宏基因組解析溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

李文紅,向立剛,鄭 蘋,李鳳良,汪漢成,余知和

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,貴陽 550006;2.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434000;3.貴州省煙草科學(xué)研究院,貴陽 550081)

【研究意義】小菜蛾(Plutellaxylostella)是十字花科蔬菜上的一類世界性害蟲[1],因其較強(qiáng)的繁殖能力和極易產(chǎn)生抗藥性,使得小菜蛾的田間防治十分困難[2],全球每年用于小菜蛾防治的直接經(jīng)費(fèi)投入高達(dá)5.0×109美元[3]。長期使用化學(xué)農(nóng)藥防控,使得小菜蛾已對高效氯氰菊酯、溴蟲腈、阿維菌素、氰戊菊酯等多種藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[4-7]。雙酰胺類殺蟲劑以魚尼丁受體為作用靶標(biāo),具有優(yōu)良的胃毒作用及一定的觸殺作用,對鱗翅目害蟲卵和幼蟲毒殺效果較佳,而對哺乳動(dòng)物以及環(huán)境生物如蜂、鳥、魚等低毒,與其他傳統(tǒng)類型的殺蟲劑之間無交互抗性[8-9]。溴氰蟲酰胺(Cyantraniliprole)是杜邦公司繼氯蟲酰胺之后成功開發(fā)的雙酰胺類殺蟲劑,自2012年9月在我國正式登記以來,其便被廣泛用于鱗翅目、半翅目和鞘翅目害蟲的防治[10-12]。隨著使用年限的增加,截至目前我國多地已有小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道[5,13]。昆蟲腸道作為外界環(huán)境與宿主接觸的重要場所,其中棲息著大量的微生物[14],這些微生物在昆蟲的生命活動(dòng)中起著重要作用,如參與宿主對天敵病原的防御、營養(yǎng)物質(zhì)的代謝、有害物質(zhì)的降解、抗藥性的產(chǎn)生以及宿主的生長發(fā)育、交配繁殖等[15-19]。因此,揭示溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道微生物的結(jié)構(gòu)和功能變化情況,對延緩小菜蛾對溴氰蟲酰胺的抗藥性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】藥劑脅迫在一定程度上會(huì)影響昆蟲腸道微生物的穩(wěn)態(tài)。甲氰菊酯脅迫下意大利蜜蜂腸道中放線菌門(Actinobacteria)、Gilliamella、泛菌屬(Pantoea)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和志賀氏菌屬(Shigella)相對豐度顯著下降,而拉烏爾菌屬(Raoultella)和變形桿菌屬(Proteus)相對豐度顯著升高[20]。七氟菊酯和溴氰菊酯處理棉鈴蟲后其腸道中有益菌的相對豐度下降,致病菌的相對豐度增加[20]。小菜蛾在長期溴氰菊酯脅迫下其腸道中麥芽香肉桿菌(Carnobacteriummaltaromaticum)相對豐度顯著增加[21],在長期氟苯蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺的脅迫下,小菜蛾腸道中厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度降低,變形菌門(Proteobacteria)相對豐度增加[22]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)溴氰蟲酰胺對小菜蛾防治作用的研究多集中于抗藥性方面,對溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究測定溴氰蟲酰胺浸葉飼喂后小菜蛾腸道中羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和多功能氧化酶活,基于二代宏基因組測序技術(shù)探究溴氰蟲酰胺脅迫對小菜蛾腸道酶活性、微生物菌群、相關(guān)功能基因及抗性基因的影響,為探索小菜蛾腸道微生物響應(yīng)溴氰蟲酰胺脅迫的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小菜蛾為貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所室內(nèi)飼養(yǎng)的長期不接觸任何藥劑的敏感品系。97%溴氰蟲酰胺(Cyantraniliprole)原藥購自美國杜邦公司。新鮮甘藍(lán)葉采自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地,未使用任何藥劑。

