響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧多糖醇沉工藝

許海燕，徐江，王慧超，丁霞

（陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西咸陽712046）

響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧多糖醇沉工藝

許海燕，徐江，王慧超，丁霞

（陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西咸陽712046）

利用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)曲面法（RSM）優(yōu)化馬齒莧多糖的醇沉工藝。在單因素基礎(chǔ)上選取試驗因素水平，根據(jù)中心組合設(shè)計原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行最佳工藝的優(yōu)化，研究醇沉比、離心時間、離心轉(zhuǎn)速比對馬齒莧多糖提取率的影響。在分析各個因素的顯著性和交互作用后，得到馬齒莧多糖最佳醇沉工藝為在醇沉比為1∶4（mL/mL），離心時間為10min，離心轉(zhuǎn)速為3800r/min時，提取率為9.5%。

馬齒莧；多糖；醇沉工藝；響應(yīng)面法

馬齒莧是一種生活中隨處可見的藥食兩用植物，中國的大部分區(qū)域都有生長。性喜肥沃的土壤，耐干又耐濕，極易存活。作為藥物，其具有清熱解毒、殺菌消腫的作用，被譽(yù)為植物中的抗生素，現(xiàn)代臨床上常用其治療痢疾、腸炎、腎炎、高血壓等疾病[1]；多糖作為馬齒莧藥材當(dāng)中一種很重要的活性成分，有抗癌、抗氧化和降糖的生物活性作用[2]。而馬齒莧又被國家衛(wèi)生部認(rèn)定為藥食兩用的藥材，在民間及臨床當(dāng)中應(yīng)用非常廣泛。

響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種尋找多種因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)理統(tǒng)計方法[3]。可以依靠少量的試驗數(shù)據(jù)來回歸擬合各個因素與最終數(shù)據(jù)間的整體線性關(guān)系，以此來確保整體試驗成果科學(xué)可信。響應(yīng)曲面法具有高效、直觀、方便等特點，結(jié)合了數(shù)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、計算機(jī)科學(xué)，用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，是目前用于工藝條件優(yōu)化的有效方法[4]。

本文采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化馬齒莧多糖的醇沉工藝，用單因素試驗挑選出最優(yōu)單因素方案，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，選取醇沉比、離心時間、離心轉(zhuǎn)速三因素進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，得到最佳的醇沉工藝優(yōu)化方案。

1 材料與儀器

1.1 原料

馬齒莧：購于咸陽百姓樂藥房，經(jīng)過陜西國際商貿(mào)學(xué)院生藥教研室雷國蓮教授的鑒定，確定為馬齒莧正品。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品為D-無水葡萄糖（批號150833-201604）：上海源葉生物科技有限公司；石油醚、乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸：均為分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；水為超純水。

1.3 儀器

TU-1810紫外可見分光光度計：北京普希儀器有限責(zé)任公司；循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；TDL-60B離心機(jī)：Anke；KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限責(zé)任公司；FW-100D高速萬能粉碎機(jī)：天津鑫博得儀器有限責(zé)任公司；TE124S分析天平（萬分之一，sartorius）、CP225D電子分析天平（十萬分之一，sartoeius）、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DHG-9240A干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.4 馬齒莧的處理

將馬齒莧原材料清洗干凈，干燥后粉碎。取馬齒莧粉末加入石油醚置索氏提取器中對馬齒莧粉末進(jìn)行回流脫脂。

將脫脂處理后的粉末，加10倍量水，于超聲提取器中在50 kHz下用溫度75℃，時間60 min進(jìn)行提取。提取完成后，提取液依次進(jìn)行過濾、濃縮至適當(dāng)體積，然后在濃縮液中加入不同倍體積的無水乙醇確定最佳醇沉比；在最佳醇沉比下用不同的離心時間和離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，確定最佳離心時間與離心轉(zhuǎn)速。最后將處理所得沉淀用80%乙醇、丙酮洗滌，減壓干燥后，得馬齒莧粗多糖。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備[5]

精密稱量20 mg在105℃干燥至恒定重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，于100 mL的容量瓶中溶解定容至刻度，制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再精密量取5份1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其分別置于10 mL的容量瓶內(nèi)定容。5份定容后試液各取1 mL加入10 mL具塞試管內(nèi)，再加入1.0 mL的6%苯酚溶液，搖勻后迅速加入5 mL的濃硫酸，將其混合均勻，冷卻。置水浴鍋中沸水浴20 min，冷卻至室溫。另取純水1 mL按照同樣的方法加入試劑，得到空白對照液，在490 nm處測吸光度。具體結(jié)果見表1。

