基于生物信息學(xué)方法構(gòu)建肝細(xì)胞癌SNHG17-miRNA-CDK4預(yù)后預(yù)測模型

［摘要］ 目的

探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）小核仁RNA宿主基因17（SNHG17）在肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生發(fā)展中的作用。

方法 利用基因表達(dá)譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫，分析HCC中SNHG17的表達(dá)及其與生存的關(guān)系；利用基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，使用GEO2R、lnCAR和Metascape軟件分析SNHG17相關(guān)性基因、構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行GO和KEGG富集分析。根據(jù)通路利用多個(gè)GEO數(shù)據(jù)集篩選出細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）；利用數(shù)據(jù)庫平臺(tái)StarBase、miRBD以及HMDD篩選出同時(shí)以SNHG17和CDK4為靶基因的microRNA（miRNA）。

結(jié)果 lncRNA SNHG17在HCC中的表達(dá)顯著上升（P＜0.05），其表達(dá)高的病人預(yù)后顯著變差（P＜0.05）。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，SNHG17與核蛋白復(fù)合物以及細(xì)胞周期相關(guān)。篩選出高度相關(guān)基因CDK4并篩選出以SNHG17和CDK4為靶標(biāo)的miRNAs。

結(jié)論 SNHG17在HCC中表達(dá)增高，并可通過結(jié)合多種miRNA發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA的功能，對CDK4發(fā)揮調(diào)控作用。

［關(guān)鍵詞］ 癌，肝細(xì)胞；RNA，長鏈非編碼；微RNAs；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4；預(yù)后；計(jì)算生物學(xué)

［中圖分類號］ R730.261；R342.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0850-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.204

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1606.005;2024-01-05 20：16：24

ESTABLISHMENT OF A PROGNOSTIC PREDICTION MODEL FOR HEPATOCELLULAR CARCINOMA BASED ON SNHG17-MIRNA-CDK4 AND BIOINFORMATICS METHODS

LIU Jiandong， HAN Cuiyun，ZHONG Jingtao， XU Huirong

（Department of Emergency Medicine， Qilu Hospital of Shandong University， Jinan 250000， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the role of the long non-coding RNA （lncRNA） small nucleolar RNA host gene 17 （SNHG17） in the development and progression of hepatocellular carcinoma （HCC）.

MethodsGEPIA database was used to analyze the expression of SNHG17 in HCC and its association with survival; the data in GEO database were used for validation; GEO2R，lnCAR， and Metascape were used to analyze SNHG17-related genes， construct a visualized network， and perform GO and KEGG enrichment analyses. Based on related pathways， multiple GEO datasets were used to screen for CDK4， and StarBase，miRBD， and HMDD database platforms were used to obtain the microRNAs （miRNAs） targeting both SNHG17 and CDK4.

ResultsThere was a significant increase in the expression of lncRNA SNHG17 in HCC （Plt;0.05）， and the patients with high SNHG17 expression tended to have a poorer prognosis （Plt;0.05）. GO and KEGG enrichment analyses showed that SNHG17 was associated with nuclear protein complex and cell cycle. The highly related gene CDK4 was obtained， as well as the miRNAs targeting SNHG17 and CDK4.

ConclusionThere is an increase in the expression of SNHG17 in HCC， and SNHG17 can play the role of competitive endogenous RNA by binding to a variety of miRNAs， thereby exerting a regulatory effect on CDK4.

［KEY WORDS］carcinoma， hepatocellular; RNA， long noncoding; miRNAs; cyclin-dependent kinase 4; prognosis; computational biology

肝細(xì)胞癌（HCC）作為最常見的惡性腫瘤之一，已成為全球死亡率第二高的腫瘤［1］。由于HCC在確診時(shí)往往已經(jīng)處于晚期，并且由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)等因素，HCC病人的預(yù)后很差［2-3］。因此，探究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找與HCC發(fā)生有關(guān)的新型生物標(biāo)志物對HCC病人的早期診斷和治療十分重要。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200個(gè)核苷酸的無蛋白質(zhì)編碼能力的RNA，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。小核仁RNA宿主基因17（SNHG17）是新發(fā)現(xiàn)的位于20q11的lncRNA，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮癌基因的功能［5-7］。相

