男性煙依賴者CDH23基因甲基化與頸動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系

［摘要］ 目的 探討男性煙依賴者CDH23基因位點(diǎn)甲基化改變及其與頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)系。

方法

選取青島某三甲醫(yī)院健康查體男性130例作為研究對象，有煙依賴史者64例納入煙依賴組，無煙依賴史者66例納入對照組。應(yīng)用問卷調(diào)查方式搜集兩組研究對象一般資料，包括年齡、受教育程度、既往疾病史、煙依賴史等；采用彩色多普勒超聲儀器檢測頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度；采集血樣標(biāo)本，檢測CDH23基因位點(diǎn)甲基化數(shù)值；分析男性煙依賴者CDH23基因位點(diǎn)甲基化改變及其與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。

結(jié)果 煙依賴組和對照組一般資料包括年齡、文化程度、既往疾病史比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；煙依賴組CpG246、CpG48兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化程度低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=－2.454、－2.436，Plt;0.05）；CpG246、CpG48位點(diǎn)甲基化水平與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度相關(guān)（F=6.235、4.692，Plt;0.05），低甲基化水平時(shí)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度顯著大于高甲基化水平。

結(jié)論 煙依賴者CDH23基因CpG位點(diǎn)發(fā)生低甲基化改變，這種低甲基化改變與頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 煙草對健康的危害；CDH23基因；甲基化；動(dòng)脈粥樣硬化；細(xì)胞黏附

［中圖分類號］ R543.5;R163

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0159－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.008

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

調(diào)查顯示，中國吸煙人群數(shù)量仍較多。煙依賴是慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CDH23基因編碼的鈣黏附素23，是鈣黏附素超家族中的典型成員，介導(dǎo)鈣離子依賴的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)黏附。一項(xiàng)對中國煙依賴人群的全基因組檢測結(jié)果顯示，煙依賴人群細(xì)胞黏附分子（鈣黏附素23）與煙依賴相關(guān)。DNA甲基化是基因組的表觀遺傳修飾，參與調(diào)控基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性。尼古丁是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。煙依賴者是否存在CDH23基因位點(diǎn)硬化發(fā)生相關(guān)，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文從臨床角度驗(yàn)證煙依賴是否會(huì)導(dǎo)致CDH23基因位點(diǎn)甲基化狀態(tài)改變，并進(jìn)一步探究這種甲基化狀態(tài)改變是否與頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取青島某三甲醫(yī)院健康查體的男性130例作為研究對象，有煙依賴史者64例納入煙依賴組，無煙依賴史者66例納入對照組。所有研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：①男性，居住地長期住戶且年齡≥45歲；②煙依賴者與對照者之間排除血緣關(guān)系；③過去1年間無除尼古丁以外的濫用物質(zhì)史；④獲得知情同意。煙依賴組入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國精神障礙診斷統(tǒng)計(jì)手冊第四版（DSM－IV）關(guān)于物質(zhì)依賴的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②在過去1年內(nèi)每天吸煙≥10支，吸煙≥2年或戒煙lt;3個(gè)月。對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①無煙依賴史或者明顯被動(dòng)煙依賴史，在入組前總計(jì)吸煙量＜5支；②無定期使用任何尼古丁替代品（例如尼古丁貼片、尼古丁口香糖等）或其他煙草制品（如電子煙、雪茄等）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有除尼古丁以外的濫用物質(zhì)史（如藥物、乙醇等）；②有某種精神疾?。ㄈ缫钟簟⒕穹至寻Y等）或病史；③嚴(yán)重心腦疾病等多臟器功能障礙或無法配合臨床量表調(diào)查者。本研究得到青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對象或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的老年醫(yī)學(xué)科醫(yī)師，采用問卷調(diào)查方式收集研究對象一般資料，包括年齡、受教育年限、煙依賴史（初始吸煙年齡、每日吸煙數(shù)量、吸煙持續(xù)時(shí)間、戒煙時(shí)間等）、既往疾病史；應(yīng)用尼古丁依賴量表（FTND）評估煙依賴者對煙草的依賴程度。既往疾病史包括高血壓、糖尿病、高脂血癥等疾病史，其診斷根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 頸部血管超聲檢查 應(yīng)用GE LOGIQ E9型彩色多普勒超聲檢查設(shè)備，由同一人進(jìn)行頸動(dòng)脈超聲檢查，記錄研究對象頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度。根據(jù)2009年《血管超聲檢查指南》標(biāo)準(zhǔn)，頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度（IMT）lt;1.0 mm 為正常，IMT≥1.0 mm為內(nèi)－中膜增厚。

