圓錐角膜關(guān)鍵差異基因的鑒定與生物信息學(xué)分析

［摘要］ 目的 鑒定圓錐角膜（KC）發(fā)病過(guò)程中的差異表達(dá)基因（DEGs），探討KC潛在發(fā)病機(jī)制。

方法 分別收集5對(duì)KC與正常角膜捐獻(xiàn)者的角膜組織，通過(guò)mRNA表達(dá)譜芯片篩選DEGs；借助KEGG通路富集分析明確其生物學(xué)功能；通過(guò)RT－qPCR驗(yàn)證候選DEGs的表達(dá)水平。

結(jié)果 共篩選出1 885個(gè)DEGs，其功能與TGF－β信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、鞘磷脂信號(hào)通路、谷氨酸能突觸等有關(guān)。RT－qPCR驗(yàn)證顯示，絲氨酸/蘇氨酸激酶25（STK25）、?；o酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白4（ACBD4）、鋅指蛋白基因ZBTB38、組織蛋白酶B（CTSB）、3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）、血小板凝血酶敏感蛋白的解聚蛋白樣金屬蛋白酶6（ADAMTS6）、DLG相關(guān)蛋白1（DLGAP1）等候選基因的表達(dá)水平與芯片結(jié)果一致。

結(jié)論 明確了KC差異基因表達(dá)譜，為后續(xù)KC發(fā)病機(jī)制的深入研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［關(guān)鍵詞］ 圓錐角膜；寡核苷酸序列分析；計(jì)算生物學(xué)

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R772.23

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096－5532（2023）02－0221－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.005

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

圓錐角膜（KC）是一種常見(jiàn)的退行性角膜疾病，其特征是角膜中央和旁中央?yún)^(qū)基質(zhì)變薄，角膜曲率增加，通常伴有不規(guī)則散光、高度近視等。全世界范圍內(nèi)，KC的患病率為5‰～25‰，尤其好發(fā)于青少年。既往研究表明，遺傳和環(huán)境因素是決定KC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵要素。系列證據(jù)表明，KC的發(fā)病機(jī)制主要包括膠原纖維排列紊亂、膠原片擴(kuò)張和增寬、基質(zhì)層分裂成多束膠原纖維，最終導(dǎo)致基質(zhì)層變薄。但KC的發(fā)病機(jī)制在分子層面上尚未完全明確。mRNA表達(dá)譜芯片作為一種高通量基因表達(dá)分析平臺(tái)，廣泛應(yīng)用于分子診斷、基因表達(dá)譜分析等領(lǐng)域。本研究以KC病人及正常角膜捐獻(xiàn)者的角膜組織為研究對(duì)象，利用人mRNA表達(dá)譜芯片鑒定KC中差異表達(dá)基因（DEGs），并結(jié)合生物信息學(xué)分析初步揭示其生物學(xué)功能，為后續(xù)KC發(fā)病機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

KC樣本來(lái)自山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院收治的5例角膜移植術(shù)病人術(shù)后組織，其中男4例，女1例，年齡14～21歲，平均（16.0±2.9）歲；其診斷基于病史以及裂隙燈顯微鏡和角膜地形圖等檢查結(jié)果。對(duì)照樣本（CON）為5例健康角膜捐獻(xiàn)者的角膜環(huán)，男4例，女1例，年齡15～21歲，平均（18.2±2.4）歲。兩組樣本的性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。5對(duì)樣本用于mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)。本研究由山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和監(jiān)督，并根據(jù)赫爾辛基宣言的原則進(jìn)行操作。所有參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 總RNA的提取

將收集的角膜樣本采用Trizol法提取RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并將純化的RNA保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 DEGs的鑒定