關(guān)研究顯示，SNHG17過表達(dá)通過競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)調(diào)控肺腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移［8-9］。然而，SNHG17在HCC中的表達(dá)水平及其臨床意義研究較少。本研究利用生物信息學(xué)方法分析SNHG17在HCC中的表達(dá)水平及其對生存的影響，并通過基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集信息的深度挖掘預(yù)測靶基因細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4），為后期SNHG17在HCC中的功能研究提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 SNHG17在HCC中的表達(dá)及生存分析

本文研究利用基因表達(dá)譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析TCGA HCC數(shù)據(jù)集中SNHG17在癌與癌旁組織中表達(dá)水平差異，分析SNHG17表達(dá)與病人總生存期（OS）和無病生存期（DFS）的相關(guān)性，以及SNHG17表達(dá)與腫瘤分級之間的關(guān)系。

1.2 SNHG17在癌和癌旁組織中表達(dá)驗(yàn)證

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載HCC的臨床數(shù)據(jù)，對GSE36376、GSE14520數(shù)據(jù)集中SNHG17在癌與癌旁組織中的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 SNHG17相關(guān)靶基因生物學(xué)功能及通路分析本文利用lnCAR數(shù)據(jù)庫（https：//lncar.renlab.

org/）分析GEO數(shù)據(jù)集中與SNHG17相關(guān)的基因并構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，利用Metascape平臺(tái)（https：//metascape.org/gp/index.html#main/step1）進(jìn)行靶基因的GO和KEGG 富集分析。

1.4 SNHG17及其下游靶基因CDK4相關(guān)性分析

采用韋恩圖取交集的方法在不同GEO數(shù)據(jù)集中取得高度相關(guān)的基因的交集，參考基因富集通路挑選出最有意義的靶基因CDK4。同時(shí)在GEPIA數(shù)據(jù)庫中采用Perarson相關(guān)性分析進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 CDK4基因在HCC中的表達(dá)及預(yù)后分析

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析CDK4在癌與癌旁組織中的表達(dá)水平，分析CDK4表達(dá)與病人OS和DFS的相關(guān)性，以及與腫瘤分級之間的關(guān)系。

1.6 與SNHG17和CDK4相互作用miRNA的篩選及其調(diào)控關(guān)系分析

通過StarBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）、miRBD（http：//www.mirdb.org/）篩選可能同時(shí)結(jié)合SNHG17和CDK4的miRNA，并分析SNHG17、miRNA和CDK4之間的調(diào)控關(guān)系。利用HMDD v3.0（http：//www.cuilab.cn/hmdd）檢索并分析與HCC有關(guān)的miRNA，通過StarBase進(jìn)行Perarson相關(guān)性分析，以進(jìn)一步證實(shí)SNHG17通過miRNA發(fā)揮對CDK4的調(diào)控。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間比較采用雙尾未配對的t檢驗(yàn)或配對的t檢驗(yàn)，通過Kaplan-Meier曲線檢驗(yàn)SNHG17和CDK4表達(dá)對 HCC病人的影響，并使用對數(shù)值檢驗(yàn)分析了病人的OS和DFS。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 HCC組織中SNHG17的表達(dá)水平及與病人生存情況的相關(guān)性

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫TCGA數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)， HCC中SNHG17表達(dá)量明顯增高（Plt;0.001），且與HCC的分級密切相關(guān)，與低級別HCC（Stage Ⅰ/Ⅱ）相比較，高級別HCC（Stage Ⅲ/Ⅴ）組織中SNHG17表達(dá)明顯升高（Plt;0.01）。見圖1A、B。 SNHG17表達(dá)水平也與HCC病人的OS和DFS高度相關(guān)，與SNHG17表達(dá)水平較高的病人相比較，SNHG17表達(dá)較低的病人的OS和DFS時(shí)間延長（Plt;0.05）。見圖1C、D。同樣地，與來自GEO的RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE36376、GSE14520中的正常組織相比，HCC組織中SNHG17的表達(dá)明顯上調(diào)（Plt;0.01）。見圖1E、F。

