短小芽孢桿菌過渡態(tài)調(diào)節(jié)因子AbrB的功能特征

李 茜,徐云帆,張長斌,覃 佳,黃 宇,湯必聰,王海燕

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610065)

【研究意義】短小芽孢桿菌是一種可形成內(nèi)生孢子的土壤細(xì)菌,能夠產(chǎn)生多種胞外蛋白質(zhì),例如堿性蛋白酶[1]、脂肪酶[2]和漆酶[3]等,其中堿性蛋白酶已經(jīng)應(yīng)用于化學(xué)、洗滌業(yè)以及制革工業(yè)[4]。此外,短小芽孢桿菌天然存在于植物根系,由于能夠分泌幾丁質(zhì)酶[5]以及具有抗菌活性的抗菌肽[6]、表面活性素[7]等次級(jí)代謝物質(zhì),可以作為生防菌對(duì)某些作物病菌產(chǎn)生拮抗作用。短小芽孢桿菌重要胞外酶及代謝物通常在特定生長階段產(chǎn)生,代謝過程受到一系列調(diào)控因子直接或間接調(diào)控。因此,對(duì)胞外酶及代謝物合成代謝研究有助于促進(jìn)短小芽孢桿菌在工業(yè)和生物防治方面的應(yīng)用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在模式生物枯草芽孢桿菌中,控制生長期依賴性基因表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白被稱為“過渡態(tài)調(diào)節(jié)因子(Transition state regulators)”。AbrB是其中重要一員,它調(diào)節(jié)細(xì)菌從生長活躍期到穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)變。AbrB從細(xì)菌生長停滯期開始到對(duì)數(shù)期階段被大量合成,當(dāng)生長進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí),其表達(dá)水平下降。AbrB在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長期的高表達(dá),可以阻止部分特異性基因在穩(wěn)定期過早表達(dá),包括參與芽孢形成、降解酶合成、氨基酸利用和抗生素生成的基因[8]。在枯草芽孢桿菌中的研究表明,AbrB可以直接調(diào)節(jié)100多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄并間接影響數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)[9]。值得注意的是,盡管AbrB可以調(diào)控大量基因的表達(dá),但它似乎并沒有可識(shí)別的共有DNA序列[10]。研究人員已經(jīng)在枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌等芽孢桿菌中構(gòu)建了abrB基因突變菌株,研究表明,AbrB對(duì)次級(jí)代謝物產(chǎn)生及生物防治效應(yīng)等方面具有重要的影響[11-15]。AbrB是一類高度保守的蛋白質(zhì),在NCBI中查詢短小芽孢桿菌abrB基因,發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列與枯草芽孢桿菌的相似性為84.88%,氨基酸序列相似性為93.75%,差異氨基酸全部位于蛋白質(zhì)的C-端,一般認(rèn)為不同菌種間C-端差異性可能與AbrB物種特異性的功能有關(guān)[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】AbrB在短小芽孢桿菌中參與調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能并不十分清楚。短小芽孢桿菌(B.pumilus)SCU11是生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從野生型菌株BA06經(jīng)過紫外線、亞硝基胍及60Co輻照等方法復(fù)合誘變得到的一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株,其在生物制革領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景[16]。【擬解決的關(guān)鍵問題】為便于對(duì)短小芽孢桿菌(B.pumilus)SCU11菌株進(jìn)行遺傳改造,遺傳學(xué)課題組成員前期在SCU11的基礎(chǔ)上構(gòu)建了尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Uracil phosphoribosyl transferase,UPRT)基因敲除菌株SCU12[17],結(jié)合反向篩選標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其基因組的連續(xù)無痕改造。為研究短小芽孢桿菌AbrB如何影響其生理功能,特別是胞外蛋白酶的產(chǎn)生,本研究擬構(gòu)建abrB基因無痕敲除突變株并進(jìn)行相關(guān)功能分析。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