利用上?？党缮锟萍脊咎峁┑膍RNA表達(dá)譜芯片（8×60 K，Arraystar）進(jìn)行表達(dá)譜分析。首先將RNA樣品擴(kuò)增并轉(zhuǎn)錄成熒光cDNAs，然后將cDNAs與人mRNA微陣列4.0雜交。清洗和固定后，用安捷倫掃描儀G2505C系統(tǒng)對(duì)陣列進(jìn)行掃描。最后使用GeneSpring GX Version 12.1軟件對(duì)所獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分位數(shù)歸一化和進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理，并對(duì)KC與CON的數(shù)據(jù)集進(jìn)行分層聚類(lèi)分析與火山圖可視化分析。以基因表達(dá)差異倍數(shù)≥2以及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示Plt;0.05作為標(biāo)準(zhǔn)鑒定DEGs。

1.4 KEGG通路富集分析

通過(guò)DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifＧcrf.gov/），以Plt;0.05、差異倍數(shù)≥2為界值，對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－qPCR）驗(yàn)證DEGs

根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT－qPCR檢測(cè)。以靶基因濃度/GAPDH濃度作為靶基因校正相對(duì)水平。候選靶基因的引物名稱(chēng)及其序列見(jiàn)表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graph Pad Prism 7.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s形式表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)鑒定KEGG通路富集分析顯著富集的途徑。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KC組織DEGs的聚類(lèi)分析以及火山圖可視化分析

本文分層聚類(lèi)分析結(jié)果表明，KC組與CON組樣本出現(xiàn)明顯聚類(lèi)現(xiàn)象，存在明顯的基因富集（圖1A）。火山圖可視化結(jié)果表明，共鑒定出1 885個(gè)DEGs，其中1 071個(gè)上調(diào)基因（6.19%），814個(gè)下調(diào)基因（4.71%）；15 412個(gè)基因無(wú)顯著變化（89.1%）（圖1B）。表明KC角膜組織發(fā)生明顯的基因表達(dá)差異。

2.2 KC組織DEGs的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，下調(diào)基因主要參與松弛素信號(hào)通路、鞘磷脂信號(hào)通路、長(zhǎng)壽調(diào)控通路、谷氨酸能突觸等信號(hào)通路（圖2A）；而上調(diào)基因主要富集在TGF－β信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向、FcγR介導(dǎo)的吞噬等信號(hào)通路（圖2B）。

2.3 候選DEGs的RT－qPCR水平驗(yàn)證

針對(duì)15個(gè)候選差異基因進(jìn)行的RT－qPCR水平驗(yàn)證結(jié)果顯示，與CON組比較，KC組STK25、ACBD4、CRBN、ZBTB38、CTSB、ABHD16A、SAR1B等基因的表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.821～8.945，Plt;0.05）；而HMGCR、ADAMTS6、SRPX2、DLGAP1等基因的表達(dá)水平則明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.802～7.838，Plt;0.05）。見(jiàn)表2。

A：DEGs的分層聚類(lèi)分析圖，紅色條碼代表表達(dá)上調(diào)基因，藍(lán)色條碼代表表達(dá)下調(diào)基因；B：DEGs的火山圖，藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)基因，紅點(diǎn)代表上調(diào)基因。橫坐標(biāo)為表達(dá)差異倍數(shù)log2（Fold Change），縱坐標(biāo)為－log10（P value）。

3 討 論

作為一種常見(jiàn)的好發(fā)于青春期的擴(kuò)張性角膜疾病，KC會(huì)導(dǎo)致視力嚴(yán)重降低。大量證據(jù)表明，遺傳與環(huán)境因素均在KC的發(fā)病中起關(guān)鍵作用，但目前對(duì)KC的確切病理機(jī)制仍不明確。本研究通過(guò)mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析，建立了KC角膜差異基因表達(dá)譜，并且這些DEGs在功能上與TGF－β信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、鞘磷脂信號(hào)通路以及谷氨酸能突觸等信號(hào)通路有關(guān)。這些結(jié)果為后續(xù)探討KC的發(fā)病機(jī)制研究提供了有價(jià)值的線(xiàn)索。

