類器官在呼吸系統(tǒng)研究中的應(yīng)用

鄭紅瑩，胡曉波

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610000；2.成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院/成都市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610000）

肺（lung）是溝通人體內(nèi)部與外界環(huán)境的器官，在各種外界因素（如煙霧、粉塵、細(xì)菌和病毒等）的長(zhǎng)期暴露下，肺部疾病呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性。疾病模型的相對(duì)不足是制約研究肺部疾病發(fā)生機(jī)制及藥物治療的最重要因素。類器官（organoids）是三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一種，它能模擬體內(nèi)環(huán)境，構(gòu)建出與體內(nèi)器官有著相似形態(tài)學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)特性的模型[1]。相比于價(jià)格昂貴且存在物種特異性差異的動(dòng)物模型，類器官具有經(jīng)濟(jì)效益更高、耗時(shí)更短和遺傳更穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[2]。作為一種新的體外模型，類器官可用于研究人體器官發(fā)育、疾病建模、藥物篩選等多個(gè)方面。本文就類器官的培養(yǎng)、肺類器官的主要類型以及類器官在肺部感染性疾病、肺癌、慢性炎癥性肺病、間質(zhì)性肺病中的應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述，以期為探索肺部疾病的發(fā)生機(jī)制及其治療提供參考。

1 類器官的培養(yǎng)

類器官是干細(xì)胞在體外通過三維組織構(gòu)建并定向分化為靶器官，形成與體內(nèi)器官有著相似空間結(jié)構(gòu)、分布的三維細(xì)胞復(fù)合體。干細(xì)胞的主要類型是多能干細(xì)胞和成人干細(xì)胞，細(xì)胞的來源可以是標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，或者是穿刺或手術(shù)切除的組織經(jīng)過酶解得到的單細(xì)胞，以及癌癥患者血液或轉(zhuǎn)移性胸水中得到的癌細(xì)胞[3，4]。而細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)的建立則包括了細(xì)胞嵌入基質(zhì)支架生長(zhǎng)、細(xì)胞在重力與表面張力作用下通過固定培養(yǎng)基的液滴培養(yǎng)和細(xì)胞通過空氣-液體界面在空氣中極化與分化等方式[5]。類器官的生長(zhǎng)還需要三維基質(zhì)與細(xì)胞因子。三維基質(zhì)是模擬體內(nèi)微環(huán)境，并為細(xì)胞生長(zhǎng)提供附著點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)的關(guān)鍵物質(zhì)。常見的三維培養(yǎng)基質(zhì)是支架，類型包括基質(zhì)膠、多孔膜特殊培養(yǎng)小室、水凝膠等[6]。實(shí)現(xiàn)類器官的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，需要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)物質(zhì)，如促進(jìn)增殖的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、促進(jìn)增殖分化的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子以及皮質(zhì)醇激素、抗生素等[7]。通過以上方式，研究人員已成功構(gòu)建了腦[8]、心臟[9]、腸[10]、肝[11]、腎[12]、肺[13]等多個(gè)部位的類器官模型。

2 肺類器官

肺類器官是指細(xì)胞分化后產(chǎn)生的與人體肺有著類似形態(tài)和功能的三維細(xì)胞簇。目前主要將肺類器官分為2 種，分別是由正常細(xì)胞培養(yǎng)形成的氣道類器官和由腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的肺癌類器官。

2.1 氣道類器官 氣道類器官是氣道上皮細(xì)胞或肺泡上皮細(xì)胞構(gòu)成的有著氣管或肺泡樣形態(tài)的三維模型。肺干細(xì)胞（基底細(xì)胞、肺泡細(xì)胞和氣道分泌細(xì)胞）或多能干細(xì)胞是其主要來源。將支氣管基底細(xì)胞在空氣-液體界面培養(yǎng)，最終分化成為外層是基底細(xì)胞、內(nèi)層是纖毛細(xì)胞的支氣管球三維結(jié)構(gòu)[14-16]。肺祖細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，肺祖細(xì)胞可在間充質(zhì)細(xì)胞影響下向氣道和肺泡結(jié)構(gòu)分化[17，18]。將支氣管上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在支持性3D 培養(yǎng)條件下共同培養(yǎng)，混合細(xì)胞群會(huì)快速凝結(jié)和組織，形成離散的上皮和內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生多細(xì)胞管狀氣道類器官[19]。氣道類器官具有人體呼吸系統(tǒng)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，在呼吸系統(tǒng)疾病建模、氣道功能探索等方面已經(jīng)有了相應(yīng)的運(yùn)用和探索，未來有望在肺部疾病的研究中取得進(jìn)一步的成果。

