血清外泌體miR-486-3p對非小細胞肺癌早期診斷價值

［摘要］ 目的 分析血清外泌體miR－486－3p對非小細胞肺癌的早期診斷價值。

方法 選擇非小細胞肺癌病人120例為觀察組，同期體檢健康志愿者120例為對照組，均采集空腹靜脈血，磷鎢酸鈉溶液染色后采用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，Western blot方法檢測外泌體標志性蛋白CD81、TSG101表達，實時熒光定量PCR（RT－qPCR）方法檢測miR－486－3p水平，采用化學發(fā)光法檢測血癌胚抗原（CEA）、糖類抗原125（CA125）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、細胞角蛋白19片段（CYFRA21－1）水平，繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析血清外泌體miR－486－3p診斷非小細胞肺癌的靈敏度和特異度。

結果 透射電鏡觀察可見，外泌體呈盤狀囊泡樣結構，直徑為20～300 nm，顆粒狀。Western blot實驗鑒定表面標志蛋白CD81、TSG101證實為外泌體。觀察組血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21－1水平均高于對照組（t=10.701～31.406，Plt;0.01），miR－486－3p水平低于對照組（t=17.155，Plt;0.01）；觀察組高齡、男性、有淋巴轉移病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR－486－3p表達水平均低于中青年、女性、無淋巴轉移性病灶及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期病人（t=8.168～19.658，Plt;0.05）。ROC曲線分析顯示，血清外泌體miR－486－3p診斷非小細胞肺癌的曲線下面積（AUC）為0.781，95%置信區(qū)間（CI）為0.724～0.839，靈敏度為51.67%，特異度為98.33%，最佳界值為0.945。

結論 血清外泌體miR－486－3p對非小細胞肺癌具有一定的早期診斷價值，血清外泌體miR－486－3p表達水平越低，非小細胞肺癌病人惡化程度越高。

［關鍵詞］ 血清；外泌體；miR－486－3p；癌，非小細胞肺；癌癥早期檢測

［中圖分類號］ R730.4

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0292－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.068

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

球范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡的常見原因之一。非小細胞肺癌是肺癌中最常見的病理類型，其早期診斷具有一定的難度，且5年生存率較低。肺癌發(fā)病早期多無典型臨床表現(xiàn)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)往往已經(jīng)發(fā)展至中晚期，預后不佳。外泌體天然存在于人體體液中，其成分中含有mRNA、miRNA和蛋白質等能夠攜帶重要生物信息的分子，腫瘤源性或腫瘤相關的外泌體含有豐富的生物成分，可作為信號信使參與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、進展和轉移過程中細胞間通訊，是調(diào)節(jié)微環(huán)境的重要遞質。由于這些外泌體可以從各種體液中分離出并檢測到，已成為腫瘤診斷和預后有潛力的新的生物標記物。miRNA是一種非編碼小分子RNA，可調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡，在腫瘤的診斷、預后和治療中發(fā)揮重要作用。外泌體中的miRNA－486－3p在很多惡性腫瘤中均呈現(xiàn)異常表達，如肝癌、胰腺癌、肺癌或胰腺癌等。本研究通過檢測并分析非小細胞肺癌病人和健康體檢者血清外泌體miR－486－3p表達水平差異，探究血清外泌體miR－486－3p對非小細胞肺癌的早期診斷價值。現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年10月—2020年9月，選取本院收治的非小細胞肺癌病人120例為觀察組，以同期本院體檢的健康志愿者120例為對照組。觀察組男93例，女27例；年齡40～79歲，平均（59.87±10.39）歲。病人納入標準：①經(jīng)影像學及病理檢查確診為非小細胞肺癌；②意識清楚，無精神系統(tǒng)疾病，認知正常，能夠通過語言或行為與他人正常交流。排除標準：①肝腎功能嚴重不全者；②免疫系統(tǒng)疾病病人；③合并其他惡性腫瘤者；④除肺部以外其他惡性腫瘤病人。對照組男95例，女25例；年齡38～80歲，平均（60.34±11.27）歲。所有對照組受試者影像學檢查、實驗室檢測均未見明顯異常；意識清醒，無精神系統(tǒng)疾病。所有研究對象知情同意且研究通過本院倫理委員會審核批準。

1.2 檢測指標及方法

采集兩組受試者空腹靜脈血5 mL，以4 000 r/min離心15 min，獲取血清，應用Auto 2000發(fā)光儀（美國，SBI公司）檢測血清中癌胚抗原（CEA）、糖類抗原125（CA125）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）及細胞角蛋白抗原片段21－1（CYFRA21－1）水平。應用Exo Quick－TM試劑（美國，SBI公司）提取血清外泌體，按照試劑說明書操作。用磷鎢酸溶液染色法染色后，透射電鏡（Olympus）觀察外泌體顆粒形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術測定外泌體粒徑大小。應用Western blot法檢測外泌體表面蛋白標志物CD81和TSG101表達，實時熒光定量PCR（RT－qPCR）方法檢測miR－486－3p水平。收集受試者一般資料，對病人手術后腫瘤組織病理學、腫瘤病灶最大直徑等進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism9軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料結果以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用百分比或例數(shù)表示，數(shù)據(jù)間比較采用χ2檢驗；Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。應用 MedCalc 15.2.2 軟件繪制受試者工作特征 （ROC）曲線，分析血清外泌體miR－486－3p診斷非小細胞肺癌的靈敏度和特異度。

