外泌體與糖尿病腎病發(fā)病、治療研究進(jìn)展

潘 璐，陳麗名，谷浩榮 綜述 李小會(huì) 審校

外泌體(exosome)在1982年作為一類由細(xì)胞分泌到胞外的囊泡被Pan和Johnstone初次被發(fā)現(xiàn)，他們?cè)诟櫨d羊網(wǎng)狀細(xì)胞成熟過程時(shí)，發(fā)覺有一種囊泡與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體釋放到細(xì)胞外空間有關(guān)，此類小泡被命名為外泌體[1]。但外泌體被發(fā)現(xiàn)之后十幾年的歷程中，一直被認(rèn)為是細(xì)胞產(chǎn)生的“垃圾”，它的生物學(xué)作用沒有引起研究者的重視。直到1996年，有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞能分泌抗原提呈的外泌體攜帶有共刺激因子、MHC-II類分子和黏附因子，此類外泌體能夠直接刺激效應(yīng)CD4陽性的細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)[2]。自此之后，研究人員發(fā)現(xiàn)，外泌體中包含有DNA片段、mRNA、微小RNA、功能蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等多種具有生物活性的物質(zhì)，而其本身的膜結(jié)構(gòu)還能表達(dá)多種抗原、抗體分子，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[3]。至此，一個(gè)在自然界默默傳輸關(guān)鍵生物信息的“快遞員”慢慢浮出了水面。本文主要介紹外泌體及其在糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)中的研究進(jìn)展。

1 外泌體研究

1.1 外泌體的形成與特征 細(xì)胞會(huì)分泌各種類型的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，各種由細(xì)胞主動(dòng)釋放的納米級(jí)膜囊泡被總稱為EVs[4]。因?yàn)檫@些EVs的大小及分化機(jī)制不同，故將其分類為外泌體、凋亡小體及微泡。凋亡小體及微泡是由質(zhì)膜直接出芽產(chǎn)生的，而外泌體的不同之處在于是早期核內(nèi)體的限制膜向內(nèi)出芽形成的。在這個(gè)過程中，成熟為多泡體(matrix vesiclesbodies，MVBs)[5]，MVBs再通過轉(zhuǎn)運(yùn)(endosomal sorting complex for transport, ESCRT)通路，使之與溶酶體融合而被降解亦或者與質(zhì)膜融合，再由胞吐釋放，即為外泌體[6]。

有研究表明，外泌體可以有效地將mRNA、miRNA甚至質(zhì)粒DNA等載體運(yùn)送到靶細(xì)胞[7]。在外泌體攜帶的諸多載體中，miRNAs可以通過轉(zhuǎn)錄后對(duì)具有識(shí)別位點(diǎn)的靶miRNA進(jìn)行調(diào)控[8]，在發(fā)育、生理過程和疾病中發(fā)揮重要作用。miRNA是具有18～22個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA。它們參與了多種細(xì)胞過程，并可以在尿液等細(xì)胞外環(huán)境中被找到[9]。近年來，越來越多的研究指向了外泌體所攜帶的miRNAs，miRNAs可作為細(xì)胞間的內(nèi)分泌或者旁分泌信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞的表觀遺傳或介導(dǎo)細(xì)胞間的通信。故而外泌體miRNAs可以作為基礎(chǔ)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及參與疾病的治療。外泌體因它的生理作用受到各個(gè)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

