CaSR激動劑R568灌胃對小鼠攝食影響及機制

［摘要］ 目的 探討鈣離子敏感受體（CaSR）激動劑R568對小鼠食物攝入量的影響及其機制。

方法 將雄性KM小鼠隨機分為R568組、二甲基亞砜（DMSO）組、膽囊收縮素A（CCKA）受體拮抗劑L－364，718+R568組和NPS－2143+R568組，每組8只，采用攝食分析方法，觀察灌胃R568對小鼠食物攝入量的影響。將小鼠隨機分為DMSO組和R568組（每組7只），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法觀察R568對小鼠血清、胃腸組織胃饑餓素（Ghrelin）、膽囊收縮素（CCK）、酪酪肽（PYY）、胰高血糖素樣肽－1（GLP－1）及下丘腦CCK、Ghrelin含量變化的影響；采用熒光免疫組化染色方法，觀察R568對下丘腦室旁核（PVN）、外側(cè)區(qū)（LHA）、弓狀核（ARC）中c－fos表達的影響。將小鼠分為DMSO組和R568組（n=7），采用高效液相色譜（HPLC）法觀察R568對下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）和5－羥色胺（5－HT）含量變化的影響。

結(jié)果 與DMSO組相比，R568灌胃后0～2 h內(nèi)小鼠攝食量顯著降低（F=5.274、5.225，Plt;0.01），并且這種作用能被CaSR阻斷劑NPS－2143阻斷；與DMSO組相比較，R568組胃和血清Ghrelin含量顯著降低（t=2.995、4.939，Plt;0.05），近端小腸和血清CCK含量顯著增高（t=3.223、4.970，Plt;0.05），而PYY和GLP－1無明顯變化（Pgt;0.05）。R568灌胃后小鼠下丘腦PVN、LHA、ARC中c－fos陽性細胞數(shù)目顯著增加（t=3.508～6.169，Plt;0.01）。與DMSO組相比，R568灌胃后下丘腦DA含量顯著減少（t=3.288，Plt;0.05），下丘腦5－HT、CCK及Ghrelin含量差異無顯著性（Pgt;0.05）。

結(jié)論 胃腸道CaSR激活后引起小鼠的攝食量減少，其作用機制與調(diào)節(jié)胃腸道CCK和Ghrelin分泌，調(diào)控下丘腦PVN、LHA、ARC神經(jīng)元的興奮性以及下丘腦DA的分泌有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 受體，鈣敏感；下丘腦；進食；神經(jīng)肽類；多巴胺

［中圖分類號］ R363.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0163－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.067

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

鈣離子敏感受體（CaSR）是典型的G蛋白偶聯(lián)受體，主要通過調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素的釋放來控制鈣穩(wěn)態(tài)。研究表明，CaSR在胃基底膜細胞、G細胞及腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)均有表達。近年來CaSR在調(diào)節(jié)胃腸功能中的作用逐漸被重視。CaSR作為營養(yǎng)感受器，可以被Ca2+和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物L－氨基酸激活，參與腸道液體轉(zhuǎn)運和炎癥反應的調(diào)控。動物實驗顯示，CaSR激動劑 R568已被普遍應用于CaSR功能學的研究。胃腸道是機體最大的內(nèi)分泌器官，刺激胃腸道可產(chǎn)生多種肽類激素，包括膽囊收縮素（CCK）、胰高血糖素樣肽－1（GLP－1）、酪酪肽（PYY）等，這些肽類激素通過腦腸軸將信號傳向中樞，使機體產(chǎn)生飽腹感，從而終止攝食?？崭箷r胃腸道可釋放胃饑餓素 （Ghrelin），促進進食。以往的研究結(jié)果顯示，胃腸道攝食調(diào)節(jié)激素的分泌與CaSR密切相關(guān)。此外，下丘腦為攝食調(diào)節(jié)的中心，包括弓狀核（ARC）、室旁核（PVN）、外側(cè)區(qū)（LHA）等腦區(qū)，這些腦區(qū)的神經(jīng)元對攝食功能的調(diào)控由多種神經(jīng)遞質(zhì)參與完成，包括一些肽類神經(jīng)遞質(zhì)（如CCK和Ghrelin）以及一些胺類神經(jīng)遞質(zhì)（如多巴胺（DA）和5－羥色胺（5－HT））。有研究顯示，在下丘腦神經(jīng)元上有大量的CCK、Ghrelin、DA和5－HT受體，進一步說明這些神經(jīng)遞質(zhì)參與下丘腦功能的調(diào)節(jié)。本文研究探討CaSR激動劑R568對小鼠攝食的影響，并從調(diào)控胃腸激素分泌、對中樞攝食相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元興奮性的影響和相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的角度揭示其調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性KM小鼠60只，體質(zhì)量25～30 g， 購于青島大學動物實驗中心。動物飼養(yǎng)間室溫（22±2）℃，相對濕度40%～50%，光照12 h/12 h晝夜循環(huán)，室內(nèi)提供充足的食物和水。所有動物實驗方案均由青島大學醫(yī)學系動物保護與使用委員會批準。