1.2 方法

1.2.1 溴氰蟲酰胺處理小菜蛾幼蟲 經(jīng)試驗(yàn)前測定,溴氰蟲酰胺對供試小菜蛾的LC50值為0.143 mg/L,因此用0.15 mg/L的溴氰蟲酰胺浸泡新鮮甘藍(lán)葉對小菜蛾進(jìn)行飼喂處理。將新鮮甘藍(lán)葉表面清洗瀝干后放入0.15 mg/L的溴氰蟲酰胺藥液中浸泡30 s,取出晾至表面無水痕后,放入小菜蛾飼養(yǎng)籠中,同時(shí)將生長狀況一致的3齡期幼蟲接入飼養(yǎng)籠中,以無菌水浸泡的甘藍(lán)葉飼喂小菜蛾作為對照組。處理組與對照組飼養(yǎng)籠均置于(25±1)℃、L∶D=16∶8的恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng),12 h后分別選取健康且生長狀況一致的個(gè)體進(jìn)行腸道樣品采集。

1.2.2 小菜蛾幼蟲腸道酶活測定 分別挑取溴氰蟲酰胺處理組與對照組大小一致的小菜蛾幼蟲240頭(3次生物學(xué)重復(fù),每個(gè)重復(fù)80頭),饑餓處理2 h后置于75%酒精中消毒90 s,隨后無菌生理鹽水沖洗3次,最后于超凈工作臺(tái)上挑取腸道(冰浴進(jìn)行),稱重后暫存于-20 ℃冰箱,隨即使用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶試劑盒(GSTs)(Solarbio,BC0355)、多功能氧化酶(MFOs)(蘇州科銘生物,MFO-1-Y)和羧酸酯酶(CarEs)(Solarbio,BC0845)按照其操作說明書在Synergy H4 Hybrid Reader酶標(biāo)儀(BioTek)上進(jìn)行小菜蛾腸道中3種酶活測定。采用DPS軟件中Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行溴氰蟲酰胺處理組與對照組小菜蛾腸道酶活性的差異性檢驗(yàn)。

1.2.3 小菜蛾幼蟲腸道微生物宏基因組測序 分別挑取溴氰蟲酰胺處理組與對照組大小一致的小菜蛾幼蟲200頭,并收集腸道組織。采用糞便基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,DP328)提取腸道微生物基因組DNA,隨后使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA純度與完整性,Qubit?dsDNA Assay Kit in Qubit?2.0 Flurometer(Invitrogen,Q32854)定量提取DNA,最后無菌水稀釋至OD值在1.8～2.0。使用NEBNext?Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB,E7370L)進(jìn)行文庫的構(gòu)建,Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長度約為350 bp的片段,經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫制備。通過Qubit 2.0對文庫初步定量后將文庫稀釋至2 ng/μL,隨后通過Agilent 2100檢測文庫的insert size,Q-PCR準(zhǔn)確定量文庫有效濃度后進(jìn)行Illumina PE150上機(jī)測序。

1.2.4 宏基因組學(xué)分析 測序獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Readfq軟件除去低質(zhì)量(閾值<38)堿基超過40 bp的reads(測序儀單次測序所得到的堿基序列)、含N堿基超過10 bp的reads與adapter(接頭)之間overlap(重疊區(qū))大于15 bp的reads,然后運(yùn)用Bowtie2軟件過濾來自宿主的reads[23-24]。通過MEGAHIT軟件對Clean data(過濾后的數(shù)據(jù))進(jìn)行組裝得到Scaftigs(基因組裝片段)[25-26],用MetaGeneMark軟件對Scaftigs進(jìn)行ORF(開放閱讀框)預(yù)測[27-28],并過濾低于100 nt的結(jié)果,用CD-HIT軟件去除結(jié)果冗余[29-30]。使用DIAMOND軟件將unigenes(經(jīng)過去冗余之后得到的基因序列)與NCBI(美國國家生物技術(shù)信息中心)的NR(非冗余蛋白庫)、KEGG(京都基因與基因組百科全書)、eggNOG(直系同源蛋白分組比對數(shù)據(jù)庫)、CAZy(碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋,MEGAN軟件的LCA(最近公共祖先)算法進(jìn)行物種分類注釋[31]。使用的Resistance Gene Identifier(RGI)軟件將Unigenes與CARD(抗性基因數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行比對獲得抗性基因注釋[32-33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道酶活的影響

