人頸椎黃韌帶交感神經(jīng)纖維分布的組織學(xué)觀察

［摘要］ 目的

探討人頸椎黃韌帶上交感神經(jīng)分布的特點(diǎn)及意義。

方法 隨機(jī)選取行脊柱后路手術(shù)病人15例及成年尸體標(biāo)本7具，取其黃韌帶逐層三維切片進(jìn)行乙醛酸染色，分析黃韌帶不同區(qū)域交感神經(jīng)的分布情況。觀察離體后中立位、極端過伸過屈位黃韌帶外側(cè)附著點(diǎn)間距（M）、內(nèi)側(cè)附著點(diǎn)間距（N）以及M/N比例（λ）。

結(jié)果

黃韌帶存在交感神經(jīng)纖維，并且內(nèi)帶（Ⅱ區(qū)）相對于外帶（Ⅰ區(qū)）分布較少（t=13.35，P＜0.05）。黃韌帶穿行微動(dòng)脈壁上環(huán)繞分布著一些短而呈波浪形的短神經(jīng)纖維（β型），韌帶纖維中普遍分布點(diǎn)狀、線形交感神經(jīng)纖維（α型）。黃韌帶M較N更短（λ＜1），微血管在垂直或平行黃韌帶纖維時(shí)，管壁分布的β型交感神經(jīng)纖維受到來自韌帶彈力纖維的剪切力。

結(jié)論 黃韌帶上有交感神經(jīng)纖維分布，且其分布方式可能與黃韌帶的力學(xué)特點(diǎn)相關(guān)，這種力學(xué)相關(guān)分布特點(diǎn)可能是造成交感神經(jīng)型頸椎病的始動(dòng)因素。

［關(guān)鍵詞］ 頸椎；黃韌帶；腎上腺素能纖維；組織學(xué)；關(guān)節(jié)不穩(wěn)定性

［中圖分類號］ R322.85;R684

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0886-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.195

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1607.006;2024-01-05 20：00：40

HISTOLOGICAL OBSERVATION OF THE DISTRIBUTION OF SYMPATHETIC NERVE FIBERS IN THE LIGAMENTUM FLAVUM OF HUMAN CERVICAL SPINE

DONG Depeng， GUO Zhaoyang， MA Yuanye， CHEN Bohua， WU Xiaolin， XIANG Hongfei

（Department of Traumatology and Orthopedics， People’s Hospital of Chengyang District， Qingdao 266109， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the characteristics and significance of the distribution of sympathetic nerves in the ligamentum flavum of human cervical spine.

MethodsA total of 15 patients undergoing posterior spinal surgery and 7 adult cadaver specimens were selected， and the three-dimensional slices of the ligamentum flavum layer by layer were collected for glyoxylic acid staining to analyze the distribution of sympathetic nerves in different regions of the ligamentum flavum. The distance between the lateral attachment points of the ligamentum flavum （M）， the distance between the medial attachment points （N）， and M/N ratio （λ） in the neutral position， extreme overextension， and over flexion position after detachment.

ResultsThere were sympathetic nerve fibers in the ligamentum flavum， with fewer fibers the inner zone （zone Ⅱ） than in the outer zone （zone Ⅰ） （t=13.35，Plt;0.05）. Some short and wavy nerve fibers （β） were distributed around the wall of the passing arterioles， and sympathetic nerve fibers in dotted and linear shapes （α） were commonly distributed in ligament fibers. The distance M of the ligamentum flavum was shorter than the distance N （λ lt;1）， and when the distribution of microvasculature was vertical or parallel to fibers of the ligamentum flavum （β）， the sympathetic nerve fibers （β） distributed on the wall were subjected to shear forces from the elastic fibers of the ligaments.

ConclusionSympathetic nerve fibers are distributed in the ligamentum flavum， and the way of distribution may be associated with the mechanical characteristics of the ligamentum flavum. Such mechanical distribution characteristics of sympathetic nerve fibers may be the initiating factor for sympathetic cervical spondylosis.

［KEY WORDS］cervical vertebrae; ligamentum flavum; adrenergic fibers; histology; joint instability

頸性眩暈（CV）致病機(jī)制曾被認(rèn)為是椎動(dòng)脈受鉤椎關(guān)節(jié)增生壓迫引起后循環(huán)缺血（VBI）而致病，或者是因鉤椎關(guān)節(jié)增生骨贅刺激椎動(dòng)脈上交感神經(jīng)而引起癥狀［1-3］。然而此理論不能有效解釋臨床體位動(dòng)態(tài)變化激惹致病現(xiàn)象。而對于頸椎管周圍韌帶系統(tǒng)中交感因素的研究揭示了交感因素在CV起因中的重要作用［4］。越來越多的證據(jù)表明，交感神經(jīng)纖維存在于椎管周圍組織中，這對于CV的產(chǎn)生是有意義的。如果能明確頸椎軟組織中交感神經(jīng)纖維的分布規(guī)律，就可以完善交感神經(jīng)刺激理論。本文旨在通過組織學(xué)觀察分析黃韌帶不同區(qū)域交感神經(jīng)的分布情況，并分析交感神經(jīng)纖維與黃韌帶生物力學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系，以期為“機(jī)械刺激-交感-循環(huán)激惹”軸理論成立提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