研究表明，TGF－β信號(hào)通路、鞘磷脂信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路等信號(hào)通路失調(diào)參與KC的發(fā)病。本文通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，TGF－β信號(hào)通路以及鞘磷脂信號(hào)通路等在KC角膜DEGs中顯著富集，進(jìn)一步表明本研究數(shù)據(jù)的可靠性。此外，本研究還在KC角膜DEGs中富集到了松弛素信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路以及FcγR介導(dǎo)的吞噬等尚未報(bào)道的信號(hào)通路。相關(guān)研究顯示，松弛素信號(hào)通路、Erb信號(hào)通路以及FcγR介導(dǎo)的吞噬等信號(hào)通路在角膜發(fā)育、損傷修復(fù)等方面發(fā)揮重要的作用。這提示本文新鑒定的信號(hào)通路可能在KC發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，但需實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。

角膜是神經(jīng)纖維非常豐富的組織，但神經(jīng)在KC發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。有研究通過(guò)共聚焦顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)，KC病人的角膜神經(jīng)在形態(tài)上發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為神經(jīng)纖維變短、基底神經(jīng)叢纏繞過(guò)程增強(qiáng)、基底神經(jīng)叢密度下降。在功能上，KC病人的角膜神經(jīng)支配與神經(jīng)敏感度較正常角膜顯著下降。但目前有關(guān)KC病人角膜神經(jīng)的形態(tài)與功能改變的分子機(jī)制尚不清楚。本研究顯示，KC組織部分DEGs在功能上與谷氨酸能突觸、神經(jīng)軸突導(dǎo)向等信號(hào)通路密切關(guān)聯(lián)，這在分子層面上支持KC病人的角膜神經(jīng)功能異常，但需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

相關(guān)研究顯示，細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡與自噬等是KC的重要病理機(jī)制。作為一種常見(jiàn)的溶酶體半胱氨酸肽酶，CTSB在調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。KC組織中CTSB的表達(dá)上調(diào)提示其可能通過(guò)上述機(jī)制參與KC的發(fā)病過(guò)程。HMGCR是膽固醇合成途徑的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)水平與施尼德結(jié)晶狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)生有關(guān)，提示其可能通過(guò)影響膽固醇合成參與KC的發(fā)病過(guò)程。另外還有研究結(jié)果顯示，ABHD16A和SAR1B基因與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。而本文研究結(jié)果顯示，KC組織中的ABHD16A和SAR1B表達(dá)上調(diào)，推測(cè)上述兩種基因可能通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)代謝途徑影響KC的發(fā)病過(guò)程。此外，ADAMTS可以調(diào)節(jié)基質(zhì)降解、生理和病理組織重塑、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，而KC的病理過(guò)程與基質(zhì)降解密切相關(guān)，ADAMTS6表達(dá)水平上調(diào)提示其可能通過(guò)調(diào)控基質(zhì)降解過(guò)程參與KC的發(fā)病。

KABZA等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，KC組織中存在異常的TGF－β信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，TGF－β信號(hào)通路在KC組織的上調(diào)DEGs中顯著富集，并且TGF－β表達(dá)水平下降。TGF－β信號(hào)是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分泌和組裝的關(guān)鍵信號(hào)通路之一，與纖維化密切相關(guān)。而TGF－β主要作用是抗纖維化，并且可以刺激KC基質(zhì)細(xì)胞（HKC）生成正常的ECM，促進(jìn)正常ECM合成。推測(cè)TGF－β信號(hào)通路的失調(diào)可能與KC組織ECM的改變有關(guān)。

綜上所述，本文通過(guò)人mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)明確了KC差異基因表達(dá)譜，在功能上DEGs與TGF－β信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、鞘磷脂信號(hào)通路、谷氨酸能突觸等有關(guān)。本文結(jié)果可為后續(xù)KC的診斷與機(jī)制研究等提供參考。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）