以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡糖糖的濃度為橫坐標(biāo)，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與濃度的關(guān)系Table 1 The glucose standard solution with concentration of relationship

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

其回歸方程y=1.485 0x+0.013 1，相關(guān)系數(shù)R2= 0.998 9。

1.6 馬齒莧多糖提取率的計算

對馬齒莧粗多糖進(jìn)行精密稱取，稱取0.010 g置100 mL容量瓶內(nèi)溶解，定容至刻度。取此定容后的溶液作為供試品溶液，精密吸取1 mL，再按苯酚-硫酸法處理后，用分光光度法測定吸光度，計算出馬齒莧多糖的提取率。

多糖提取率/%=馬齒莧多糖質(zhì)量（g）/馬齒莧樣品質(zhì)量（g）×100

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗考查

根據(jù)單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法，以馬齒莧多糖提取率（%）為指標(biāo)，以醇沉比（A，mL/mL）、離心時間（B，min）、離心轉(zhuǎn)速（C，r/min）為三個單因素，設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken試驗，確定17組試驗，試驗因素水平見表2。

表2 試驗因素水平表Table 2 Factors and level coding of test

2.1.1 醇沉比對提取率的影響

稱取5份已脫脂的質(zhì)量相同的馬齒莧粗粉按照1.4項下要求進(jìn)行處理，提取液濃縮至10 mL。選取醇沉比[濃縮液：無水乙醇，（mL/mL）]分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，五個水平，分別加入預(yù)定條件倍數(shù)的無水乙醇，放置過夜后。在離心機(jī)中用轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心時間為10 min，沉淀用80%乙醇、丙酮洗滌，減壓干燥后，得馬齒莧粗多糖，稱重，計算多糖的提取率。

醇沉比對多糖提取率的影響如圖2所示。

圖2 醇沉比對馬齒莧多糖提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-alcohol ratio on the extraction of the polysaccharides yield

馬齒莧多糖的提取率隨著醇沉比的增加也有所增加，但到達(dá)1∶4（mL/mL）后再增加醇沉比，提取率不增反降?？赡苁且驗?∶4（mL/mL）后一些雜質(zhì)也沉降下來，對多糖測定有影響，使得多糖提取率不增反降，所以確定最佳醇沉比為1∶4（mL/mL）。

2.1.2 離心時間對多糖提取率的影響

稱取5份質(zhì)量相同的已脫脂的馬齒莧粗粉按照1.4項下進(jìn)行提取處理，濃縮液加4倍體積無水乙醇，在離心機(jī)中用轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，時間分別為2、4、6、8、10 min離心，沉淀分別用80%乙醇、丙酮洗滌，減壓干燥后，得馬齒莧粗多糖，稱重，計算多糖的提取率。

圖3 離心時間對馬齒莧多糖提取率的影響Fig.3 Effect of centrifugal time on the extraction of the polysaccharides yield

如圖3所示，隨著離心時間的增加，馬齒莧多糖的提取率也有所增加，但在8 min時達(dá)到最大，隨后增加離心時間多糖提取率變化不大。這可能是因為8 min時多糖已基本沉降完全，再增加離心時間已無意義。所以確定最佳離心時間為8 min。

2.1.3 離心轉(zhuǎn)速對提取率的影響

稱取5份質(zhì)量相同的馬齒莧脫脂粗粉按照1.4項下進(jìn)行提取處理，濃縮液加4倍體積無水乙醇，離心時間確定為8min，在1000、2000、3000、4 000、5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心沉淀，離心后沉淀分別用80%乙醇、丙酮洗滌，減壓干燥后，得馬齒莧粗多糖，稱重，計算出多糖的提取率。

離心轉(zhuǎn)速對多糖提取率的影響如圖4所示。

圖4 離心轉(zhuǎn)速對馬齒莧多糖提取率的影響Fig.4 Effect of the centrifugal rotational speed on the extraction of the polysaccharides yield

從圖4中可以直觀看出，隨著離心轉(zhuǎn)速的增加，馬齒莧多糖的提取率也逐漸增加，在4 000 r/min時達(dá)到最大，再增加轉(zhuǎn)速，提取率反而有所降低。這可能是因為隨著轉(zhuǎn)速的增加，沉降的雜質(zhì)顆粒有所增加，以至于對多糖的測定有所影響，故提取率下降，所以離心轉(zhuǎn)速選擇4 000 r/min為最佳。