1.1.2 實驗藥物和試劑 CaSR激動劑R568（Tocris bioscience，英國）；CaSR拮抗劑NPS－2143（Glpbio，美國）；膽囊收縮素A（CCKA）受體拮抗劑L－364，718（Tocris bioscience，英國）；多聚甲醛（Sigma－Aldrich，美國）；鼠抗c－fos抗體（Abcam，英國）；熒光素Cy3標記的二抗（Jackson Immunoresearch，美國）。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 外周給藥R568對小鼠攝食量的影響 將小鼠隨機分為二甲基亞砜（DMSO，1 mg/kg）對照組（A組）、R568（3.0 μg/g）給藥組（B組）、CCKA受體拮抗劑L－364，718（50 mg/kg）+R568（3.0 μg/g）組（C組）、NPS－2143（20 μg/g）+R568（3.0 μg/g）組（D組），每組8只小鼠。實驗從18：00開始，籠子里放置預先稱質(zhì)量的標準飼料，各組小鼠灌胃給藥0.3 mL后，分籠單獨飼養(yǎng)，收集每個籠子剩余的飼料，稱量后記錄，計算出給藥后0～、1～、2～、4～24 h小鼠的攝食量。

1.2.2 攝食相關(guān)肽表達檢測 選取14只小鼠隨機分為R568組（3.0 μg/g）、 DMSO對照組（1 mg/kg）（n=7），灌胃給藥1 h后，眼球取血，室溫下放置2 h凝聚后取血清；同時脫臼處死小鼠，取出胃腸組織，剪開沖洗干凈，稱質(zhì)量，按1∶9加入相應體積的0.01 mol/L PBS進行研磨，之以3 000 r/min速度離心20 min，取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，檢測小鼠血清、胃腸道CCK、Ghrelin、PYY、GLP－1和下丘腦CCK、Ghrelin含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 免疫熒光染色法檢測下丘腦內(nèi)參與攝食的相關(guān)腦區(qū)c－fos的表達 小鼠靜脈注射戊巴比妥（100 mg/kg）麻醉，斷頭取腦，在40 g/L甲醛溶液中固定6～8 h，再置于300 g/L蔗糖溶液中脫水。按照小鼠腦圖譜，找到下丘腦，冷凍切片，厚度10～15 μm，放入－40 ℃冰箱保存。按相關(guān)文獻方法，將組織處理之后滴加抗鼠c－fos抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；滴加Cy3標記的二抗（羊抗鼠，1∶300），室溫孵育2 h。封片，BX53熒光顯微鏡下觀察核團內(nèi)c－fos免疫陽性細胞的表達，并拍照。每張切片選擇4～6個不重疊的0.01 mm2 視野，使用CellProfiler－3.1.8軟件進行細胞計數(shù)。

1.2.4 高效液相色譜（HPLC）檢測相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的

含量 將14只小鼠分別灌胃給藥3.0 μg/g R568或10 g/L DMSO，1 h后經(jīng)頸椎脫臼處死，分離下丘腦，存放在－80 ℃冰箱。①神經(jīng)遞質(zhì)提取：準確稱量樣品，按1∶5的比例加入高氯酸溶液（0.6 mol/L），超聲勻漿，4 ℃離心（10 000 r/min， 20 min）。取上清與1.4倍體積的混合液體（20 mmol/L檸檬酸鉀，300 mmol/L磷酸氫二鉀，2 mmol/L EDTA二鈉鹽，雙蒸水配制），4 ℃離心（10 000 r/min， 20 min），取上清液進行色譜分析。②色譜條件為：色譜柱為Kinetex C18 100A 2.6 μm，

50.0 mm×2.1 mm，流動相為甲醇∶雙蒸水=90∶10，0.45 μm微孔膜過濾，超聲波脫氣，流量1.0 mL/min，注入量10 μL/min；發(fā)射波長330 nm，激發(fā)波長290 nm；柱溫30 ℃。③樣品含量測定：將20 μL樣品溶液注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定下丘腦肽類神經(jīng)遞質(zhì)Ghrelin、CCK和胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA和5－HT的含量。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用prism 6軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結(jié)果以±s表示，

多組數(shù)據(jù)間比較采用重復測量設計的方差分析，多重比較采用LSD法；兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 R568灌胃對小鼠攝食量的影響

重復測量設計的方差分析顯示，各組小鼠攝食量比較，組別差異有顯著性（F組別=165.800，Plt;0.01），時間差異無顯著性（F時間=1.147，Pgt;0.05），時間與組別無交互作用（F組別×時間=1.263，Pgt;0.05）。與DMSO組相比，R568給藥組攝食量在0～、1～時段明顯減少（F=5.274、5.225，Plt;0.01），而2～24 h內(nèi)小鼠攝食量差異無顯著性（Pgt;0.05）；L－364，718+R568組和NPS－2143+R568組0～、1～時段小鼠攝食量差異均無顯著性（Pgt;0.05）。與R568組相比，0～、1～時段的NPS－2143+R568組攝食量明顯增加（Plt;0.05），而0～2 h內(nèi)L－364，718+R568組小鼠的攝食量也有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。各組組內(nèi)不同時間小鼠攝食量差異均有顯著性（F=55.000～250.900，Plt;0.001）。見表1。