2 結 果

2.1 血清外泌體的鑒定

透射電鏡觀察顯示，外泌體具有脂質雙層囊泡結構（圖1）；NTA 技術觀察結果顯示，外泌體顆粒直徑呈單峰正態(tài)分布，峰值處顆粒直徑約為 90 nm，顆粒主要分布于20～300 nm（圖2）。Western blot檢測顯示，外泌體表達CD81和TSG101表面標志蛋白（圖3）。

箭頭所示為外泌體，磷鎢酸溶液染色法染色，放大70 000倍。

2.2 兩組血清檢測指標比較

觀察組血清CEA、CA125、NSE和CYFRA21－1水平均高于對照組（t=10.701～31.406，Plt;0.01），觀察組血清外泌體miR－486－3p水平顯著低于對照組（t=17.155，Plt;0.01）。見表1和圖4。

2.3 不同病理特征非小細胞肺癌miR－486－3p表達比較

觀察組高齡、男性、有淋巴轉移性病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR－486－3p表達水平均低于中青年、女性、無淋巴轉移性病灶及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期病人（t=8.168～19.658，Plt;0.05），而組織學診斷差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。見表2。

2.4 miR－486－3p對非小細胞肺癌的診斷效能評估

ROC曲線分析顯示，血清外泌體miR－486－3p診斷非小細胞肺癌的曲線下面積（AUC）為0.781，95%置信區(qū)間（CI）為0.724～0.839，診斷的靈敏度為51.67%，特異度為98.33%，最佳界值為0.945（圖5）。

3 討 論

肺癌在臨床上發(fā)病率較高，其病死率居惡性腫瘤首位，其中非小細胞肺癌病人占80%以上。很多病人在明確診斷時往往已經(jīng)發(fā)展至中晚期，若早期明確診斷，采取手術等措施綜合治療，5年生存率能夠顯著提高。CEA、CA125、NSE、CYFRA21－1等腫瘤標志物是常見的肺癌篩查指標，但其靈敏度、特異度均較低，無法滿足臨床需求。低劑量螺旋CT具有發(fā)現(xiàn)早期病灶的能力，但卻容易引起醫(yī)生對疾病的誤判，導致進行一些不必要的治療；另外，頻繁的CT檢查也對病人的健康不利。其他檢查，如支氣管病理活檢，屬于有創(chuàng)檢查，病人接受難度較高，對于早期非小細胞肺癌病人的診斷價值比較有限。因此，尋找特異度及靈敏度更高的檢測方法是肺癌篩查的目標。

外泌體的本質是一種細胞外囊泡，其體積較小，直徑通常介于20～300 nm范圍內(nèi)，它們主要由細胞分泌產(chǎn)生，并通過胞吐的方式釋放進入各種體液，外泌體可在血液、尿液、汗液以及腦脊液等多種體液中存在。Exocarta數(shù)據(jù)庫顯示，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的外泌體超過萬種，在各種外泌體中，其組成成分包括蛋白質、mRNA、miRNA以及脂質。這些成分是體內(nèi)新陳代謝的重要物質，參與體內(nèi)的物質交換，因此它們在腫瘤發(fā)生的早期即可出現(xiàn)一定的變化，對腫瘤早期診斷以及治療后病情的評估都有著重要的意義，已成為腫瘤血清生物標記研究的熱點。

本文研究主要檢測血清外泌體中的miRNA。miRNA屬于非編碼RNA，能夠通過mRNA的靶向互補作用而達成對基因表達的調(diào)控作用。目前研究認為，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉移的過程中有一定的臨床作用，這也是癌癥治療中的新思路。有研究表明，miRNA在惡性腫瘤病人體內(nèi)多呈異常表達，與多種惡性腫瘤病人的預后關系密切，具有一定的早期診斷價值。本文結果顯示，觀察組血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21－1的水平均高于對照組，而血清外泌體miR－486－3p水平低于對照組，提示檢測腫瘤標志物能一定程度篩選出肺癌病人。

TNM是分析肺癌的病理類型、浸潤程度等方面的常用分型方式。本文研究結果顯示，觀察組高齡、男性、有淋巴轉移性病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR－486－3p表達水平均低于中青年、女性、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴轉移性病灶者。提示腫瘤細胞惡化程度越高，miR－486－3p表達水平可能越低。

綜上所述，非小細胞肺癌在肺癌中比較常見，預后較差，早期診斷并及時予以治療措施，能夠延長病人生存時間。血清外泌體miR－486－3p屬于常見抑癌miRNA，在非小細胞肺癌中呈現(xiàn)低水平表達，且非小細胞肺癌病人惡化程度越高，血清外泌體miR－486－3p表達水平越低，二者之間呈負相關，提示血清外泌體miR－486－3p對非小細胞肺癌具有一定的早期診斷價值。外泌體miRNA是外泌體的重要組成部分，在機體免疫、疾病進展，尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、變化中都有參與。但是目前，臨床上對于外泌體的研究還處于基礎階段，在理論體系方面尚不完善，并且在科研投入和技術支持方面都存在一定的欠缺，有待進一步深入。外泌體中的很多組成部分均有望成為疾病的無創(chuàng)生物標志物，為疾病的早期發(fā)現(xiàn)、預后評估提供可靠的臨床依據(jù)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）