2.2 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗，采用響應(yīng)曲面法Box-Benhnken（BBD）設(shè)計試驗優(yōu)化方案，以多糖提取率為響應(yīng)值，使用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。該響應(yīng)曲面設(shè)計的試驗條件和試驗結(jié)果見表3。其中A，B，C分別為離心時間、離心轉(zhuǎn)速與醇沉比三因素。

表3 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計Table 3 Experimental design of response surface methodology

續(xù)表3 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計Continue table 3 Experimental design of response surface methodology

2.2.2 回歸模型方程的建立及方差分析

根據(jù)響應(yīng)曲面法Box－Benhnken對馬齒莧多糖的醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果共設(shè)計出17組試驗點進(jìn)行試驗。試驗結(jié)果使用Design－Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到多元二次回歸模型方程式：

其中：Y為馬齒莧多糖提取率；A、B、C分別為3因素的編碼值。

回歸方差分析見表4，從回歸方程方差分析表中可看出，P模型＜0.000 1，F(xiàn)模型=1 646.43＞0.05，表明了本次研究選用的二次回歸方程模型非常顯著。馬齒莧多糖提取率F失擬=0.14＞0.05，P失擬=0.929 2＞0.05，表示失擬不顯著。綜上所述，該模型能夠很好表示出自變量和響應(yīng)值之間的關(guān)系。表中調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.998 9，說明99.89%響應(yīng)值的變化可以用這個模型解釋，僅有約0.11%的響應(yīng)值不能用此模型進(jìn)行解釋[6]。此外，從表4可以明顯看出，醇沉比、離心時間、離心轉(zhuǎn)速都對馬齒莧多糖的提取率產(chǎn)生顯著的影響，AB、BC交互項影響顯著，說明醇沉比和離心時間及離心時間與離心轉(zhuǎn)速之間具有顯著影響。AC交互項影響不顯著，說明醇沉比與離心轉(zhuǎn)速之間影響不顯著。各二次項的影響都比較明顯。由此可以發(fā)現(xiàn)多糖提取率和各因素之間不是單純的線性關(guān)系。由P值的大小可以得出各因素對于馬齒莧多糖的提取率影響順序為：A（醇沉比）＞B（離心時間）＞C（離心轉(zhuǎn)速）。

表4 回歸方程方差分析表Table 4 Regression equation analysis of variance table

使用Design－Expert 8.0.6 Trial軟件繪制而成的響應(yīng)曲面圖如圖5～圖7所示。

圖6 醇沉比和離心轉(zhuǎn)速對馬齒莧多糖提取率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.6 Liquid-to-alcohol ratio and centrifugal rotational speed response surface and contour plot

圖7 離心時間和離心轉(zhuǎn)速對馬齒莧多糖提取率的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.7 The centrifugal time and centrifugal rotational speed response surface and contour plot

圖8 標(biāo)準(zhǔn)殘差圖Fig.8 Standard residual figure

從這些響應(yīng)曲面圖上可以看出3因素的最佳參數(shù)和各因素之間的交互作用。圖5可以反應(yīng)出醇沉比和離心時間這兩個因素對馬齒莧多糖提取率的影響，從此圖得出最佳醇沉比范圍為1∶3（mL/mL）～1∶5（mL/mL），最佳離心時間范圍為8 min～10 min。圖6可以確定醇沉比和離心轉(zhuǎn)速這兩因素對馬齒莧多糖提取率的影響，從此圖可看出最佳醇沉比范圍為1∶3（mL/mL）～1∶5（mL/mL），最佳離心轉(zhuǎn)速范圍為3 500～4500。圖7可以確定離心時間和離心轉(zhuǎn)速這兩因素對馬齒莧多糖提取率的影響，從圖可以看出離心時間最佳范圍為8 min～ 10 min，離心轉(zhuǎn)速最佳范圍為3 500～4 500。圖8為標(biāo)準(zhǔn)殘差圖，從此圖可以發(fā)現(xiàn)模型值與試驗值擬合度很高，說明此模型可以用來解釋各因素和響應(yīng)值的關(guān)系，可以用此方法對馬齒莧多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對模型方程計算整理?？梢缘贸鲴R齒莧多糖的最佳提取工藝為：醇沉比為1∶4.42（mL/mL），離心時間為10 min，離心轉(zhuǎn)速為3 873.49 r/min。在此工藝條件下馬齒莧多糖的提取率可以達(dá)到9.6%。但是為了在實際生產(chǎn)操作中更為方便快捷，所以將模型所給最佳工藝參數(shù)修正為：醇沉比為1∶4（mL/mL），離心時間為10 min，離心轉(zhuǎn)速為3 800 r/min，在此工藝條件下重復(fù)平行試驗的實際平均提取率為9.5%，相比模型的提取率只降低了約0.1%左右。