2.2 肺癌類器官 肺癌類器官由腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)形成，目前腺癌、鱗癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌等各型肺癌類器官均能成功培養(yǎng)。這些肺癌類器官模型均表現(xiàn)出了對(duì)應(yīng)類型的組織學(xué)和遺傳學(xué)特征，部分模型更表達(dá)了其特異的生物標(biāo)志物。如肺腺癌類器官能查看到腺泡、乳頭等肺腺癌的病理特征，并表達(dá)其標(biāo)志物napsin-A、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF-1）和細(xì)胞角蛋白7（CK-7）等[18，19]。肺鱗癌類器官顯示了明顯的細(xì)胞邊界和細(xì)胞角化等鱗癌組織學(xué)特征以及特異性標(biāo)記物p63 和CK5/6。肺腺鱗癌類器官則保留了腺癌和鱗狀細(xì)胞癌的混合組織學(xué)特征。大細(xì)胞肺癌類器官顯現(xiàn)了CK734 和CD133 的表達(dá)。小細(xì)胞肺癌類器官有神經(jīng)內(nèi)分泌特征和CD56、TTF-1 等標(biāo)志物的表達(dá)[20]?？傊伟╊惼鞴贀碛性l(fā)腫瘤的病理特征和基因譜，已應(yīng)用于肺癌的發(fā)生機(jī)制、藥物篩選以及精準(zhǔn)治療等多方面研究。

3 類器官在肺部疾病的應(yīng)用

3.1 感染性肺病 呼吸道感染是造成肺部疾病的主要原因，感染因素包括細(xì)菌、病毒、支原體和衣原體等。研究人員已經(jīng)開始運(yùn)用類器官技術(shù)對(duì)病毒感染導(dǎo)致的肺炎進(jìn)行研究。新型冠狀病毒作為全球的公共衛(wèi)生事件，會(huì)引起一系列呼吸系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重者可能危及生命[21]。肺類器官作為呼吸系統(tǒng)的研究模型，在新型冠狀病毒的研究中發(fā)揮了作用。Katsura H等[22]通過研究感染了新型冠狀病毒的肺類器官，發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒會(huì)抑制肺泡Ⅱ型細(xì)胞表面活性劑的表達(dá)，初步探討了新型冠狀病毒在肺部的感染機(jī)制。Ebisudani T 等[23]通過新型冠狀病毒感染模型，發(fā)現(xiàn)了洛匹那韋和瑞德西韋對(duì)新型冠狀病毒的抗病毒作用。呼吸道合胞病毒（RSV）感染導(dǎo)致的肺炎是兒童住院和死亡的主要原因。Sachs N 等[24]在評(píng)估氣道類器官用作RSV 體外感染模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染了RSV的氣道類器官出現(xiàn)了氣道上皮的重塑和IP-10、RANTES 等細(xì)胞因子的大量分泌，提示RSV 感染的發(fā)生機(jī)制。Harford TJ 等[25]在研究產(chǎn)前RSV 感染對(duì)胎兒肺部結(jié)構(gòu)和功能的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染了RSV的氣道類器官出現(xiàn)了克氏細(xì)胞標(biāo)志物CC10 和TRPV1 鈣通道的表達(dá)增加，纖毛細(xì)胞標(biāo)志物FoxJ1的表達(dá)降低以及E-鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，提示了RSV 可能的感染機(jī)制。類器官技術(shù)不僅被應(yīng)用于肺部的病毒感染性疾病，在人體其他器官的病毒感染性研究中也發(fā)揮了作用，如腸道類器官被用于研究輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉等[26]。類器官技術(shù)在病毒感染性疾病研究中擁有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有望在呼吸、消化、循環(huán)和泌尿等多個(gè)系統(tǒng)的病毒感染性疾病中發(fā)揮作用。

3.2 肺癌 肺癌類器官已應(yīng)用于肺癌的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和基因靶向精準(zhǔn)治療等多個(gè)方面。Nakamura H等[27]在肺腺癌細(xì)胞與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）共培養(yǎng)形成的肺癌類器官模型中發(fā)現(xiàn)平足蛋白（Podoplanin）陽性的CAFs 可以調(diào)高肺腺癌細(xì)胞的增殖，推測(cè)Podoplanin 可能參與了肺腺癌的發(fā)病過程。Li YF 等[28]利用肺癌類器官生物庫(kù)，對(duì)氯化白屈菜紅堿、三尖杉酯堿、斑蝥素和小檗堿等多種天然化合物的抗腫瘤療效進(jìn)行了初步研究。Kim M 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，奧拉帕尼抑制了乳腺癌2 號(hào)基因（BRCA2）突變的肺癌類器官的生長(zhǎng)，厄洛替尼則抑制了表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變的肺癌類器官的生長(zhǎng)。Wang Y 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，吡咯替尼對(duì)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）外顯子20 突變的肺癌類器官有明顯的抗腫瘤活性，并通過臨床試驗(yàn)得到驗(yàn)證。雖然肺癌類器官已被廣泛應(yīng)用于肺癌的多項(xiàng)基礎(chǔ)研究，但肺癌的發(fā)病與治療相對(duì)復(fù)雜，單純的肺癌類器官技術(shù)可能有一定的局限性。未來，伴隨著其他新興生物學(xué)技術(shù)（如基因編輯等）與肺癌類器官技術(shù)的結(jié)合，肺癌的研究可能會(huì)取得更多的成果。

