例析PCR技術(shù)在基因工程中的應(yīng)用

盛文龍 鄭 重

(浙江省余姚中學(xué))

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱。它是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理,在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件,對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)。該技術(shù)具有簡便、快速、靈敏等特點,雖然問世時間不長,但已成為分子生物學(xué)中強有力的工具之一,在許多新的領(lǐng)域都有應(yīng)用。

1.獲取和擴增目的基因

【例1】(2016年天津卷,第7題節(jié)選)人血清白蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價值,只能從血漿中制備。如圖1是以基因工程技術(shù)獲取重組HSA(rHSA)的兩條途徑。

圖1

(1)為獲取HSA基因,首先需采集人的血液,提取________合成總cDNA,然后以cDNA為模板,使用PCR技術(shù)擴增HSA基因。圖2中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴增方向,請用箭頭在方框內(nèi)標(biāo)出另一條引物的位置及擴增方向。

圖2

(2)啟動子通常具有物種及組織特異性,構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體,需要選擇的啟動子是________(填寫字母,單選)。

A.人血細胞啟動子

B.水稻胚乳細胞啟動子

C.大腸桿菌啟動子

D.農(nóng)桿菌啟動子

【答案】(1)總RNA(或mRNA) 如圖3 (2)B

圖3

說明:PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進行,需提供DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物,4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶;同時控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。PCR由變性→退火→延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。①變性:當(dāng)反應(yīng)體系溫度超過90℃并保持一定時間后,雙鏈模板DNA或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA間的氫鍵斷裂而解離成單鏈DNA,以便與特異性引物結(jié)合,為下一輪反應(yīng)做準(zhǔn)備。②復(fù)性:變性完成后,將反應(yīng)體系的溫度迅速降至50℃左右,特異性的引物就會和單鏈模板DNA的互補序列雜交。由于引物的物質(zhì)的量遠多于模板DNA,且模板DNA結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,所以單鏈模板DNA間形成雙鏈的機會很少。③延伸:將反應(yīng)體系溫度上升到72℃左右,溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)的作用下,根據(jù)堿基互補配對原則使DNA鏈按照5′→3′不斷延伸,合成新的與模板DNA鏈互補的鏈。每經(jīng)過一個循環(huán),樣本DNA片段數(shù)量增加一倍,經(jīng)30余次循環(huán),DNA產(chǎn)物量可擴增幾百萬倍。

2.誘發(fā)基因突變

【例2】(2018年,重慶調(diào)研)透明質(zhì)酸酶在臨床上常用作藥物滲透劑,目前主要從動物組織中提取?？蒲腥藛T嘗試將透明質(zhì)酸酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌,使其得到高效表達。如圖4中NcoⅠ和XhoⅠ為限制酶,重疊延伸PCR是一種定點突變技術(shù)。據(jù)圖4回答下列問題:

圖4

(1)步驟①的目的是為了保護________,PCR的原理是________;PCR擴增的過程是目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈,引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合,然后________,如此重復(fù)循環(huán)。

(2)若圖4中的透明質(zhì)酸酶基因來自cDNA文庫,則在進行步驟②之前需在其前、后端分別接上特定的________,否則該基因就不能轉(zhuǎn)錄。步驟②需要用________(填酶的名稱)切割質(zhì)粒。

(3)圖4中A是________;早期實驗人員利用大腸桿菌作為受體,后來發(fā)現(xiàn)用毛霉或酵母菌作受體更具優(yōu)勢,從生物體結(jié)構(gòu)角度分析,最可能的原因是

。

(4)目的基因?qū)胧荏w細胞后,是否可以穩(wěn)定地維持和表達其遺傳特性,只有通過檢測和鑒定才能知道。檢測轉(zhuǎn)基因生物DNA上是否插入了目的基因的方法是

。

【答案】(1)透明質(zhì)酸酶基因,防止NcoⅠ限制酶破壞目的基因 DNA雙鏈復(fù)制 在DNA聚合酶作用下延伸

(2)啟動子、終止子NcoⅠ和XhoⅠ

(3)基因表達載體 毛霉或酵母菌是真核細胞,有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工

(4)利用目的基因制作成的探針進行DNA分子雜交

說明:重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上,采用具有互補末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,通過重疊鏈的延伸,將不同來源的片段重疊拼接起來的一項新技術(shù)(圖5)。引物2和引物3與模板鏈有部分不能互補的突變位點,而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點)是可以互補的。因此,分別利用引物1和引物2,引物3和引物4進行PCR擴增后,得到的DNA片段可以通過引物2和引物3互補的堿基雜交在一起,它們再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成為一條完整的DNA片段。最后,用引物1和引物4進行擴增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢測定點突變是否成功。

圖5 重疊延伸PCR示意圖

3.檢測目的基因

【例3】(2016年,海淀一模)用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時,得到如圖6電泳圖譜。其中1號為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker),10號為蒸餾水,PCR時加入的模板DNA如圖6所示。據(jù)此作出的分析,不合理的是

圖6

( )

A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500bp之間

B.3號樣品為不含目的基因的載體DNA

C.9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株

D.10號確定反應(yīng)體系等對結(jié)果沒有干擾

【答案】B

說明:PCR技術(shù)可用于檢測已知目的DNA片段的序列:可以設(shè)計合成一對引物,也可以根據(jù)載體克隆位點兩翼存在的恒定序列設(shè)計通用引物,抽提轉(zhuǎn)化后的菌落中的質(zhì)粒DNA,并作為模板進行PCR擴增。利用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物長度,如果長度和預(yù)期片段長度相同,則該轉(zhuǎn)化克隆就可能含有目的序列。

4.檢測目的基因的表達

【例4】早期胚胎細胞異常凋亡是目前克隆豬成功率低的主要原因。用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-qPCR)檢測細胞凋亡抑制基因Bcl-2的表達水平,有助于了解胚胎發(fā)育不同時期Bct-2表達水平與細胞凋亡的關(guān)系(圖7)。下列說法錯誤的是

圖7

( )

A.對重組細胞進行培養(yǎng)時需加入血清、血漿等天然成分

B.卵母細胞采集后,要在體外培養(yǎng)成熟再去核作為受體細胞

C.根據(jù)RT-qPCR熒光強度可計算出基因Bcl-2在相應(yīng)細胞中的翻譯水平

D.胚胎在受體子宮發(fā)育過程中,其遺傳特性不受影響

【答案】C