1.2.3 CDH23基因甲基化檢測 采集受試對象空腹外周靜脈血5 mL，放入EDTA抗凝管中，再提取管中血樣1 mL放入EP管中，－80 ℃冰箱保存。CDH23基因甲基化檢測由上海天昊生物科技有限公司完成，檢測流程：①樣品質(zhì)控；②引物設(shè)計(jì)與單位點(diǎn)PCR條件優(yōu)化；③多重PCR引物panel優(yōu)化；④重亞硫酸鹽處理；⑤樣本目標(biāo)片段多重PCR反應(yīng)；⑥樣本添加特異性標(biāo)簽序列；⑦定量后上機(jī)測序，最終于Illumina Hiseq平臺(tái)上，以2×150 bp的雙端測序模式進(jìn)行高通量測序，獲得基因位點(diǎn)甲基化原始數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Shapiro－Wilk’s方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（頻率）表示，兩組數(shù)據(jù)比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

兩組間平均年齡、受教育年限比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；兩組間高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。見表1。煙依賴組初始吸煙年齡（24.06±7.48）歲，持續(xù)時(shí)間（31.45±9.36）年，每日吸煙量（20.73±9.92）支，F(xiàn)TND評分（6.38±1.30）分。

2.2 兩組CDH23基因甲基化位點(diǎn)差異比較

CDH23基因啟動(dòng)子存在4個(gè)完整的CpG島，分別為CDH23－1、CDH23－2、CDH23－3、CDH23－4，其中CDH23－1包含24個(gè)CpG位點(diǎn)，CDH23－2包含17個(gè)CpG位點(diǎn)，CDH23－3包含12個(gè)CpG位點(diǎn)，CDH23－4包含13個(gè)CpG位點(diǎn)。檢測兩組共計(jì)66個(gè)位點(diǎn)甲基化值，結(jié)果顯示煙依賴組CDH23－1片段中的CpG246位點(diǎn)、CDH23－2片段中的CpG48位點(diǎn)甲基化水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=－2.454、－2.436，Plt;0.05）。見表2。煙依賴組CDH23－1片段中的CpG110、CpG112、CpG127、CpG131、CpG135、CpG139、CpG147、CpG156、CpG162、CpG170、CpG191、CpG195、CpG200、CpG222、CpG224位點(diǎn)，CDH23－2片段的CpG36、CpG38、CpG43、CpG57、CpG60、CpG62、CpG64、CpG88、CpG101、CpG140、CpG152、CpG185位點(diǎn)，CDH23－3片段中的CpG50、CpG52、CpG62、CpG80、CpG91、CpG98位點(diǎn)，CDH23－4片段中的CpG33、CpG55、CpG89、CpG138、CpG166、CpG192、CpG208等40個(gè)位點(diǎn)甲基化程度均低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

2.3 兩組CDH23基因片段甲基化程度差異比較

以CDH23－1、CDH23－2、CDH23－3、CDH23－4所包含的位點(diǎn)的平均甲基化程度作為該片段的平均甲基化程度，煙依賴組各片段的平均甲基化程度均低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

2.4 煙依賴者CDH23基因甲基化與頸動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系

根據(jù)CpG246、CpG48位點(diǎn)甲基化中位數(shù)（分別為0.010 556、0.056 351），將研究對象分為高甲基化組和低甲基化組，根據(jù)研究對象是否煙依賴分為煙依賴組和非煙依賴組，利用析因設(shè)計(jì)方差分析兩種因素（煙依賴和基因位點(diǎn)甲基化）與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的關(guān)系，結(jié)果顯示，CpG246位點(diǎn)、CpG48位點(diǎn)甲基化水平與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度相關(guān)，低甲基化水平時(shí)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度顯著大于高甲基化水平（F=6.235、4.692，Plt;0.05）。見表3、4。