2.2 R568灌胃對小鼠血清、胃及小腸內(nèi)攝食相關(guān)肽類激素含量的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，與DMSO組相比，R568組血清和胃內(nèi)Ghrelin的含量顯著降低（t=2.995、4.939，Plt;0.05），而血清和近端小腸CCK的含量顯著增高（t=3.223、4.971，Plt;0.05），血清和遠端小腸PYY、GLP－1的含量無明顯變化（Pgt;0.05）。見表2、3。

2.3 R568灌胃對小鼠下丘腦攝食相關(guān)核團c－fos免疫陽性神經(jīng)元表達的影響

熒光免疫組化染色顯示，與DMSO組相比較，R568組下丘腦PVN、LHA、ARC中c－fos免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)量均明顯增加，差異均具有顯著性（t=3.508～6.169，Plt;0.05）。見圖1、表4。

2.4 R568灌胃對小鼠下丘腦肽類和胺類神經(jīng)遞質(zhì)表達的影響

HPLC結(jié)果顯示，與DMSO組相比，R568組小

鼠下丘腦Ghrelin、CCK、5－HT含量差異無顯著性（Pgt;0.05），而DA的含量明顯減少（t=3.288，Plt;0.05）。見表5。

3 討 論

胃腸肽類激素通過刺激機體產(chǎn)生饑餓或者飽腹信號而促進攝食或停止進食，從而使機體達到能量平衡，這些肽類激素包括CCK、GLP－1、PYY等具有抑制攝食功能的腦腸肽及Ghrelin等促攝食因子。WANG等研究發(fā)現(xiàn)，L－精氨酸（L－Arg）能夠通過誘導豬十二指腸內(nèi)CCK的分泌來減少食物的攝入，而CaSR拮抗劑NPS－2143能使CCK分泌減少。ACAR等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠十二指腸內(nèi)給予L－色氨酸（L－Phe）后，可以誘導GLP－1的分泌，但是并不能影響PYY的分泌，而且其分泌是通過CaSR介導的。本文研究表明，R568灌胃給藥0～2 h內(nèi)小鼠的攝食量明顯減少，該作用可以被NPS－2143阻斷；ELISA結(jié)果顯示，小鼠血清和胃內(nèi)Ghrelin的分泌減少，而CCK的分泌增加，與相關(guān)文獻結(jié)果一致。提示R568通過激活胃腸道的CaSR，調(diào)控分泌Ghrelin的X/A樣內(nèi)分泌細胞以及分泌CCK的I細胞的活性，誘導Ghrelin和CCK分泌，從而起到抑制攝食的作用。本文研究結(jié)果還顯示，R568灌胃并不能影響遠端小腸GLP－1的分泌，這與相關(guān)文獻結(jié)果不一致，考慮是由于給藥劑量或者給藥方式的不同所造成的；但是R568灌胃不影響PYY的分泌，與相關(guān)文獻結(jié)果一致。

胃腸道合成和釋放的肽類激素可以通過血液或者迷走神經(jīng)途徑作用于中樞相關(guān)攝食核團，從而影響食欲。本文免疫熒光染色觀察結(jié)果顯示，灌胃給藥R568后，下丘腦PVN、LHA、ARC中c－fos免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)目增加，說明外周CaSR激活后影響到下丘腦攝食相關(guān)核團神經(jīng)元的興奮性，從而引起小鼠攝食量的改變。本研究R568灌胃給藥對小鼠攝食量的影響是否與這些核團內(nèi)攝食肽的分泌相關(guān)？本文對其進行了研究，結(jié)果顯示，R568灌胃給藥后，下丘腦Ghrelin、CCK和5－HT的含量并無明顯變化，而DA表達量明顯減少。大腦內(nèi)的DA能神經(jīng)元主要集中在腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）、下丘腦及中腦黑質(zhì)致密區(qū)，下丘腦中DA主要起促進攝食的作用，而VTA中的DA活動與獎賞攝食相關(guān)。由此推測，R568對下丘腦神經(jīng)元興奮性的影響以及對DA合成的影響可能是由外周肽類激素合成的改變，通過神經(jīng)或內(nèi)分泌作用引起的。另一種可能的機制是，下丘腦攝食相關(guān)核團也有CaSR的表達，而R568呈脂溶性，因此可能透過血－腦脊液屏障，直接進入中樞激活CaSR從而引起下丘腦神經(jīng)元興奮性及中樞遞質(zhì)合成的變化。

綜上所述，R568灌胃給藥起厭食作用，該作用和其調(diào)節(jié)消化道肽類激素Ghrelin和CCK的分泌，以及抑制下丘腦DA的合成有關(guān)。而這些肽類激素和神經(jīng)遞質(zhì)的改變進一步參與下丘腦相關(guān)攝食核團神經(jīng)元的興奮性的調(diào)節(jié)，最終起到抑制攝食的作用。本文研究為深入了解CaSR在能量代謝調(diào)節(jié)方面的作用提供重要的實驗依據(jù)，為能量代謝性疾病的治療提供新的研究靶點。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）