3 結(jié)果與討論

目前，中藥材的提取工藝優(yōu)化多為均勻設(shè)計和正交設(shè)計，此類方法不能考察因素之間的相互作用，同時也很難考察多個響應(yīng)值與因素之間的交互作用關(guān)系[7]。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法.通過局部試驗回歸擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，從而得到準(zhǔn)確有效的試驗結(jié)論，能全面考察各個因素的最佳組合及最優(yōu)響應(yīng)值，研究幾種因素間的交互作用[8-10]。

本文以馬齒莧多糖的提取率為考查指標(biāo)，來優(yōu)化馬齒莧多糖的醇沉工藝，通過對醇沉比、離心時間、離心轉(zhuǎn)速三因素的多元回歸和二項擬合建立回歸方程，得到以馬齒莧多糖提取率為響應(yīng)面值的響應(yīng)曲面圖，再通過對試驗結(jié)果的分析，確定了馬齒莧多糖的最佳醇沉工藝參數(shù)。本試驗為馬齒莧多糖的醇沉工藝提供了很好的參數(shù)，也為其它植物多糖的提取提供了良好的試驗依據(jù)。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1996:37

[2] 趙旭功,吳經(jīng)緯,張西榮,等.馬齒莧的藥理研究及臨床應(yīng)用[J].山東醫(yī)藥工業(yè),2002,21(4):34-35

[3] 李瑾,侯淑珍,王景媛,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化牛蒡根多糖提取工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(11):21-25

[4] 吳光杰,李玉萍,皮小芳,等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化馬齒莧多糖提取工藝[J].食品與機(jī)械,2010,3:129-133

[5] 邸明磊,單曉菊,馬麗娜,等.苯酚(硫酸法測定苦豆子多糖含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2012,26(1):59-62

[6] 許海燕,多本加.響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取秦嶺龍膽揮發(fā)油工藝研究[J].西部林業(yè)科學(xué),2014,43(3):37-44

[7] 黃芳,黃子杰.均勻設(shè)計及其在藥學(xué)中的應(yīng)用[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2007,20(5):612-615

[8] Zhang Q A,Fan HX H,Zhang Z Q,et al.Optimization of SC-CO2extraction of oil from almond pretreated with autoclaving[J].LWT-food Sci Technil,2009,42(29):1530-1542

[9] 張淑蘭,吳燕子,王艷梅,等.響應(yīng)面法優(yōu)化核桃隔膜總黃酮提取工藝[J].中國藥房,2010,21(27):2519-2521

[10]秦嬌,姚永紅,侯智霞,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化毛竹葉揮發(fā)油提取工藝[J].食品科學(xué),2010,31(6):1-5

Optimization of Polysaccharides Technology of Ethanol Precipitation from Portulace oleracea L.by Response Surface Methodology

XU Hai-yan，XU Jiang，WANG Hui-chao，DING Xia
（Medical College，Shaanxi Institute of International Trade，Xianyang 712046，Shaanxi，China）

Response surface methodology（RSM）was used to optimization of ethanol precipitation of polysaccharides from Portulace oleracea L..Based on the single factor analysis，the effect of centrifugal time，the centrifugal rotational speed and solid-to-alcohol ratio on polysaccharides from Portulace oleracea L.was evaluated by response surface analysis.Three factors，three levels central composite experimental design was applied and the interactions of each factor on the polysaccharides from Portulace oleracea L.were also investigated.The centrifugal rotational speed and solid-to-alcohol ratio had significant effects on extraction yield.The optimal conditions of polysaccharides in Portulace oleracea L.alcohol sinking process were as follows：the liquid-to-alcohol ratio was 1∶4（mL/mL），centrifugal time was 10 min，and the centrifugal rotational speed was 3 800 r/min. Under such conditions，extraction of the polysaccharides yield was 9.5%.

Portulace oleracea L.；polysaccharides；technology of ethanol precipitation；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.014

2016-08-01

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201513123820）；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（2509）

許海燕（1977—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：中藥化學(xué)成分提取與分離研究。