本研究中使用的菌株和質(zhì)粒如表1所示,所用引物根據(jù)短小芽孢桿菌SCU11基因組設(shè)計(jì)如表2所示。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in the study

1.2 主要酶及試劑

Taq DNA聚合酶、Prime Star MAX高保真DNA聚合酶、多片段克隆連接InFusion?HD Cloning Kit、T4 DNA ligase等購自TaKaRa(大連)公司;限制性內(nèi)切酶購自Fermentas (Thermo)公司;膠回收和純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司;酪素購自Sigma公司;福林酚購自科倫公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基制備

①M(fèi)9基本培養(yǎng)基:Na2HPO417.096 g/L,KH2PO43 g/L,NaCl 0.5 g/L,NH4Cl 1 g/L,MgSO40.24 g/L,CaCl20.011 g/L,葡萄糖0.2%。②LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,葡萄糖5 g/L,NaCl 10 g/L。③蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:黃豆粉20 g/L,麩皮25 g/L,酵母粉3 g/L,NaH2PO40.4 g/L,K2HPO44 g/L,CaCO33 g/L。④群集運(yùn)動(dòng)(Swarming motility)培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中補(bǔ)加0.5%葡萄糖和0.6%瓊脂粉。⑤泳動(dòng)(Swimming motility)培養(yǎng)基:1%蛋白胨,0.25% NaCl和0.3%的瓊脂粉。

1.4 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

以SCU12基因組DNA為模板,利用引物P1/P2、P3/P4、P5/P6分別擴(kuò)增abrB基因兩端同源臂和全長upp基因,通過重疊PCR將3片段連接獲得具有反向篩選標(biāo)記的敲除單元。采用BamHⅠ/PstⅠ雙酶切pUCETs質(zhì)粒使其線性化,最后使用In-Fusion?HD Cloning Kit將敲除單元與線性化質(zhì)粒載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ,挑取轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒,經(jīng)限制酶酶切初步驗(yàn)證正確后送公司測(cè)序,以確定abrB基因無痕敲除載體(pUCETs-ΔabrB)是否成功構(gòu)建。

1.5 短小芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化

短小芽孢桿菌SCU12的電轉(zhuǎn)化參考王超等[18]建立的高滲透壓電轉(zhuǎn)化方法,但將電壓調(diào)整至2000～2200 V。

1.6 abrB基因敲除突變體篩選

敲除突變體的篩選分兩步進(jìn)行。第一步為單交換共整合重組子的篩選:挑取含有敲除載體的SCU12轉(zhuǎn)化子菌落置于無抗的液體LB培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng),按1%的接種量轉(zhuǎn)種于新鮮的無抗LB培養(yǎng)液中,42 ℃培養(yǎng)12 h,重復(fù)2次。將稀釋至合適濃度的菌液涂布于含有5 μg/mL紅霉素LB平板上,42 ℃培養(yǎng)過夜。利用引物P7/P6篩選單交換共整合重組子。第二步為無痕敲除突變體的篩選:將第一步驗(yàn)證正確的共整合重組子菌落接種于無抗LB液體培養(yǎng)基中42 ℃過夜培養(yǎng),將稀釋至合適濃度的菌液涂于含有50 μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-FU)的M9固體培養(yǎng)基上,并在42 ℃培養(yǎng)過夜。待菌落長至合適大小后挑取菌落點(diǎn)至紅霉素平板并且影印于5-FU M9平板,挑取紅霉素敏感且5-氟尿嘧啶抗性菌落,使用同源臂外側(cè)引物P7/P8篩選無痕敲除突變菌株。

1.7 生長曲線繪制

菌株劃線于相應(yīng)抗性平板活化后,挑取單菌落接種于含有5 mL液體LB培養(yǎng)基的試管中37 ℃過夜培養(yǎng)。將菌液OD600 nm值調(diào)整為1.0,分別按照1%的接種量接種于含有25 mL LB或M9培養(yǎng)液的錐形瓶中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng),分別于3、6、9、12、24、36、48、60、72 h取樣,稀釋至合適濃度后,用紫外分光光度計(jì)測(cè)量在600 nm下的吸光值,將測(cè)量結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)得到實(shí)際吸光值,繪制菌株生長曲線。