由圖1可知,溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾幼蟲腸道羧酸酯酶活性為(54.3±5.0)U/g,較對照組[(33.2±2.2)U/g]顯著升高;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性為(8.41±0.28 )U/g,較對照組[(6.53±0.25 )U/g]顯著升高;而多功能氧化酶活性為(6.82±0.26)U/g,較對照組[(15.23±0.84)U/g]顯著降低。

圖1 溴氰蟲酰胺處理小菜蛾幼蟲腸道的3種解毒酶活力Fig.1 Activities of three detoxification enzymes in gut of P.xylostellalarvae treated with cyantraniliprole

2.2 宏基因組測序質(zhì)量

測序數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后,溴氰蟲酰胺處理組經(jīng)過濾得到過濾數(shù)據(jù)(Clean data)12 937條,Clean data中堿基的GC含量為38.96%,有效數(shù)據(jù)中測序錯(cuò)誤率小于0.01(Q20)和0.001(Q30)的堿基數(shù)分別占總堿基數(shù)的96.94%和91.81%;對照組經(jīng)過濾得到Clean data 12 099條,Clean data中堿基的GC含量為36.56%,有效數(shù)據(jù)中測序錯(cuò)誤率小于0.01和0.001的堿基數(shù)分別占總堿基數(shù)的96.19%和90.02%。將得到的有效數(shù)據(jù)使用MEGAHIT組裝軟件分析,處理組組裝得到Scaftigs 112 771條,總長約120 Mbp,平均長度1117 bp,N50值為1202 bp,對照組組裝得到Scaftigs 108 972條,總長約115 Mbp,平均長1107 bp,N50值為1186 bp。

2.3 溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道微生物組成的影響

溴氰蟲酰胺處理后的小菜蛾腸道中微生物共鑒定到35個(gè)門、64個(gè)綱、125個(gè)目、214個(gè)科、294個(gè)屬、401個(gè)種;對照組小菜蛾腸道中微生物共鑒定到34個(gè)門、66個(gè)綱、120個(gè)目、200個(gè)科、261個(gè)屬、347個(gè)種。

從圖2看出,門水平相對豐度:溴氰蟲酰胺處理后排名前10位菌門依次為微孢子門(Microsporidia,32.89%)、厚壁菌門(Firmicutes,8.65%)、變形菌門(Proteobacteria,1.44%)、毛霉門(Mucoromycota,0.49%)、子囊菌門(Ascomycota,0.26%)、壺菌門(Chytridiomycota,0.25%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota,0.23%)、捕蟲霉門(Zoopagomycota,0.17%)、Candidatus Tectomicrobia(0.14%)和放線菌門(Actinobacteria,0.10%);對照組排名前10位的依次是微孢子門(Microsporidia,43.94%)、厚壁菌門(9.26%)、毛霉門(0.53%)、變形菌門(0.49%)、子囊菌門(0.21%)、擔(dān)子菌門(0.20%)、壺菌門(0.16%)、捕蟲霉門(Zoopagomycota,0.15%)、Candidatus Tectomicrobia(0.10%)和擬桿菌門(Bacteroidetes,0.08%)。屬水平相對豐度:溴氰蟲酰胺處理組相對豐度前10的小菜蛾腸道微生物依次為小孢子蟲屬(Nosema,30.69%)、腸球菌屬(Enterococcus,8.20%)、Anncaliia(1.04%)、腦炎微孢子蟲屬(Encephalitozoon,0.24%)、Rhizophagus(0.18%)、腸孢蟲屬(Enterospora,0.18%)、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter(0.16%)、CandidatusEntotheonella(0.14%)、埃希菌屬(Escherichia,0.14%)和腸桿菌屬(Enterobacter,0.12%);對照組中相對豐度前10的菌屬分別為小孢子蟲屬(41.46%)、腸球菌屬(8.86%)、Anncaliia(1.16%)、腦炎微孢子蟲屬(0.40%)、Rhizophagus(0.22%)、根霉屬(Rhizopu,0.15%)、Pseudoloma(0.12%)、腸孢蟲屬(0.11%)、CandidatusEntotheonella(0.10%)和Smittium(0.10%)。