活體標(biāo)本來源于青島大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科手術(shù)室。病人因椎管周圍退變及其繼發(fā)性改變，影像學(xué)上存在脊髓、血管等組織壓迫，引起癥狀或體征并在客觀上需要接受頸椎后路手術(shù)和（或）去除黃韌帶治療。成年尸體標(biāo)本來源于青島大學(xué)解剖學(xué)教研室，既往無頸椎病史，因非頸椎病患死亡，均經(jīng)甲醛浸泡處理保存1年以上，經(jīng)肉眼觀察排除畸形、外傷和明顯退變。

1.2 取材及乙醛酸溶液制備

活體取黃韌帶，均采取頸椎后路手術(shù)方式，包括去黃韌帶減壓術(shù)、頸椎全椎板去除減壓術(shù)、頸椎后路單開門椎管擴(kuò)大成形術(shù)，術(shù)中均根據(jù)減壓節(jié)段整片取出單側(cè)或雙側(cè)黃韌帶?？梢砸С蛋迳暇壣俨糠止琴|(zhì)，使黃韌帶更易顯露。切除黃韌帶止點(diǎn)的情況下，只需刮除黃韌帶附著在上位椎板的部分約5～7 mm即可剝離。對于尸體標(biāo)本，遵照術(shù)中所取黃韌帶的范圍取完整節(jié)段黃韌帶。

乙醛酸反應(yīng)液（SPG液）制備：蒸餾水15.0 mL，0.2 mol/L蔗糖1.370 g，0.236 mol/L磷酸二氫鉀0.642 g，980 g/L的一水乙醛酸0.510 g，2 mol/L NaOH 約2.4 mL（應(yīng)用電子pH計(jì)調(diào)至pH值7.4），

加蒸餾水定容為20 mL。由于染片數(shù)量較多，需要SPG液約700 mL。

1.3 黃韌帶組織乙醛酸染色及結(jié)果觀察

所取組織標(biāo)本在恒冷切片箱中進(jìn)行冷凍切片，切片厚度為20～25 μm。將切片固定在載玻片上，依次浸泡于制備好的SPG液中2 min，重復(fù)此步驟3次。干燥后，放入100 ℃烤箱中加熱5 min，每張切片覆蓋一層石蠟油，并輕輕放上載玻片，再放入80 ℃烤箱中加熱2 min。全部切片均使用Olympus熒光顯微鏡及常規(guī)光學(xué)顯微鏡檢查，調(diào)諧激發(fā)光波長為410 nm，用400倍高倍鏡在熒光條件下選取不同區(qū)域、不同空間切位對鋪片進(jìn)行鏡檢，輔以圖像分析軟件（imagepro plus 9.0、Ipwin32）進(jìn)行截圖定性分析，將全部觀察視野中的點(diǎn)狀或者線狀熒光視為有效計(jì)數(shù)單位，記錄各切片的有效熒光單位數(shù)量，每張切片固定區(qū)域檢出有效熒光單位＞5即視為鏡檢陽性。

抽取20張神經(jīng)纖維熒光表達(dá)陽性的冠狀位或軸位切片，結(jié)合圖像分析軟件（imagepro plus 9.0、Ipwin32）進(jìn)行測量分析，統(tǒng)計(jì)黃韌帶Ⅰ區(qū)（外帶）、Ⅱ區(qū)（內(nèi)帶）交感神經(jīng)纖維的熒光強(qiáng)度值，分析不同區(qū)域內(nèi)交感神經(jīng)分布密度。

在抽取的20張神經(jīng)纖維熒光表達(dá)陽性的冠狀位或軸位切片上，隨機(jī)選取α和β型兩型神經(jīng)纖維（長點(diǎn)狀、線形交感神經(jīng)纖維為α型，短波浪形神經(jīng)纖維為β型）表達(dá)的熒光單位，輔以imagepro plus 9.0和Ipwin32圖像測量分析，統(tǒng)計(jì)各切片的熒光強(qiáng)度值，并通過化學(xué)熒光染色的染色輪廓觀察神經(jīng)纖維組織學(xué)形態(tài)特征和分布特點(diǎn)。