2.2 GEO數(shù)據(jù)集中SNHG17靶基因的功能富集分析

通過lnCAR平臺(tái)分析GEO的RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE14520，得到與SNHG17相關(guān)靶基因共200個(gè)（rgt;0.50或lt;-0.50）并構(gòu)建基因相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。見圖2A。利用Metascape平臺(tái)分析200個(gè)相關(guān)性靶基因，GO生物過程分析發(fā)現(xiàn)基因主要集中在核蛋白的復(fù)合體生成、mRNA的翻譯以及核蛋白的組裝。見圖2B。KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，排名第一的是與細(xì)胞周期相關(guān)的通路。見圖2C。對GEO的RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE36376、GSE14520相關(guān)靶基因分析取交集找到36個(gè)共同靶基因，其中CDK4以促進(jìn)HCC細(xì)胞的G1/S轉(zhuǎn)變調(diào)控細(xì)胞周期的信號通路［10］。同時(shí)我們用GEPIA的Perarson相關(guān)性分析進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示在TCGA數(shù)據(jù)集中CDK4與SNHG17的表達(dá)呈高度相關(guān)（Plt;0.01）。見圖2D。

2.3 HCC中CDK4表達(dá)與生存時(shí)間關(guān)系

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫TCGA數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，HCC中的CDK4表達(dá)明顯增高（Plt;0.001）。見圖3A。CDK4表達(dá)與人種、性別、年齡、體質(zhì)量無關(guān)（Pgt;0.05）。見圖3B～E。與高級別和高分期的病人相比，部分低級別和低分期病人CDK4的表達(dá)量降低（Plt;0.05）。見圖3F、G。CDK4水平也與HCC病人的OS和DFS高度相關(guān)，與CDK4表達(dá)水平較高的病人相比，CDK4表達(dá)較低的病人的OS和DFS延長（Plt;0.001）。見圖3H、I。

2.4 SNHG17-miRNA-CDK4調(diào)控模型中miRNA的篩選

在多種腫瘤中，SNHG17可以作為ceRNA發(fā)揮“分子海綿“作用，吸附miRNA，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。我們通過StarBase、miRBD預(yù)測HCC中與SNHG17和CDK4結(jié)合的miRNA并取交集，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-335-5p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-506-3p可以同時(shí)結(jié)合SNHG17和CDK4。見圖4。

3 討" 論

SNHG家族通過多種分子調(diào)控機(jī)制參與HCC

的發(fā)生發(fā)展過程［11］。例如，SNHG1通過吸附miR-377-3p促進(jìn)HCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［12］；SNHG3可直接結(jié)合miR-128從而促進(jìn)CD151表達(dá)，激活上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)通路的表達(dá)，促進(jìn)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移［13］；SNHG5高表達(dá)解除了miR-26a-5p對糖原合成酶激酶3β的抑制作用，從而促進(jìn)了

HCC的發(fā)生［14］；SNHG17在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)癌癥進(jìn)展［15-16］。然而，SNHG17在HCC中的功能和機(jī)制的相關(guān)研究較少。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析顯示，SNHG17在HCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肝組織，并且SNHG17高表達(dá)與HCC病人較短的OS和DFS顯著相關(guān)，提示SNHG17可能在HCC中發(fā)揮癌基因功能，調(diào)控HCC的發(fā)生發(fā)展。對GSE14520數(shù)據(jù)集進(jìn)行進(jìn)一步分析結(jié)果表明，與SNHG17相關(guān)的基因高度富集在細(xì)胞周期相關(guān)通路上，在TCGA數(shù)據(jù)集以及不同的GEO數(shù)據(jù)集中同時(shí)發(fā)現(xiàn)CDK4的表達(dá)水平與SNHG17顯著相關(guān)。

CDK4蛋白是一種由CDK4基因編碼的廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶。在有絲分裂原刺激下，細(xì)胞周期蛋白D（CyclinD）與激活的CDK4組成CDK4-CyclinD復(fù)合物，對于細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換至關(guān)重要，在癌細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。例如，復(fù)制蛋白A1作為潛在的癌基因通過CDK4/CyclinD途徑促進(jìn)腫瘤增殖，從而在HCC中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］。本研究系統(tǒng)分析了CDK4在TCGAHCC數(shù)據(jù)集中的表達(dá)水平，并分析了其與腫瘤分期分級及病人種族、年齡、性別、體質(zhì)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CDK4是HCC獨(dú)立預(yù)后因素，在HCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本文生信分析結(jié)果顯示，HCC組織SNHG17-miRNA-CDK4預(yù)后預(yù)測模型的構(gòu)建，為SNHG17在HCC中的機(jī)制研究提供了重要的參考。然而，由于本研究樣本量較少，因此該結(jié)果需進(jìn)一步通過大樣本研究證實(shí)。

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（本文編輯 牛兆山）