圖2 溴氰蟲酰胺處理小菜蛾幼蟲腸道微生物群落排名前10位的菌門和菌屬相對豐度Fig.2 The relative abundance of top 10 phyla and genera of microbial community in the gut of P.xylostellalarva treated with cyantraniliprole

2.4 溴氰蟲酰胺對小菜蛾幼蟲腸道功能基因的影響

2.4.1 基于eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋 通過與eggNOG數(shù)據(jù)庫比對分析,小菜蛾幼蟲腸道基因根據(jù)其功能可分為22類(圖3)。溴氰蟲酰胺處理組中除去功能未知基因序列,主要功能基因包括:碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因(G)944個(gè),翻譯后修飾、蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)、伴侶蛋白基因(O)941個(gè),復(fù)制、重組與修復(fù)基因(L)837個(gè),轉(zhuǎn)錄基因(K)773個(gè),氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因(E)718個(gè),細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、囊泡運(yùn)輸基因(U)714個(gè),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制基因(T)701個(gè),翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及合成基因(J)692個(gè)。對照組(CK)中去除功能未知的S部分,主要功能基因包括:翻譯后修飾、蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)基因(O)749個(gè),復(fù)制、重組與修復(fù)基因(L)700個(gè),碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因(G)643個(gè),細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、囊泡運(yùn)輸基因(U)596個(gè),轉(zhuǎn)錄基因(K)561個(gè),翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及合成基因(J)554個(gè),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制基因(T)521個(gè),氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因(E)462個(gè)。

圖3 小菜蛾幼蟲腸道中匹配到eggNOG數(shù)據(jù)庫的主要功能基因數(shù)Fig.3 The number of major functional genes matching to the eggNOG database in the gut of P.xylostellalarvae

2.4.2 基于KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 與KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫對比結(jié)果(圖4)表明,溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道微生物注釋到6大生物代謝通路基因數(shù)分別為細(xì)胞過程(Cellular processes)1068個(gè)、環(huán)境信息處理(Environmental information processing)1411個(gè)、遺傳信息處理(Genetic information processing)1491個(gè)、人類疾病(Human diseases)1332個(gè)、新陳代謝(Metabolism)2262個(gè)、生物體系統(tǒng)(Organismal systems)1027個(gè)。其中,注釋到KEGG二級代謝通路的功能基因中,與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因948個(gè),與碳水化合物代謝相關(guān)基因754個(gè),與翻譯相關(guān)基因605個(gè),與癌癥概述相關(guān)基因525個(gè),與折疊、分類和降解相關(guān)基因449個(gè),與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)基因442個(gè)。對照(CK)小菜蛾腸道微生物注釋到6大代謝通路基因數(shù)分別為細(xì)胞過程(Cellular processes)801個(gè)、環(huán)境信息處理(Environmental information processing)1008個(gè)、遺傳信息處理(Genetic information processing)1203個(gè)、人類疾病(Human diseases)1033個(gè)、新陳代謝(Metabolism)1551個(gè)、生物體系統(tǒng)(Organismal systems)841個(gè)。其中,注釋到的KEGG二級代謝通路的功能基因中717個(gè)基因與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)、509個(gè)基因與碳水化合物代謝相關(guān)、496個(gè)基因與翻譯相關(guān)、415個(gè)基因與癌癥相關(guān)、368個(gè)基因與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)、366個(gè)基因與折疊、分類和降解通路相關(guān)。

圖4 小菜蛾幼蟲腸道中匹配到KEGG數(shù)據(jù)庫的主要代謝通路的功能基因數(shù)Fig.4 The number of functional genes of major metabolic pathways matching to the KEGG database in the gut of P.xylostellalarvae