3.3 慢性炎癥性肺病 慢性炎癥性肺病包括哮喘和慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）。類器官技術(shù)已被應(yīng)用于上皮細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞增殖分化和肺氣腫等與哮喘、COPD 發(fā)病過程有關(guān)的研究中。Wu X 等[30]在研究WNT-5A 和WNT-5B 對(duì)肺泡上皮祖細(xì)胞的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者均可抑制WNT/β-catenin 信號(hào)和肺上皮細(xì)胞培養(yǎng)生成的類器官數(shù)量，提示上皮細(xì)胞修復(fù)過程可能有非經(jīng)典WNT 信號(hào)通路的參與。Wang A 等[31]在研究Gabrp（γ-氨基丁酸受體）對(duì)克氏細(xì)胞增殖分化的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Gabrp 抑制劑后，小鼠克氏細(xì)胞增殖分化為杯狀細(xì)胞的能力以及生成的類器官數(shù)量均被抑制，推測(cè)克氏細(xì)胞增殖分化過程中可能有GABA/Gabrp 信號(hào)通路的參與。Pouwels SD 等[32]在肺氣腫發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中用RAGE配體LL-37 或HMGB1 處理后，上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生成的類器官數(shù)量明顯減少，但平均直徑增加，提示RAGE 通路可能與肺氣腫的發(fā)生有關(guān)。哮喘和COPD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不能用單一的信號(hào)通路來解釋其過程，未來還需要進(jìn)行更多更深入的研究。

3.4 間質(zhì)性肺病 間質(zhì)性肺病是一組彌漫性實(shí)質(zhì)性肺疾病，最終發(fā)展為肺纖維化和呼吸衰竭。類器官雖然已經(jīng)應(yīng)用于間質(zhì)性肺病的研究，但目前主要處于疾病模型和相關(guān)信號(hào)通路的探索階段。Mccauley KB 等[33]在研究氣道類器官生成時(shí)發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路可以使人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）定向分化為功能性氣道類器官，并通過這種方式，建立了囊性纖維化患者特異性iPSC 衍生的有腫脹缺陷的氣道類器官。Tan Q 等[17]使用人氣道類器官模擬纖維化刺激反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 能抑制氣道類器官的管狀物對(duì)周圍基質(zhì)的侵襲，并且增加纖維化基因的表達(dá)。Chen YW 等[34]在建立氣道類器官時(shí)發(fā)現(xiàn)，HPS1 與細(xì)胞纖維化存在相關(guān)性，推測(cè)HPS1 信號(hào)通路可能參與了肺纖維化過程。

4 總結(jié)與展望

類器官作為新興的三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，受到臨床廣泛關(guān)注。目前，國(guó)外已有大量類器官研究成果，國(guó)內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)室也開始了類器官的初步探索。類器官技術(shù)雖然在不斷發(fā)展，但仍存在部分缺陷：①缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)體系，同時(shí)培養(yǎng)方式根據(jù)目標(biāo)和細(xì)胞的不同而不斷變化；②相比于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，類器官模型較為簡(jiǎn)單，無法完全再現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境，且缺乏神經(jīng)、血管等物質(zhì)；③類器官的構(gòu)建難度大，如培養(yǎng)生成的類器官數(shù)量少，肉眼無法進(jìn)行準(zhǔn)確觀察。但即使類器官存在以上缺陷，類器官模型仍被廣泛應(yīng)用于發(fā)病機(jī)制、藥物篩選、基因和靶向治療等基礎(chǔ)研究。同時(shí)，類器官技術(shù)也開始了與其他新興生物工程技術(shù)相結(jié)合?？傊?，作為新穎的生物學(xué)技術(shù)，類器官在多種疾病的研究中（特別是病毒感染性疾?。┮呀?jīng)展現(xiàn)了不可替代的優(yōu)勢(shì)，未來隨著與其他新興生物工程技術(shù)的結(jié)合，類器官可能會(huì)發(fā)揮出更大的應(yīng)用價(jià)值。