1.8 菌落形態(tài)觀察

菌液OD600 nm值調(diào)整為1.0,各取1 μL菌液點(diǎn)種于M9固體培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)12 h,設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。觀察菌落形態(tài)的差異并拍照記錄。

1.9 生物膜形成的測(cè)定

菌液OD600 nm值調(diào)整為1.0,取1 μL菌液接種于含有5 mL液體LB培養(yǎng)液的6孔板中,37 ℃靜置培養(yǎng),設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。觀察生物膜形成情況并拍照記錄。

1.10 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

菌液OD600 nm值調(diào)整為1.0,取1 μL菌液接種于同一運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)平板,37 ℃靜置培養(yǎng),設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。觀察測(cè)量細(xì)菌擴(kuò)散的直徑并拍照記錄。利用Swarming培養(yǎng)基檢測(cè)細(xì)菌的群集運(yùn)動(dòng)能力,Swimming培養(yǎng)基檢測(cè)細(xì)菌的泳動(dòng)能力。

1.11 蛋白酶活性測(cè)定

菌液OD600 nm值調(diào)整為1.0,按照4%的接種量轉(zhuǎn)種至含有50 mL蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,34 ℃、200 r/min培養(yǎng),分別在36、48、54和72 h取樣,13 000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清測(cè)定蛋白酶活力,每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù),酶活力測(cè)定方法參照張長斌等[17]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 AbrB氨基酸序列同源性分析

將短小芽孢桿菌中AbrB序列和其他芽孢桿菌中的序列進(jìn)行比對(duì),以分析序列保守性和同源性。由于短小芽孢桿菌SCU12由短小芽孢桿菌BA06誘導(dǎo)而來,2個(gè)菌株的AbrB序列相同(結(jié)果未顯示),故此處直接用BA06中的AbrB序列進(jìn)行分析。所有查找到的序列都編碼94或96個(gè)氨基酸。由圖1可知,多序列比對(duì)顯示,AbrB和DNA互作的N-端高度保守,而C-端相對(duì)不保守。除了前2個(gè)預(yù)測(cè)的N-殘基外,短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的AbrB序列有5個(gè)氨基酸的差別,而芽孢桿菌屬AbrB序列差別集中在C-端的26個(gè)殘基上。一些AbrB C-端結(jié)構(gòu)域替換實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,部分AbrB殘基影響了DNA結(jié)合的活性和多聚化功能。本研究推測(cè)短小芽孢桿菌AbrB的主要功能和枯草芽孢桿菌168中的類似,而C-端結(jié)構(gòu)域的差別決定了AbrB的種特異性。

圖1 來自各種芽孢桿菌屬的AbrB的氨基酸比對(duì)Fig.1 Amino acid alignment of AbrB from various Bacillusspecies

2.2 abrB基因敲除突變體構(gòu)建

為研究AbrB在短小芽孢桿菌中的生物學(xué)功能,首先需要構(gòu)建abrB基因敲除突變菌株。將用于abrB基因無痕敲除的重組載體pUCETs-ΔabrB電轉(zhuǎn)化SCU12,驗(yàn)證獲得正確的轉(zhuǎn)化子后,采用兩步篩選策略(質(zhì)粒整合與刪除)以獲得abrB基因無痕敲除菌株(圖2)。

圖2 基于無痕修飾系統(tǒng)的基因敲除策略Fig.2 Gene deletion strategy based on markerless modification system

