靶向bFGF及USCs復(fù)合BAM對膀胱重建影響

［摘要］ 目的 研究靶向堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、尿源干細(xì)胞（USCs）復(fù)合膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)（BAM）用于膀胱再生修復(fù)的可行性。

方法 制備多孔結(jié)構(gòu)的BAM。將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為BAM組、BAM/USCs組、BAM/USCs/靶向bFGF組和假手術(shù)組（n=6），除假手術(shù)組均行膀胱半切術(shù)建立膀胱缺損模型。BAM組支架材料為BAM材料加少量PBS，BAM/USCs組將1×106密度的USCs負(fù)載至BAM材料上，BAM/USCs/靶向bFGF組將1×106密度的USCs和10 μmol/L的靶向bFGF共同負(fù)載至BAM材料上，將支架材料縫合于切除膀胱的位置。術(shù)后90 d測定各組尿動力學(xué)，處死大鼠取下再生的膀胱組織進(jìn)行組織學(xué)檢查，評估膀胱再生情況。

結(jié)果

術(shù)后90 d，BAM組、BAM/USCs組、BAM/USCs/靶向bFGF組、假手術(shù)組膀胱順應(yīng)性依次增大（F=345.800，Plt;0.01）。組織學(xué)觀察顯示，4組膀胱平滑肌的再生程度及再生區(qū)域的血管再生程度依次增加（F=65.870～619.100，Plt;0.01）。

結(jié)論 靶向bFGF蛋白、USCs復(fù)合多孔結(jié)構(gòu)的BAM材料具有良好的促膀胱再生能力，是一種具有可行性的修復(fù)支架材料。

［關(guān)鍵詞］ 成纖維細(xì)胞生長因子2；膀胱；引導(dǎo)組織再生術(shù)；膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)；尿源干細(xì)胞

［中圖分類號］ R318.16;R364.33

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0211－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.040

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

先天畸形、嚴(yán)重創(chuàng)傷或腫瘤等往往會導(dǎo)致膀胱結(jié)構(gòu)缺失及功能障礙，需要行膀胱重建手術(shù)才能恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能。目前，自體胃腸道是膀胱重建術(shù)最常用的重建材料，但該手術(shù)術(shù)后伴隨多種并發(fā)癥，如酸堿代謝紊亂、黏液分泌、結(jié)石等。因此，探索新的膀胱重建材料具有重要的臨床意義。膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)（BAM）是良好的膀胱再生修復(fù)材料，可為組織再生提供一定的力學(xué)支持，還可為細(xì)胞的生長、黏附、遷移提供支架。前期研究證實(shí)，靶向堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）可特異性與膠原材料結(jié)合，促進(jìn)大鼠、狗等臨床前動物膀胱的再生修復(fù)，但其重建膀胱中心區(qū)的平滑肌再生及膀胱功能仍不足。研究表明，尿源干細(xì)胞（USCs）更易于向膀胱上皮及膀胱平滑肌組織分化，是組織工程膀胱良好的理想種子細(xì)胞。本文對靶向bFGF、USCs復(fù)合BAM支架對損傷膀胱的再生能力的影響進(jìn)行了研究。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD雄性大鼠（體質(zhì)量為200～260 g，8～10周齡），購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心。REGM添加劑以及RE細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液均購自Lonza公司；高糖DMEM培養(yǎng)液購自HyClone公司；胎牛血清以及GlutaMAX均購自Gibco公司；非必需氨基酸購自Procell公司；青霉素、鏈霉素、bFGF、EGF以及PDGF－AB購自Peprotech公司；抗α－SMA兔單克隆抗體、抗－vWF兔單克隆抗體以及山羊抗兔多克隆二抗購自Abcam公司；抗－Desmin兔單克隆抗體購自Proteintech公司；抗－CD31兔單克隆抗體購自Abclone公司；抗熒光衰減封片劑（含有DAPI）購自中杉金橋；40 g/L多聚甲醛固定液和磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末購自Solarbio公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BAM的制備 無菌條件下取豬的膀胱，PBS清洗，分別經(jīng)5 g/L的SDS、體積分?jǐn)?shù)0.01的TritonX－100及DNA酶/RNA酶處理24 h，無菌純凈水清洗72 h，凍干制備BAM支架材料，鈷60輻照滅菌。應(yīng)用掃描電鏡觀察其脫細(xì)胞效果及相應(yīng)組織的結(jié)構(gòu)。

1.2.2 靶向bFGF蛋白制備 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道的方法，將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a－bFGF以及pET28a－CBD－bFGF分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲破碎菌體，離心收集上清。以鎳柱在AKTA purifier上純化分離bFGF和膠原靶向bFGF。測定其濃度與純度后，用0.2 μm針頭過濾器過濾，凍干后－80 ℃保存。