2.4.3 基于CAZy數(shù)據(jù)庫注釋 研究碳水化合物酶的專業(yè)級數(shù)據(jù)庫CAZy中主要涵蓋6大功能酶類,即糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyl transferases,GTs)、多糖裂合酶(Polysaccharide lyases,PLs)、碳水化合物酯酶(Carbohydrate esterases,CEs)、輔助氧化還原酶(Auxiliary activities,AAs)和碳水化合物結(jié)合模塊(Carbohydrate binding modules,CBMs)。經(jīng)溴氰蟲酰胺處理的小菜蛾幼蟲腸道微生物群落中共鑒定出577個(gè)碳水化合物活性酶基因,其中GHs基因255個(gè),占44.2%;GTs基因132個(gè),占22.9%;CBMs基因97個(gè),占16.8%;AAs基因9個(gè),占12.0%;CEs基因11個(gè),占3.8%;PLs基因2個(gè),占0.3%。未經(jīng)溴氰蟲酰胺處理(CK)的小菜蛾腸道微生物中共鑒定出410個(gè)碳水化合物活性酶基因,其中,GHs基因184個(gè),占44.9%,CBMs基因77個(gè),占18.8%;GTs基因76個(gè),占18.5%,AAs基因61個(gè),占14.9%;CEs基因11個(gè),占2.7%;PLs基因1個(gè),占0.2%(圖5)。

圖5 小菜蛾幼蟲腸道中匹配到CAZy數(shù)據(jù)庫的主要功能基因數(shù)Fig.5 The number of major functional genes matching to the CAZy database in the gut of P.xylostellalarvae

2.5 小菜蛾腸道微生物基于抗性基因注釋結(jié)果

溴氰蟲酰胺處理可一定程度上影響小菜蛾腸道抗性基因種類及數(shù)量。溴氰蟲酰胺處理和對照(CK)的小菜蛾腸道微生物分別共注釋到22類419個(gè)及18類311個(gè)抗生素耐藥性本體(Antibiotic resistance ontology,ARO)。從圖6看出,相對豐度前10的抗生素抗性基因及其在對照組和溴氰蟲酰胺處理組的占比依次為單環(huán)菌素和頭孢霉菌素抗性基因VEB-3(CK 23.8%,溴氰蟲酰胺11.4%),大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因macB(CK 9.5%,溴氰蟲酰胺10.4%),糖肽抗生素抗性基因vanXA(CK 6.8%,溴氰蟲酰胺7.9%),苯丙醇類抗生素抗性基因mexN(CK6.6%,溴氰蟲酰胺7.3%),糖肽抗生素抗性基因vanSE(CK 5.7%,溴氰蟲酰胺7.0%),大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、鏈霉素類抗生素抗性基因Erm47(CK 5.8%,溴氰蟲酰胺6.7%),氟喹諾酮類、二氨基嘧啶類、肽類抗生素抗性基因MexF(CK 4.5%,溴氰蟲酰胺5.7%),大環(huán)內(nèi)酯類、內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基香豆素抗生素抗性基因OpmB(CK 4.3%,溴氰蟲酰胺5.0%),氟喹諾酮類、頭孢霉菌素、頭霉素、青霉烷類抗生素抗性基因AcrF(CK 4.3%,溴氰蟲酰胺4.4%),大環(huán)內(nèi)酯類、內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基香豆素抗生素抗性基因MuxB(CK 4.0%,溴氰蟲酰胺4.1%)。

圖6 小菜蛾幼蟲腸道中匹配到CARD數(shù)據(jù)庫主要抗性基因的相對豐度Fig.6 Relative abundance of major resistance genes matching to the CARD database in the gut of P.xylostellalarvae