在第一步篩選平板上挑取12個(gè)菌落使用abrB基因同源臂外側(cè)引物P7與upp基因引物P6篩選單交換共整合菌株(圖3-A),12個(gè)單菌落均能擴(kuò)增出目的條帶,但3#、8#、10#、12#比其余8個(gè)樣品擴(kuò)增條帶稍大一些,這是由于單交換發(fā)生的位置不同引起的,若第一次交換發(fā)生在同源臂A區(qū),則擴(kuò)增條帶大小為2546 bp;若發(fā)生在同源臂B區(qū),則擴(kuò)增條帶大小為2829 bp(兩者相差一個(gè)待敲除abrB序列大小283 bp)。因此,挑選單交換發(fā)生在同源臂A區(qū)的菌落進(jìn)行敲除突變體的篩選。

在第二步篩選平板上挑取15個(gè)菌落使用同源臂外側(cè)引物P7/P8進(jìn)行abrB基因敲除突變體的篩選,該引物對(duì)擴(kuò)增親本菌株與敲除型菌株的預(yù)期擴(kuò)增條帶大小分別為1722和1439 bp(圖3-B)。其中2#、3#、7#以及13#菌落PCR條帶單一且大小和敲除突變體預(yù)期大小1439 bp一致,推測(cè)這4個(gè)菌落為敲除突變體菌落。5#菌落出現(xiàn)2個(gè)條帶,大小分別和親本菌株及敲除型菌株預(yù)期大小一致,推測(cè)為親本型和敲除型混合菌落。其余泳道條帶大小均和親本型菌株一致,為親本型菌落。將2#菌落對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物測(cè)序,結(jié)果表明,abrB基因編碼區(qū)總共283 bp的區(qū)域已被無痕敲除,將該菌株命名為SCU12(ΔabrB)。

A.篩選單交換共整合轉(zhuǎn)化子。PCR引物使用P6/P7。泳道M:λ-EcoT14 DNA marker;泳道1～12:候選共整合轉(zhuǎn)化子;泳道13:SCU12基因組DNA;泳道14:陰性對(duì)照。B.篩選abrB敲除突變體。PCR引物為P7/P8。泳道M:λ-EcoT14 DNA marker;泳道1～15:候選突變體;泳道16:陰性對(duì)照。A.Screen single crossing-over cointegrants.PCR primer pairs were P6/P7.Lane M:λ-EcoT14 DNA marker;Lane 1-12:Candidate co-integrator transformer;Lane 13:SCU12 genomic DNA;Lane 14:Negative control.B.Screen abrBdeletion mutants.PCR primer pairs were P7/P8.Lane M:λ-EcoT14 DNA marker;Lane 1-15:Candidate mutants;Lane 16:Negative control.圖3 PCR鑒定abrB敲除突變體的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Identification of abrB-deletion mutants by PCR for agarose gel electrophoresis

2.3 abrB基因敲除對(duì)細(xì)菌生長和形態(tài)的影響

在LB和M9基本培養(yǎng)基中分別測(cè)定親本菌株SCU12和突變菌株SCU12(ΔabrB)的生長狀況,2個(gè)菌株在不同培養(yǎng)基的生長曲線如圖4-A所示,無論是豐富培養(yǎng)基LB中,或是營養(yǎng)匱乏的M9培養(yǎng)基中,敲除突變體SCU12(ΔabrB)的生長均明顯慢于親本菌株SCU12。在LB培養(yǎng)基中前4個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)2個(gè)菌株的生長不存在顯著差異,但是在M9培養(yǎng)基中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都存在顯著差異。推測(cè)這是由于在M9培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)匱乏,因此將突變菌株的生長劣勢(shì)放大。結(jié)果表明短小芽孢桿菌abrB基因敲除影響菌株的生長。

在M9固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)的SCU12和SCU12(ΔabrB),菌落形態(tài)如圖4-B所示,SCU12為白色油滴狀中間凸起,而SCU12(ΔabrB)為偏黃色粗糙凹陷型。表明,abrB敲除影響了菌株的菌落形態(tài)及色素合成。