1.2.3 人USCs的分離培養(yǎng) 無菌條件下收集成人中段尿，裝入50 mL離心管中，以1 500" r/min離心10 min，吸掉上清保留1 mL尿液，加PBS洗滌后800 r/min離心10 min，加USCs原代培養(yǎng)液重懸，加入明膠包被好的12孔板中培養(yǎng)，第3天時換成USCs完全培養(yǎng)液培養(yǎng)（由RE擴(kuò)增培養(yǎng)液和MC擴(kuò)增培養(yǎng)液按照1∶1混合而成。RE擴(kuò)增培養(yǎng)液：將REGM添加劑加入RE細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中；MC擴(kuò)增培養(yǎng)液：高糖DMEM添加體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)0.01的GlutaMAX、體積分?jǐn)?shù)0.01的非必需氨基酸、1×105 U/L青霉素、1×105 μg/L鏈霉素、5 μg/L bFGF、5 μg/L PDGF－AB和5 μg/L EGF）。細(xì)胞在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)，48～72 h后換液，以后每2 d換液1次，觀察培養(yǎng)板細(xì)胞的生長情況，達(dá)80%融合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳至第3代時顯微鏡下拍照觀察USCs的形態(tài)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為BAM組（B組）、BAM/USCs組（C組）、BAM/USCs/靶向bFGF組（D組）和假手術(shù)組（A組），每組6只。各組支架處理方法如下：BAM組加少量PBS；BAM/USCs組將1×106密度的USCs負(fù)載至BAM材料上；BAM/USCs/靶向bFGF組將1×106密度的USCs和10 μmol/L的靶向bFGF共同負(fù)載至BAM材料上。除假手術(shù)組外，其他3組進(jìn)行膀胱半切術(shù)。戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，大鼠腹部正中切口，暴露膀胱，切除大鼠上半部分膀胱，將各組支架材料用5－0可吸收縫合線縫合于切除膀胱的位置，并用3－0不可吸收縫合線在吻合口的前、后、左、右（漿膜面）各縫1針作為標(biāo)記。經(jīng)尿道插管向膀胱內(nèi)注入生理鹽水沖洗膀胱，并檢查是否有吻合口漏。

1.2.5 尿動力學(xué)檢測 術(shù)后90 d對4組大鼠行尿動力學(xué)檢測。大鼠腹腔注射烏拉坦（1 g/kg）麻醉，仰臥位暴露膀胱，在膀胱頂剪一小口，將PE－50聚乙烯導(dǎo)管一端插入，荷包縫合法固定；將導(dǎo)管的另一端通過三通接頭連接到壓力傳感器和輸液泵。生理鹽水以15 mL/h的恒定流量注射。使用多通道信號處理系統(tǒng)對連續(xù)尿動力學(xué)曲線進(jìn)行數(shù)字化和記錄，評估膀胱最大容量和順應(yīng)性。膀胱順應(yīng)性=膀胱容量變化/逼尿肌壓力變化。

1.2.6 組織學(xué)觀察 尿動力學(xué)檢測后對膀胱的大體形態(tài)進(jìn)行拍照，之后處死大鼠，取下膀胱，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制備5 μm石蠟切片。取部分切片進(jìn)行HE染色，鏡下觀察膀胱修復(fù)再生情況。取剩下的切片進(jìn)行免疫熒光染色，使用抗－α－SMA（1∶400稀釋）和抗－Desmin（1∶100稀釋）抗體檢測膀胱平滑肌再生情況，抗－CD31和抗－vWF（均1∶100稀釋）檢測血管再生情況。應(yīng)用Image－Pro Plus軟件計算α－SMA、CD31、Desmin和vWF的陽性面積比。200倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)取6個視野，觀察染色陽性面積。陽性面積比=（染色陽性面積/視野總面積）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BAM形態(tài)與電鏡掃描圖像及USCs的形態(tài)學(xué)觀察

BAM為白色外觀、厚 1 mm、直徑1 cm的圓形貼片，電鏡掃描顯示其為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖1A～C）。倒置顯微鏡下觀察，3代USCs形態(tài)呈米粒狀或短梭形。見圖1D。

2.2 各組膀胱尿動力學(xué)比較

各組最大膀胱容量比較差異有顯著意義（F=395.000，Plt;0.01），BAM組與BAM/USCs組最大膀胱容量差異無顯著性（Pgt;0.05），BAM/USCs/靶向bFGF組最大膀胱容量較BAM/USCs組顯著增加（t=12.790，Plt;0.01）。各組膀胱順應(yīng)性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=345.800，Plt;0.01），BAM組與BAM/USCs組相比較、BAM/USCs組與BAM/USCs/靶向bFGF組相比膀胱順應(yīng)性差異均有顯著性（t=4.661、10.940，Plt;0.01）。見表1。

2.3 組織學(xué)形態(tài)

2.3.1 大體形態(tài) 大體觀察，各組均未發(fā)現(xiàn)殘留的支架材料。BAM組和BAM/USCs組大鼠膀胱與周圍組織黏附較多，其與周圍膀胱組織的整合能力較BAM/USCs/靶向bFGF組差，BAM/USCs/靶向bFGF組的再生部位與本地膀胱融合得更好。此外，在BAM組內(nèi)的1只大鼠膀胱內(nèi)發(fā)現(xiàn)結(jié)石。見圖2A～D。