3 討 論

已有研究表明,昆蟲抗藥性的產(chǎn)生與其解毒酶活性的增強(qiáng)有關(guān)[34],如小菜蛾在經(jīng)氯蟲苯甲酰胺連續(xù)處理5代后,其體內(nèi)的CarEs和細(xì)胞色素P450O-脫乙基酶的比活力明顯增強(qiáng)[35];溴氰蟲酰胺與氯蟲苯甲酰胺同為雙酰胺類殺菌劑,Wang等[36]研究認(rèn)為,CarEs、GSTs和細(xì)胞色素P450在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性中發(fā)揮出一定的作用;Hu等[37]通過測定小菜蛾氯蟲苯甲酰胺抗性品系的GSTs活性發(fā)現(xiàn),抗性品系的GSTs活性顯著高于敏感品系;本研究結(jié)果表明,經(jīng)溴氰蟲酰胺處理的小菜蛾腸道CarEs和GSTs活性顯著高于未經(jīng)處理的小菜蛾腸道,結(jié)果與上述氯蟲苯甲酰胺處理小菜蛾后酶活變化結(jié)果一致。然而,MFOs雖然與CarEs和GSTs同為昆蟲體內(nèi)3種重要的解毒酶類[38],但經(jīng)溴氰蟲酰胺處理后的小菜蛾腸道中MFOs的活性卻顯著低于對照組。

有關(guān)小菜蛾腸道微生物的研究中,夏曉峰[39]通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和擴(kuò)增子測序研究表明,小菜蛾3齡幼蟲腸道中的優(yōu)勢菌門為變形菌門和厚壁菌門,優(yōu)勢菌屬為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、阿氏腸桿菌(Enterobacterasburiae)和肉桿菌(Carnobacteriummaltaromaticum);Li等[21]在小菜蛾腸道中分離出了蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtii)和肉桿菌;Xia等[40]從小菜蛾腸道中分離出腸球菌屬(Enterococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)。本研究中,溴氰蟲酰胺處理組與對照組小菜蛾腸道中的優(yōu)勢菌門為微孢子門,其次為厚壁菌門和變形菌門,優(yōu)勢菌屬為小孢子蟲屬(Nosema)、腸球菌屬(Enterobacter)和安卡尼亞孢蟲屬(Anncaliia)等,與前人研究結(jié)果存在差異,原因可能是小菜蛾的生存環(huán)境、食物種類、腸道理化因子及研究方法差異所致[41-42]。經(jīng)溴氰蟲酰胺處理后優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬的相對豐度均存在一定程度的下降,而top10以外的菌群(Others)相對豐度增加,推測可能是由于溴氰蟲酰胺作用改變了小菜蛾腸道環(huán)境,進(jìn)而導(dǎo)致優(yōu)勢菌相對豐度降低,而非優(yōu)勢菌相對豐度增加。

小菜蛾經(jīng)溴氰蟲酰胺處理后其腸道微生物的eggNOG功能基因、KEGG代謝通路、CAZy碳水化合物酶基因以及CARD抗性基因數(shù)目均不同程度增加,這可能是溴氰蟲酰胺作用后小菜蛾腸道中微生物數(shù)量增加所致。小菜蛾腸道微生物的eggNOG功能基因中數(shù)量最多的為碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝,小菜蛾腸道微生物主要功能是協(xié)助宿主消化碳水化合物,提供能量轉(zhuǎn)換和代謝的底物;其余功能基因多為維持微生物生長繁殖及小菜蛾腸道細(xì)胞正常生命活動(dòng)。經(jīng)溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道抗性基因種類及數(shù)量增加,推測其可能是腸道本身對于腸道微生物數(shù)量增加的一種響應(yīng)機(jī)制,旨在降低腸道微生物至正常數(shù)量,相關(guān)推測將在后續(xù)研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

溴氰蟲酰胺浸葉處理飼喂小菜蛾顯著增加其腸道羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性、降低多功能氧化酶活性;降低腸道優(yōu)勢細(xì)菌小孢子蟲屬和腸球菌屬的相對豐度;不同程度增加eggNOG數(shù)據(jù)庫中22類功能基因、KEGG數(shù)據(jù)庫中6類代謝通路、CAZy數(shù)據(jù)庫中6類碳水化合物酶以及CARD數(shù)據(jù)庫中抗生素耐藥性本體數(shù)量。溴氰蟲酰胺可誘導(dǎo)小菜蛾腸道微生物群落中抗藥性相關(guān)基因的表達(dá)。