，觀察樣品在模擬體液中的降解情況，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，SFDG0樣品在SFB模擬體液中浸泡2 d后，殘留率約為93%，繼續(xù)增加浸泡時間，樣品幾乎不再發(fā)生降解，樣品殘留率一直維持在90%左右。而在Pronase E模擬體液中，SFDG0樣品2 d殘留率約為87%，且降解率隨浸泡時間的增加而下降；30 d時，殘留率約為51%。而SFDG12樣品在SFB模擬體液中降解速率較慢，2 d時，樣品殘留率約為98%，繼續(xù)增加浸泡時間，樣品殘留率慢慢下降；當達到20 d后，樣品降解達到平衡，繼續(xù)增加浸泡時間，樣品殘留率幾乎不再發(fā)生變化；30 d樣品殘留率約為92%。SFDG12樣品在Pronase E模擬體液中降解速率較快，2 d殘留率約為89%，繼續(xù)增加浸泡時間，樣品緩慢降解；浸泡時間達到30 d時，樣品殘留率約為70%。通過對比可以發(fā)現(xiàn)，在同等條件下，SFDG12樣品的殘留率明顯高于SFDG0樣品，出現(xiàn)這個變化的主要原因在于，SFDG0樣品養(yǎng)護時間較短，京尼平的交聯(lián)作用還沒有發(fā)揮出來，因此主要是SF降解在主導。而SFDG12樣品中，受京尼平交聯(lián)作用影響，可降解程度降低；但整個粘合劑是以SF溶液為基底，因此粘合劑仍具備一定的可降解性能[13-14]。

通過以上分析可以發(fā)現(xiàn)，雖然粘合劑整體降解能力較低，但粘合劑的基底為多種必須氨基酸組成的SF溶液，這些氨基酸對細胞粘附產(chǎn)生了積極的作用。同時，受SF特殊結(jié)構(gòu)的影響，粘合劑可幫助細胞與外界的物質(zhì)交換，提供空間結(jié)構(gòu)供細胞的增長，進而增加了細胞粘附性[15]。這些都說明本研究制備的粘合劑對細胞的粘附和生長都產(chǎn)生了積極的作用，可在骨科中傷口愈合緩慢區(qū)域使用。

2.3 細胞存活率評價

圖3為粘合劑細胞存活率結(jié)果。

從圖3可以看出，所有樣品的細胞存活率均隨樣品使用濃度的減小而增加，當SF樣品質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時，細胞存活率約為98%。從這個變化看，SF自身的生物相容性較好。制作成SFDG粘合劑后，隨樣品質(zhì)量濃度的降低，細胞存活率雖然有所降低，但還是保持了一個相對較高的值。且SFDG0樣品的最高細胞存活率為95%，比SFDG12樣品最高細胞存活率的93%高約2個百分點。這個變化說明樣品在37 ℃環(huán)境下處理的時間越長，對細胞存活率反而產(chǎn)生一些不利影響。出現(xiàn)這個變化的主要原因：在溫度處理的過程中，粘合劑內(nèi)部元素結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些改變，生成了多巴醌和梔子藍色素，降低了細胞存活率[16]。這也說明粘合劑樣品生物相容性較好。

圖4為DiO染色細胞狀態(tài)結(jié)果。

從圖4可以看出，加入京尼平后，細胞增殖較為明顯，細胞膜包被完整，正常貼壁生長。但細胞增殖速度隨溫度養(yǎng)護時間的增加而降低，且分布比空白樣品更為不均[17-18]。同時，觀察細胞狀形狀可以發(fā)現(xiàn)，所有樣品細胞整體皆表現(xiàn)出星形的扁平狀。這些都說明本研究制備的膠合劑具備優(yōu)良的生物相容性，可以應用于骨科治療中。

2.4 細胞遷移評價

為了探究粘合劑是否對細胞的遷移性產(chǎn)生影響，選擇細胞劃痕試驗進行驗證，具體結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，2組試驗在0 h時，均可以看見較為明顯的、沒有細胞殘留的劃痕。當養(yǎng)護時間增加到6 h時，2組試驗的劃痕邊緣皆出現(xiàn)了模糊的情況；當養(yǎng)護時間達到24 h時，2組樣品的細胞已經(jīng)完全鋪在劃痕上，基本看不到劃痕的存在，且2組樣品并未出現(xiàn)明顯的區(qū)別[19]。這些變化都說明了本研究制備的SFDG12膠合劑對細胞的遷移不產(chǎn)生影響[20]。這也說明當本研究制備的骨科膠合劑在實際應用的過程中，不阻礙傷口附近細胞遷移和繁殖，對促進傷口愈合產(chǎn)生積極的影響。

3 結(jié)語

本試驗制備的醫(yī)用骨科粘合劑綜合性能良好，不會對細胞的存活和遷移產(chǎn)生不利影響，可以在骨科創(chuàng)傷治療中使用。

（1）在體內(nèi)應用溫度條件下（37 ℃），SFDG表現(xiàn)出較好的粘合性能，粘合性能高于臨床纖維蛋白膠，證實了該膠合劑可以在人體溫度條件下使用；

（2）SFGD膠合劑具備一定的可降解性能，SFDG12樣品在Pronase E模擬體液中浸泡30 d后，殘留率約為70%。通過分析可以發(fā)現(xiàn)，本研究制備的SFDG12粘合劑能促進細胞的粘附和生長，可在骨科中傷口愈合緩慢區(qū)域使用；