黃韌帶離體處理后，3 h內(nèi)用網(wǎng)格法描記黃韌帶附著點(diǎn)及雙面矢狀位投影，觀察離體后中立位（A型）、極端過伸過屈位（B、C型）黃韌帶外側(cè)附著點(diǎn)間距（M）、內(nèi)側(cè)附著點(diǎn)間距（N）以及M/N比例（λ）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，兩組均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK（Student-Newman-Keuls）法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 人頸椎黃韌帶組織切片不同切位上交感神經(jīng)纖維組織學(xué)觀察

在Ⅰ區(qū)黃韌帶軸位切片中可觀察到微血管腔中有少量血細(xì)胞，也可以觀察到清晰的動(dòng)脈管壁樣結(jié)構(gòu)，以及硬膜外脂肪組織、韌帶外側(cè)部分散在脂肪細(xì)胞，在這些血管腔外壁上環(huán)繞分布著一些短而呈波浪形的神經(jīng)纖維（β型），這些神經(jīng)纖維并非集中于血管某切面分布，而是散在環(huán)繞分布（圖1A）；在Ⅰ區(qū)黃韌帶矢狀位切片中可以看到兩型交感神經(jīng)纖維在黃韌帶纖維中穿行（圖1B）；在Ⅰ區(qū)黃韌帶冠狀位切片上可觀察到直線形交感神經(jīng)纖維呈簇狀于黃韌帶纖維間穿出，夾雜部分波浪形交感神經(jīng)纖維（圖1C）。在Ⅱ區(qū)黃韌帶冠狀位切片上均可觀察到穿行在黃韌帶彈力纖維之間的點(diǎn)狀、線形（α型）交感神經(jīng)纖維熒光單位（圖1D）；在Ⅱ區(qū)黃韌帶矢狀位、軸位切片上同樣可以觀察到散布于血管腔壁的交感神經(jīng)纖維熒光單位（圖1E、F）。

2.2 活體和尸體標(biāo)本不同切位切片的熒光陽性率比較

活體標(biāo)本冠狀位、軸位切片的熒光陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；尸體標(biāo)本冠狀位、軸位切片的熒光陽性率比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 活體與尸體標(biāo)本切片陽性率比較

活體標(biāo)本熒光鏡檢陽性和陰性切片數(shù)分別為274（75.07%）和91（24.93%），尸體標(biāo)本陽性和陰性切片數(shù)分別為236（53.76%）和203（46.24%），活體標(biāo)本切片陽性率與尸體標(biāo)本比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.02，P＜0.05），表明活體標(biāo)本比尸體標(biāo)本更易觀察到神經(jīng)纖維的存在。

2.4 人頸椎黃韌帶不同區(qū)域熒光強(qiáng)度值測量分析

在所有鏡檢呈陽性的510張切片中隨機(jī)抽取20張，對整張切片Ⅰ、Ⅱ區(qū)進(jìn)行化學(xué)熒光染色，發(fā)現(xiàn)Ⅰ區(qū)較Ⅱ區(qū)交感神經(jīng)纖維分布多且相對密集，Ⅰ區(qū)交感神經(jīng)纖維熒光強(qiáng)度值（6 825.62±971.57）顯著高于Ⅱ區(qū)（2 401.45±1 119.45），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.35，P＜0.05）。

2.5 人頸椎黃韌帶形態(tài)模擬描記和形態(tài)學(xué)測量

A、B、C三型黃韌帶比較，M、N及λ差異均無顯著性（P＞0.05）。黃韌帶M較N更短（λ＜1），即在同等的椎板位移情況下外側(cè)彈力纖維較內(nèi)側(cè)彈力纖維需要更顯著的形變，推斷外側(cè)束韌帶彈力纖維較內(nèi)側(cè)束韌帶彈力纖維形變可以更大。見表2。

3 討" 論

傳統(tǒng)的CV主要指“椎動(dòng)脈性頸椎病”和“頸交感性頸椎病”，但是否存在CV這一疾病目前有很大爭議［5］。在CV眾多的致病機(jī)制中，尤以頸部交感因素的研究相對深入，在解釋病理生理學(xué)和病因?qū)W方面，頸部交感因素的作用越來越重要［6-8］。1999年于騰波等［9］研究顯示，刺激頸交感神經(jīng)節(jié)后，椎動(dòng)