1.2 外泌體的分離與鑒定 外泌體密度和體積較小，且在粒徑與組成方面存在異質(zhì)性，這些因素都為外泌體的提取增加了難度。并且收集的樣本可能還會(huì)存在大量高豐度雜質(zhì)蛋白質(zhì)，亦有許多與外泌體的生物物理學(xué)參數(shù)相似的細(xì)胞外囊泡，都會(huì)干擾外泌體的提取結(jié)果。所以，研究外泌體組成與功能的關(guān)鍵在于是否能夠高效地提取出高純度的外泌體。目前，有諸多提取外泌體的方法，包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、色譜法、免疫磁珠法等。每種技術(shù)都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。(1)超速離心法是目前應(yīng)用最廣泛、最可靠的離心方法[10]。它是根據(jù)不同密度和粒徑的顆粒在離心力作用下的沉降速度不同，進(jìn)而分離出外泌體。超速離心法分別在300、2000、10 000 g的離心作用下清除細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞大囊泡。其優(yōu)勢(shì)在于方法成熟、成本低、適用于大體積樣本。然而，該方法的缺點(diǎn)在于設(shè)備要求高、操作比較耗時(shí)，且易造成蛋白質(zhì)聚集。(2)密度梯度離心法屬于一種要求更高的超速離心法，它可以在超速離心法的一系列離心步驟后，采用蔗糖或碘沙醇作為介質(zhì)進(jìn)行超速離心。其原理為在離心力作用下，樣品中的不同組分會(huì)沉降到等密度區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)外泌體與樣品中其他組分的分離。此方法效率高但也同樣依賴昂貴的儀器[11]。(3)聚合物沉淀法通常使用將聚乙二醇作為介質(zhì)，通過降低外泌體的溶解度，然后離心獲得外泌體。聚合物沉淀法的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短，但該方法得到的外泌體純度和回收率較低，并容易產(chǎn)生假陽性，可能會(huì)影響后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)分析[12]。(4)色譜法則是依賴于色譜柱中分子的大小不同將外泌體提取出來，此方法得到的外泌體純度較高，但獲取量少且設(shè)備特殊。(5)免疫親和捕獲技術(shù)是根據(jù)標(biāo)記物和抗體之間的特異性結(jié)合，從而由特定來源分離外泌體。其優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)樣品的需求量較小，但儲(chǔ)存條件較為苛刻、易產(chǎn)生干擾蛋白的缺點(diǎn)使此方法無法得到推廣[13]。至于在研究人員提取外泌體的過程中采用何種技術(shù)，則取決于多種因素，包括起始基質(zhì)(細(xì)胞培養(yǎng)基與生物液)、起始體積、下游分析和研究問題等。

此外，在外泌體分離后，需要進(jìn)行外泌體的鑒定。外泌體的鑒定可以分為物理分析及化學(xué)分析，物理分析包括納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)、動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)、透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)和可調(diào)諧電阻脈沖傳感(tunable resistive pulse sensing，TRPS)等，此類物理分析可以洞察顆粒的大小和濃度。化學(xué)分析通過染色、免疫印跡或蛋白質(zhì)組學(xué)分析來完成，并且可以提供有關(guān)孤立的小泡含量的信息。

2 糖尿病腎病發(fā)病及治療研究

2.1 外泌體參與DN的發(fā)病機(jī)制 DN的患病率隨著糖尿病患者的增加也在不斷上升，已發(fā)展成為危及人類健康的重要?dú)⑹?。了解其發(fā)病機(jī)制對(duì)于DN的診斷和治療至關(guān)重要，而目前DN的發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能是多因素共同作用的結(jié)果。有研究表明，腎臟分泌的外泌體在高糖刺激下誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞間的相互交談被認(rèn)為在DN的發(fā)展和腎功能的下降中發(fā)揮著重要作用[14]。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞來源的外泌體通過增加TGF-β和TGF-β1/PI3K-Akt信號(hào)通路的分泌而誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，故含TGF-β1miRNA的外泌體可能是促進(jìn)系膜擴(kuò)張和腎纖維化的關(guān)鍵因子[16]。另外，來自高糖條件下的管狀細(xì)胞源外泌體可能會(huì)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖和激活，參與旁分泌信號(hào)機(jī)制，導(dǎo)致DN腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[17]。其次，外泌體miRNA是DN進(jìn)展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要是在胰腺β細(xì)胞損傷和胰島素抵抗方面[18]。另外，在高糖條件下，Caspase-11/4和GSDMS介導(dǎo)的凋亡被激活并參與足細(xì)胞丟失和DN的發(fā)展[19]。此外，在高糖處理后，小鼠巨噬細(xì)胞來源的EVs miR-21-5p可以通過靶向A20提高炎癥小體NLRP3和IL-1β的水平，從而導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡[20]。故外泌體及其miRNA可以通過介導(dǎo)多種病理因素來參與DN的發(fā)生和發(fā)展。

2.2 外泌體作為DN的診斷標(biāo)志物 DN是糖尿病患者因腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變而引起的嚴(yán)重并發(fā)癥，若能在早期檢測(cè)到DN的診斷性生物標(biāo)志物，可及時(shí)使用藥物減緩腎功能的喪失以及防止疾病進(jìn)展。DN作為一種腎小球疾病，主要表現(xiàn)為K-W(Kimmelstiel-Wilson)病理性結(jié)節(jié)、腎小球系膜及基底膜增厚等。時(shí)至今日，DN傳統(tǒng)診斷方法仍然是通過測(cè)量腎小球?yàn)V過率、肌酐清除率、血清肌酐和蛋白尿來間接監(jiān)測(cè)腎功能，此類指標(biāo)存在明顯的滯后性及偏倚。腎臟病理穿刺發(fā)現(xiàn)典型的K-W結(jié)節(jié)仍然是診斷DN的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但腎臟病理檢查本身為一種有創(chuàng)性操作，存在禁忌證、并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，且該檢查復(fù)檢的可行性低，故尋求一種DN早期診斷的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了外泌體作為生物學(xué)標(biāo)記物，與DN密切相關(guān)，對(duì)預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生及控制疾病的發(fā)展具有重要意義。