2.3.2 HE染色表現(xiàn) HE染色結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)

組再生區(qū)域移行上皮細(xì)胞層連續(xù)性好，BAM組膀胱平滑肌再生明顯較差，無完整正常形態(tài)肌層組織再生；BAM/USCs組可見平滑肌及新生血管形成，未發(fā)現(xiàn)腫瘤異變等細(xì)胞；BAM/USCs/靶向bFGF組膀胱平滑肌再生優(yōu)于BAM/USCs組，有較為完整的各層平滑肌結(jié)構(gòu)，但肌纖維排列與假手術(shù)組相比較紊亂。見圖2E～H。

2.3.3 免疫熒光染色 各組平滑肌和血管再生的免疫熒光觀察見圖3。單因素方差分析顯示，各組α－SMA陽性面積比、Desmin陽性面積比、CD31陽性面積比、vWF陽性面積比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=65.870～619.100，Plt;0.01），其中的BAM組與BAM/USCs組相比較、BAM/USCs組與BAM/USCs/靶向bFGF組相比較，各指標(biāo)差異均有顯著性（t=4.381～21.810，Plt;0.05）。見表2。

與C組比較，*F=395.000、345.800，t=12.790、10.940，Plt;0.01；與B組比較，#t=4.661，Plt;0.01。

3 討 論

目前，組織工程支架構(gòu)建時考慮的因素一般有支架材料、種子細(xì)胞和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子。不同的可降解材料已被研究用于膀胱再生，但修復(fù)效果有限。BAM由于其天然來源，具有良好的形態(tài)學(xué)特征，富含膠原蛋白，很好地保存了生物活性因子，因此，應(yīng)用BAM制備的支架材料具有優(yōu)越的生物相容性、良好的生物降解性和低抗原性。

相關(guān)研究顯示，USCs具有更易向膀胱平滑肌及上皮分化的特點(diǎn)。

最初，評估非種子細(xì)胞BAM作為膀胱植入物的大多數(shù)研究均觀察到尿路上皮形成，但伴隨著弱的肌肉層以及移植物收縮和瘢痕形成。應(yīng)用干細(xì)胞移植增強(qiáng)膀胱細(xì)胞再生是一種全新的方法，干細(xì)胞可以直接通過膀胱分化轉(zhuǎn)為膀胱細(xì)胞，或間接通過分泌生長因子來促進(jìn)細(xì)胞再生。USCs是一種容易獲得的自體干細(xì)胞，與其他可用于組織再生的干細(xì)胞類型相比，具有更易向膀胱平滑肌及上皮分化的特點(diǎn)。外源性生長因子通過增強(qiáng)細(xì)胞再生和新生血管來促進(jìn)膀胱再生，但是由于它們的半衰期短，擴(kuò)散迅速，不易控制。

由膠原結(jié)合肽與bFGF融合產(chǎn)生的靶向bFGF不僅能有效阻止bFGF向周圍組織的無效擴(kuò)散，而且能與BAM的主要成分Ⅰ型膠原結(jié)合，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出良好的bFGF生物活性。

本實(shí)驗(yàn)對靶向bFGF、USCs復(fù)合BAM材料在大鼠膀胱重建中的作用進(jìn)行了研究，術(shù)后90 d，尿動力學(xué)檢測結(jié)果表明，BAM/USCs/靶向bFGF組膀胱最大容量與膀胱順應(yīng)性均明顯高于BAM/USCs組和BAM組；HE染色結(jié)果表明，BAM/USCs/靶向bFGF組顯示出更好的材料降解，并更好地融入鄰近組織，再生部位與周圍組織黏連較少。

平滑肌在膀胱儲尿排尿過程中具有重要作用，在膀胱再生時膀胱平滑肌的再生程度是評估重建膀胱的重要指標(biāo)之一。本文研究結(jié)果顯示，BAM/USCs/靶向bFGF組再生雙層縱向圓形肌束平滑肌與正常組織相似；BAM/USCs組可見再生縱向排列的平滑肌束，但在BAM組僅可見少量紊亂的平滑肌樣組織和纖維化形成。表明種植USCs的BAM支架可促進(jìn)膀胱平滑肌再生，靶向bFGF與BAM/USCs支架的特異性結(jié)合可以更好地促進(jìn)膀胱平滑肌再生。

血管化是組織工程和再生的關(guān)鍵過程。新血管的快速形成能為移植物提供氧氣和營養(yǎng)，為其存活提供條件。本文研究結(jié)果顯示，BAM/USCs/靶向bFGF組的血管密度明顯高于其他兩組，其原因可能是靶向bFGF的持續(xù)釋放能刺激內(nèi)皮細(xì)胞浸潤形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。

綜上所述，將USCs種植到結(jié)合靶向bFGF的BAM支架材料上行鼠模型膀胱重建，與未結(jié)合靶向bFGF的BAM支架相比較，BAM/USCs/靶向bFGF支架能有效地促進(jìn)膀胱再生。提示BAM/USCs/靶向bFGF支架可用于膀胱重建，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）