脈發(fā)生了明顯血流動(dòng)力學(xué)變化，認(rèn)為交感神經(jīng)在頸部的解剖存在可能是影響血流動(dòng)力學(xué)的主要原因，提出了“交感神經(jīng)-血流動(dòng)力-中樞”的神經(jīng)反射調(diào)節(jié)機(jī)制。解剖學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，人C2～6椎間孔中容納的竇椎神經(jīng)來自相對應(yīng)節(jié)段的交感神經(jīng)節(jié)脊膜支，這些神經(jīng)分布至包括后縱韌帶在內(nèi)的椎管內(nèi)及椎間孔周圍組織［9-10］。組織形態(tài)學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)了人類頸椎間盤、頸段后縱韌帶、頸椎關(guān)節(jié)囊上分布有大量的感覺神經(jīng)纖維和交感神經(jīng)纖維［11-12］。這表明人頸椎交感神經(jīng)末梢神經(jīng)趨向分布于與頸椎生物力學(xué)相關(guān)的具有動(dòng)態(tài)特點(diǎn)的解剖結(jié)構(gòu)中。

本實(shí)驗(yàn)通過三維切片乙醛酸染色并結(jié)合蘇木精-伊紅染色觀察發(fā)現(xiàn)，人頸椎黃韌帶中有血管結(jié)構(gòu)分布，類似微動(dòng)脈結(jié)構(gòu)可在Ⅰ區(qū)近關(guān)節(jié)囊部平行于黃韌帶彈力纖維走行，散在的無動(dòng)脈管壁樣血管穿行于Ⅰ、Ⅱ區(qū)韌帶彈力纖維間。黃韌帶作為一個(gè)在椎管后方維持頸椎穩(wěn)定的特殊彈性蛋白結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，特別之處是在較整齊排列的彈力纖維中穿行較多的微動(dòng)脈管腔系統(tǒng)，這些微動(dòng)脈血管形成逐級放大的后循環(huán)供血網(wǎng)絡(luò)，并且在動(dòng)態(tài)力學(xué)活動(dòng)中不受外力的直接刺激保持“獨(dú)立性”［13］。

本文結(jié)果顯示，活體標(biāo)本黃韌帶切片熒光鏡檢陽性率與尸體標(biāo)本比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，活體標(biāo)本比尸體標(biāo)本更容易觀察到神經(jīng)纖維的存在。雖然新鮮組織較尸體組織切片更易觀察到神經(jīng)纖維的分布，但神經(jīng)纖維分布都存在同一性特征，說明交感神經(jīng)纖維確實(shí)存在于黃韌帶中，且分布特征相似。

通過測定黃韌帶不同區(qū)域熒光強(qiáng)度值發(fā)現(xiàn)，Ⅰ區(qū)（外帶）較Ⅱ區(qū)（內(nèi)帶）交感神經(jīng)纖維分布多且相對密集。同時(shí)，本研究對黃韌帶極端情況下切面投影進(jìn)行了模擬分析，結(jié)果顯示，過伸過屈位時(shí)均以接近內(nèi)面、邊緣外帶纖維形變最大。測量離體的椎板-黃韌帶復(fù)合體中黃韌帶，結(jié)果顯示λ＜1，表明黃韌帶垂直距離分布的彈力纖維外側(cè)較內(nèi)側(cè)更短，更易受外力作用而產(chǎn)生形變。這說明黃韌帶的運(yùn)動(dòng)與其中血管的受牽拉剪切力主要來自于外帶，而交感神經(jīng)亦密集分布于外帶，由此我們推斷，無論黃韌帶如何形變，穿行或順行走行在其中的血管壁均受到黃韌帶纖維相對位移所造成的剪切力，這些剪切力也作用于血管壁或韌帶彈力纖維間分布的α型交感神經(jīng)纖維，以及分布在血管壁上的β型交感神經(jīng)纖維，造成對交感神經(jīng)的牽張刺激，這種刺激可以通過微血管網(wǎng)對后循環(huán)系統(tǒng)造成血流干擾，最終產(chǎn)生中樞的眩暈感受反射。

然而，本實(shí)驗(yàn)在定量分析的精確性上仍存在一定不足，因受倫理學(xué)所限也缺乏生理狀態(tài)完全正常解剖結(jié)構(gòu)標(biāo)本的研究，臨床上并非所有失去頸椎穩(wěn)定的情況下均會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的交感癥狀，相關(guān)理論仍需要進(jìn)一步完善。

綜上所述，人頸椎黃韌帶存在交感神經(jīng)纖維，黃韌帶纖維間穿行微動(dòng)脈壁上環(huán)繞分布著一些短而呈波浪形的β型交感神經(jīng)纖維，韌帶纖維中普遍分布著點(diǎn)狀、線形的α型交感神經(jīng)纖維，這種力學(xué)相關(guān)分布特點(diǎn)可能是交感神經(jīng)性頸椎病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)［14］，而頸椎失穩(wěn)可能是造成交感神經(jīng)型頸椎病的始動(dòng)因素。

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（本文編輯 馬偉平）