（3）質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL的SFDG12樣品細胞存活率高于90%，細胞增殖較為明顯，細胞膜包被完整，正常貼壁生長，形狀為星形的扁平狀；

（4）SFDG12膠合劑對細胞的遷移不產(chǎn)生影響，在骨科傷口愈合的過程中，不阻礙傷口附近細胞遷移和繁殖，對促進傷口愈合產(chǎn)生積極的影響。

【參考文獻】

［1］石娜，賀倫，牛海濤.新型絲素凝膠和絲素支架的生物相容性評價研究[J].暨南大學學報（自然科學與醫(yī)學版），2021，42（5）：501-515.

[2］賈明鯤，閆景龍.生物可降解絲素蛋白在骨科中的應用與進展[J].北京生物醫(yī)學工程，2021，40（6）：629-634.

[3］王桂龍，崔辛，陳瑩，等.基于貽貝啟發(fā)的水下仿生膠黏劑[J].化學進展，2021，33（12）：2378-2391.

[4］張昭環(huán)，贠凱迪，劉玉月，等.再生蛋白質(zhì)纖維及其復合纖維的研究進展[J].合成纖維工業(yè)，2021，44（6）：57-65.

[5］孫文，閆秋艷，蘇超，等.高分子醫(yī)用組織膠粘劑的應用與研究進展[J].材料導報，2022，36（3）：7-23.

[6］石冬磊，毛竹君，華文笛，等.神經(jīng)外科手術(shù)患者眼貼膜面部醫(yī)用黏膠相關(guān)性皮膚損傷影響因素分析[J].成都醫(yī)學院學報，2021，16（3）：341-344.

[7］吳可可，趙益濤，吳敏，等.聚合物基仿生醫(yī)用膠黏劑的開發(fā)與應用[J].功能高分子學報，2021，34（2）：93-113.

[8］曾丹，儲建林，陳燕茹，等.人造蛋白功能材料的生物合成及應用[J].合成生物學，2021，2（4）：528-542.

[9］高舒穎，徐瑩穎，李曦.基于絲素蛋白的新型藥物遞送系統(tǒng)研究進展[J].藥學與臨床研究，2021，29（5）：371-376.

[10］李秀媛，羅逸倫，馬列.基因活性皮膚再生材料研究進展[J].分子科學學報，2021，37（5）：408-417.

[11］徐云，張昆明，黃永春，等.孔板空化強化制備京尼平-殼聚糖載藥納米微球的工藝研究[J].廣西科技大學學報，2021，32（4）：9-16.

[12］丁紹敏，林海濤，劉水泉，等.桑繭絲素分纖酶解及膳食纖維化應用探討[J].輕紡工業(yè)與技術(shù)，2021，50（10）：1-3.

[13］崔航，王思琪，郭世好，等.水凝膠的制備及應用進展[J].化工新型材料，2021，49（S1）：47-51.

[14］姜雨淋，王卉，張克勤.生物3D打印用絲素蛋白基凝膠墨水的研究進展[J].紡織學報，2021，42（11）：1-8.

[15］趙守進，劉哲鵬，付子讓，等.靜電紡絲在組織工程學中的應用進展[J].生物醫(yī)學工程學進展，2021，42（3）：149-153.

[16］孔倩，林園，蘇朝暉.絲素蛋白/病毒各向異性復合支架的構(gòu)筑及其在神經(jīng)修復中的應用[J].應用化學，2021，38（11）：1454-1461.

[17］馬玥瓏，李佳，王虹.靜電紡絲制備載藥納米纖維的研究進展[J].哈爾濱理工大學學報，2021，26（5）：130-140.

[18］魯文茜，沈尚竹，趙亞麗，等.仿貽貝鄰苯二酚改性殼聚糖在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用及研究進展[J].中國膠粘劑，2020，29（11）：56-60.

[19］于芷晗，蘇曉瑋，李敏，等.醫(yī)用膠黏合法吻合兔細小血管的實驗研究[J].組織工程與重建外科雜志，2020，16（4）：277-279.

[20］李保寧，郭錦麗.兒童醫(yī)用粘膠相關(guān)性皮膚損傷危險因素分析及預防措施[J].護理研究，2020，34（5）：900-903.

收稿日期：2023-01-16；修回日期：2023-05-10

作者簡介：汪張偉（1995-），男，碩士在讀，住院醫(yī)師，研究方向：外科學;E-mail：wangzhangwei1108@163.com。

通訊作者：查小明（1968-），男，醫(yī)學博士，副教授，主任醫(yī)師，研究方向：外科學;E-mail：zhaxm_nj@163.com。

引文格式：汪張偉，徐婉清，查小明.骨科用絲素蛋白粘合劑的制備及性能研究[J].粘接，2023，50（6）：30-33.