2.4 abrB基因敲除對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成的影響

芽孢桿菌屬細(xì)菌具有鞭毛,能夠依靠鞭毛進(jìn)行各種形式的運(yùn)動(dòng),例如群集運(yùn)動(dòng)和泳動(dòng)[19]。群集運(yùn)動(dòng)是細(xì)菌以群體形式在培養(yǎng)基表面從接種點(diǎn)開始向四周運(yùn)動(dòng),泳動(dòng)是單個(gè)細(xì)菌在液體或半固體培養(yǎng)基表面的遷移運(yùn)動(dòng),使用不同瓊脂濃度的平板可以研究這2種運(yùn)動(dòng)類型(圖5-A,5-B)。群集運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)表明,培養(yǎng)24 h后,親本菌株群體運(yùn)動(dòng)明顯,而突變菌株SCU12(ΔabrB) 幾乎不運(yùn)動(dòng)。泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)顯示,2種菌株在培養(yǎng)到48 h時(shí)運(yùn)動(dòng)均較弱,但統(tǒng)計(jì)分析表明,2種菌株的泳動(dòng)能力在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異。表明,abrB基因敲除導(dǎo)致菌株群集運(yùn)動(dòng)能力顯著下降,對(duì)菌株的泳動(dòng)能力也產(chǎn)生一定程度的影響。

A.abrB敲除突變體(▲)和親本菌株(●)在LB(__)和M9培養(yǎng)基(- - -)的生長曲線。P<0.05 (*),P<0.01 (**),P<0.001 (***);B.abrB敲除突變體和親本菌株SCU12在M9培養(yǎng)基的菌落形態(tài),下同。A.Growth curves of abrBnull mutant (▲) and parent strain SCU12 (●) in LB medium (__) and M9 medium (- - -).P<0.05 (*),P<0.01 (**),P<0.001 (***).B.Colony morphology of ΔabrBmutant and parent strain SCU12 in M9 medium,the same as below.圖4 abrB敲除突變體對(duì)菌株生長和菌落形態(tài)的影響Fig.4 Effects of abrBnull mutation on bacterial growth and morphology

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性與生物膜的形成密切相關(guān)。生物膜是一種微菌落聚集體,主要成分包括蛋白質(zhì)和胞外多糖,可以幫助細(xì)菌抵御外界不良環(huán)境[20]。在LB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)2個(gè)菌株,觀察生物膜的形成(圖5-C)。經(jīng)過18 h的靜置培養(yǎng),SCU12培養(yǎng)物表面產(chǎn)生輕微的絮凝,沒有明顯的生物膜形成,但突變株在表面產(chǎn)生一層清晰的淡黃色生物膜。然而,當(dāng)培養(yǎng)持續(xù)到48 h,SCU12也形成了一層清晰的淡黃色生物膜,且兩種菌株的生物膜厚度非常相近(數(shù)據(jù)未顯示)。表明,abrB的敲除使突變菌株生物膜形成時(shí)間提前。

2.5 abrB基因敲除對(duì)細(xì)菌胞外蛋白酶酶活的影響

蛋白酶是短小芽孢桿菌生長穩(wěn)定期以后胞外蛋白的主要成分,其生理功能是降解細(xì)胞外蛋白,為細(xì)菌的生長提供營養(yǎng)。將親本菌株和突變株菌株接種于蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基中,在不同時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)上清液,測(cè)定胞外蛋白酶活性(圖6)。2個(gè)菌株在36 h的蛋白酶活性均較低,差異不大。在48 h突變體菌株的產(chǎn)酶量明顯增加,酶活性顯著高于親本菌株。在54 h胞外蛋白酶活達(dá)到最高值,SCU12為4891 U/mL,SCU12(ΔabrB)為7759 U/mL,此時(shí)突變菌株的蛋白酶活性是親本菌株的1.59倍。說明abrB基因敲除提高了菌株胞外蛋白酶酶活。

圖6 abrB敲除突變對(duì)細(xì)菌胞外蛋白酶酶活的影響Fig.6 The effect of abrBdeletion mutation on extracellular protease activity of bacteria