3 討 論

CDH23基因位于染色體10q22.1上，其編碼的鈣黏附素23是鈣黏附素超家族中的一員，鈣黏附素是一種跨膜糖蛋白，參與細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)黏附及細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。既往研究認(rèn)為，CDH23基因甲基化及多態(tài)性改變在聽力異常、癌癥和阿爾茨海默病中發(fā)揮作用，近年也有研究發(fā)現(xiàn)鈣黏附素23與煙依賴也密切相關(guān)。蛋白表達(dá)受基因調(diào)控，CDH23基因甲基化改變是否與煙依賴相關(guān)目前尚不清楚，CDH23基因甲基化水平是否與頸動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)尚需進(jìn)一步探討。

本研究對CDH23基因位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示煙依賴組CpG246位點(diǎn)、CpG48位點(diǎn)甲基化水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明煙依賴可能導(dǎo)致CDH23基因位點(diǎn)發(fā)生低甲基化改變。有研究表明，70%的GpG島位于啟動(dòng)子區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)甲基化程度與基因表達(dá)程度相反，因此推測基因甲基化水平的降低可導(dǎo)致CDH23基因表達(dá)的增加，其編碼的鈣黏附素23表達(dá)增加，細(xì)胞間的黏附功能增強(qiáng)。HUAN等研究發(fā)現(xiàn)，許多與吸煙相關(guān)的頂級差異表達(dá)基因（包括LRRN3和GPR15）在啟動(dòng)子區(qū)域都有發(fā)生DNA甲基化改變的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在吸煙者中呈現(xiàn)低甲基化改變；隨后他們將這些差異表達(dá)基因位點(diǎn)與吸煙相關(guān)的疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示這些基因位點(diǎn)與腦血管疾病及肺部慢性疾?。宰枞苑渭膊?、支氣管炎等）的發(fā)生顯著相關(guān)。

本文研究進(jìn)一步結(jié)合研究對象煙依賴情況分析CpG246、CpG48兩個(gè)位點(diǎn)低甲基化水平與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的關(guān)系，結(jié)果顯示CpG246、CpG48兩個(gè)位點(diǎn)低甲基化水平時(shí)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度顯著高于高甲基化水平，推測煙依賴人群中CpG246、CpG48位點(diǎn)的低甲基化水平與頸動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。鈣黏附素23介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的黏附，相關(guān)研究表明，其主要在神經(jīng)視網(wǎng)膜、耳蝸和前庭毛細(xì)胞的立體纖毛等部位表達(dá)，同時(shí)也在腦、心、血管、肺、腎、鼻、眼等細(xì)胞內(nèi)皮上廣泛表達(dá)。目前研究認(rèn)為，頸動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，細(xì)胞黏附分子作

為關(guān)鍵的成員參與了單核巨噬細(xì)胞的聚集、泡沫細(xì)胞的形成等環(huán)節(jié)。尼古丁被認(rèn)為是煙依賴的主要物質(zhì)及香煙致病的主要物質(zhì)，既往研究表明尼古丁可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，促使內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子異常表達(dá)。細(xì)胞黏附異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。CDH23基因位點(diǎn)低甲基化改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)皮上鈣黏附素23表達(dá)增加，加強(qiáng)了細(xì)胞間的黏附，從而參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

此前有大量的研究結(jié)果表明，異常的DNA甲基化改變包括異常的低甲基化和高甲基化，在動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、巨噬細(xì)胞炎癥、血管平滑肌細(xì)胞異常增殖、斑塊破裂和血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ISTAS等通過綜合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，BRCA1和CRISP2 DMRs為大多數(shù)中心疾病相關(guān)的DNA甲基化生物標(biāo)志物，這種差異甲基化BRCA1和CRISP2區(qū)域通過焦磷酸測序檢測得到驗(yàn)證，并可在動(dòng)脈粥樣硬化病人的血液、主動(dòng)脈組織和頸動(dòng)脈斑塊材料中進(jìn)一步復(fù)制。本研究結(jié)果顯示，煙依賴者CDH23基因CpG位點(diǎn)發(fā)生低甲基化改變，這種低甲基化改變與頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)。但本文僅對研究對象外周血樣本進(jìn)行甲基化檢測，結(jié)果不能完全代表研究對象動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮上發(fā)生的事件，因此需要進(jìn)一步取得病人的病理組織標(biāo)本進(jìn)行研究以驗(yàn)證本文結(jié)論。同時(shí)本文樣本量相對較少，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）