尿液作為發(fā)現(xiàn)腎臟疾病新生物標(biāo)志物的理想生物樣本，具有無創(chuàng)采集且方便簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。Delic等[21]研究證明尿外泌體miRNA表達(dá)譜顯示了Ⅱ型DN患者的差異miRNA特征，其中14種miRNA上調(diào)，2種miRNA下調(diào)，且下調(diào)至少2倍。另外，Khan等[22]研究證明，通過尿外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)、尿可溶性蛋白的分析，可能有助于揭示DN進(jìn)展中發(fā)生的病理生理改變。除了尿液來源外泌體，DN患者還有血清外泌體miRNA譜[23]。這些miRNAs均可能是診斷DN的候選標(biāo)志物。

2.3 外泌體與DN的治療 由于外泌體具有雙層膜和納米尺度大小的生物特性，外泌體可以保護(hù)“貨物”不被補(bǔ)體固定或巨噬細(xì)胞清除，從而延長(zhǎng)其循環(huán)半衰期，提高其生物活性。因此，外泌體可能被用作為治療疾病的藥物傳遞囊泡。Lee等[24]通過跟蹤6例經(jīng)活檢證實(shí)的DN患者，在其活檢時(shí)分離出尿外泌體，并通過二代測(cè)序分析包含的miRNA，最終找出了10個(gè)miRNA參與了已知的和新的DN發(fā)病機(jī)制信號(hào)通路。DN的進(jìn)展和各通路密不可分，例如，在抑制足細(xì)胞Smad1/mTOR信號(hào)通路上，脂肪干細(xì)胞源外泌體(ADSCs derived exosomes，ADSCs-exo)通過增強(qiáng)miR-486的表達(dá)，可以明顯緩解DN癥狀[25]。此后，該團(tuán)隊(duì)又發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exo通過與ZEB2相關(guān)的機(jī)制對(duì)高糖誘發(fā)的足細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程起到保護(hù)作用[26]。因此，ADSCs-Exo制劑可能是緩解足細(xì)胞功能障礙和DN臨床癥狀的有效治療策略。

此外，外泌體可以通過miR-4449調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)、ROS水平和細(xì)胞凋亡，遏制DN的病情進(jìn)展[27]。Mao等[28]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)衍生的外泌體miR-let-7a與USP22有靶向關(guān)系：miR-let-7a可通過升高或沉默USP22來降低血清肌酐、尿素氮等指標(biāo)，抑制腎細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，并抑制DN大鼠腎組織中N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)。人尿源干細(xì)胞(human urine derived stem cells, hUSC)外泌體中miR-16-5p過表達(dá)可保護(hù)高糖誘導(dǎo)的腎組織損傷，并促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A (vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)表達(dá)和足細(xì)胞調(diào)亡[29]。這些外泌體攜帶的miRNA參與了DN的發(fā)病機(jī)制，也為DN的治療開拓了新空間。

除此之外，外泌體與巨噬細(xì)胞的交流在DN治療中也有著舉足輕重的地位，例如，外泌體miR-19b-3p介導(dǎo)了受損管狀上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的溝通，使M1巨噬細(xì)胞被激活,故外泌體/miR19b-3p/SOCS1軸在腎小管間質(zhì)炎癥中發(fā)揮了重要的病理作用[30]，此軸也代表了腎臟疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。M2巨噬細(xì)胞亦可通過分泌外泌體miR-25-3p，抑制雙特異性磷酸酶1的表達(dá)從而激活細(xì)胞自噬，達(dá)到緩解高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的目的[31]。

近年來，外泌體受到越來越廣泛的關(guān)注，外泌體不僅可以維持機(jī)體的正常生命活動(dòng)，而且參與調(diào)控了腫瘤、免疫、組織修復(fù)等領(lǐng)域。隨著研究的深入，外泌體的提取愈發(fā)成熟，外泌體的更多功能被挖掘。但同樣存在著一些問題與挑戰(zhàn)：一是如何更快速、更高效、高純度地提取外泌體，二是更多未知的外泌體及其miRNA怎樣參與到DN的發(fā)病、診斷和治療中，需要進(jìn)一步研究探討。