A、B.測(cè)量運(yùn)動(dòng)范圍的直徑并進(jìn)行定量評(píng)估;C.在LB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)18 h后生物膜形成情況。A,B.The diameters of the motility areas were measured for quantitative assessment;C.Biofilm formation after 18 hours static cultivation in LB medium.圖5 abrB敲除突變體對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成的影響Fig.5 Effects of abrBnull mutation on bacterial motility and biofilm formation

3 討 論

AbrB作為重要的過渡態(tài)調(diào)節(jié)因子,在枯草芽孢桿菌中功能研究較多,但在短小芽孢桿菌中的功能尚不明確。通過在NCBI上進(jìn)行nblast比對(duì),本研究發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌AbrB的基因序列和氨基酸序列高度相似,但在蛋白C-端存在差異,這些差異可能與AbrB物種特異性的功能相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)abrB基因敲除后突變菌株的生長顯著降低,證明abrB對(duì)細(xì)菌的正常生長有促進(jìn)作用。在枯草芽孢桿菌[21]和地衣芽孢桿菌中也發(fā)現(xiàn),abrB敲除后對(duì)細(xì)菌的生長有負(fù)面影響[12]。此外,M9基本培養(yǎng)基平板上突變菌株菌落形態(tài)的變化,暗示abrB敲除影響了菌株的菌落形態(tài)及色素合成,這在以往的研究中尚未見報(bào)道,其影響的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

芽孢桿菌屬細(xì)菌具有鞭毛,能夠依靠鞭毛進(jìn)行各種形式的運(yùn)動(dòng),有助于細(xì)菌向營養(yǎng)物質(zhì)處前進(jìn),并且逃離有害環(huán)境,對(duì)細(xì)菌的生存有重要的意義[19]。群集運(yùn)動(dòng)和泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)分析顯示,abrB敲除菌株運(yùn)動(dòng)性降低,其中對(duì)菌株群集運(yùn)動(dòng)能力影響較明顯。Kassem等[22]在枯草芽孢桿菌中也發(fā)現(xiàn)abrB敲除導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力下降。細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和生物膜的形成緊密相關(guān),都對(duì)細(xì)菌的生存有重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)AbrB可以抑制生物膜的形成。研究人員在枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌也發(fā)現(xiàn)AbrB可以抑制生物膜的形成,并且揭示了AbrB可以通過抑制生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)從而抑制生物膜的形成[14]。一般認(rèn)為AbrB和SinR是芽孢桿菌在生物膜和游離生存狀態(tài)之間轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素,細(xì)菌為響應(yīng)外部環(huán)境壓力,在生物膜形成初期,abrB和sinR基因被上調(diào),增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性并抑制胞外多聚物的分泌以阻止生物膜的形成;當(dāng)細(xì)菌在氣-液界面聚集時(shí),abrB和sinR都被下調(diào),降低細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性并增加胞外多聚物的分泌,從而使生物膜迅速形成[23]。而在蠟狀芽孢桿菌中,abrB表達(dá)被發(fā)現(xiàn)和生物膜形成呈正相關(guān)[24]。這些結(jié)果表明,AbrB對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和生物膜形成有不同的調(diào)控效果。

短小芽孢桿菌在生長后期產(chǎn)生大量重要的胞外酶及次級(jí)代謝物,本研究發(fā)現(xiàn)親本菌株和突變菌株間酶活有明顯差異,且突變菌株的胞外蛋白酶活性較親本明顯提高,說明abrB基因的表達(dá)和胞外蛋白酶活性呈負(fù)相關(guān)。作為過渡態(tài)調(diào)節(jié)因子,AbrB主要在對(duì)數(shù)期抑制蛋白酶基因(如aprE)的表達(dá),但有研究顯示,abrB敲除并不會(huì)在對(duì)數(shù)期導(dǎo)致aprE啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的高表達(dá)[25]。然而,也有研究表明,盡管枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄抑制因子CodY和ScoC的雙突變體在對(duì)數(shù)生長期沒有導(dǎo)致2種主要胞外蛋白酶AprE和NprE的高水平表達(dá),但AbrB的進(jìn)一步敲除則導(dǎo)致對(duì)數(shù)期蛋白酶高水平表達(dá)[26],然而這些研究結(jié)果均沒有檢測(cè)敲除突變體在穩(wěn)定期及以后的蛋白酶水平。遺傳學(xué)課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,AbrB在短小芽孢桿菌BA06(SCU11的原始菌株)培養(yǎng)到48 h時(shí)表達(dá)量降低,在48 h之前表達(dá)量較高,而在48 h后表達(dá)量逐漸降低[27]。而本研究結(jié)果顯示,短小芽孢桿菌abrB敲除菌株在培養(yǎng)到生長后期,即48 h時(shí)胞外蛋白酶酶活才呈現(xiàn)出顯著差異。在枯草芽孢桿菌中,轉(zhuǎn)錄抑制因子AbrB、ScoC、CodY和SinR可以結(jié)合到aprE基因啟動(dòng)子區(qū)域抑制轉(zhuǎn)錄的起始[25-26,28],并且它們?cè)赼prE啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域部分重疊。在短小芽孢桿菌BA06中,Liu等[29]也預(yù)測(cè)AbrB是aprE的抑制劑。本研究推測(cè)在短小芽孢桿菌發(fā)酵早期,由于AbrB、ScoC、CodY和SinR等轉(zhuǎn)錄抑制因子表達(dá)水平較高,過飽和地抑制aprE的轉(zhuǎn)錄從而造成胞外蛋白酶酶活較低,即使abrB基因敲除后在這個(gè)時(shí)間段其它調(diào)控因子還是可以強(qiáng)烈地抑制aprE的表達(dá),最終表現(xiàn)為在發(fā)酵到36 h時(shí)親本菌株和突變菌株之間酶活無顯著差異。當(dāng)菌株發(fā)酵培養(yǎng)到后期這些轉(zhuǎn)錄抑制因子表達(dá)水平下降,對(duì)aprE的抑制作用逐步解除,胞外蛋白酶酶活逐漸增加,abrB基因敲除的效應(yīng)得以體現(xiàn),最終導(dǎo)致發(fā)酵后期突變菌株酶活高于親本菌株。

4 結(jié) 論

本研究首先通過反向篩選的方法對(duì)abrB基因進(jìn)行無痕敲除,獲得abrB基因敲除突變體SCU12 (ΔabrB)。其次,生長曲線測(cè)定結(jié)果顯示,abrB基因敲除后突變株生長顯著降低,證明abrB對(duì)細(xì)菌的正常生長有促進(jìn)作用。在M9基本培養(yǎng)基平板培養(yǎng)中觀察菌落形態(tài),發(fā)現(xiàn)突變菌株菌落表面變得粗糙且顏色偏黃。群集運(yùn)動(dòng)和泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)分析顯示,abrB敲除菌株運(yùn)動(dòng)性降低,其中對(duì)菌株群集運(yùn)動(dòng)能力影響較大。此外,abrB敲除突變體菌株形成生物膜的時(shí)間提前,說明AbrB可以抑制生物膜的形成。最后,蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果顯示,在發(fā)酵培養(yǎng)48 h后親本菌株和突變菌株間酶活表現(xiàn)出顯著差異,2個(gè)菌株的酶活都在54 h達(dá)到最高值,突變菌株的胞外蛋白酶活性是親本菌株的1.59倍,說明abrB基因的表達(dá)和胞外蛋白酶活性呈負(fù)相關(guān)。綜上所述,abrB基因在短小芽孢桿菌多個(gè)生理過程中扮演著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,特別是AbrB可調(diào)節(jié)重要的胞外酶及次級(jí)代謝物的表達(dá),abrB基因的破壞顯著增加了胞外蛋白酶的產(chǎn)生,為改善工業(yè)酶生產(chǎn)菌株提供了新途徑。