水稻籽粒伸長(zhǎng)突變體lgdp的鑒定與基因定位

林孝欣 黃明江 韋 祎 朱洪慧 王子怡 李忠成 莊 慧 李彥羲 李云峰 陳 銳

研究簡(jiǎn)報(bào)

水稻籽粒伸長(zhǎng)突變體的鑒定與基因定位

林孝欣 黃明江 韋 祎 朱洪慧 王子怡 李忠成 莊 慧 李彥羲 李云峰*陳 銳*

西南大學(xué)水稻研究所 / 西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 / 轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715

水稻粒形與產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)密切相關(guān), 挖掘水稻粒形發(fā)育相關(guān)基因并解析其分子機(jī)制, 對(duì)提高水稻產(chǎn)量、改善籽粒營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)具有重要意義。利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)處理秈稻品種西大1B, 獲得了1個(gè)水稻粒形突變體, 命名為()。表現(xiàn)出外稃伸長(zhǎng), 從而導(dǎo)致籽粒長(zhǎng)度增加的特征, 進(jìn)一步掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn),籽粒變長(zhǎng)主要原因是其外稃細(xì)胞數(shù)目極顯著增加。遺傳分析表明該性狀受1對(duì)隱性基因調(diào)控; 利用與ZH11雜交構(gòu)建的F2分離群體, 通過(guò)BSA法將目標(biāo)基因定位在3號(hào)染色體分子標(biāo)記ZLN43和ZLN-1之間, 物理距離大約810 kb。通過(guò)轉(zhuǎn)錄測(cè)序和PCR分析初步確認(rèn)候選基因編碼一個(gè)MADS-box基因。qPCR分析表明,可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控、、等水稻粒長(zhǎng)正向調(diào)控因子的表達(dá), 從而影響了穎殼細(xì)胞數(shù)目的增殖, 進(jìn)而影響籽粒長(zhǎng)度。本研究結(jié)果為應(yīng)用基因改良水稻粒形提供了新的資源。

水稻; 粒形; 細(xì)胞數(shù)目; 基因定位

籽粒形態(tài)是影響水稻產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一, 其中由長(zhǎng)、寬、厚等性狀共同決定的籽粒大小是影響水稻產(chǎn)量的一個(gè)重要因素, 而長(zhǎng)寬比所決定的形態(tài)特征是重要的外觀品質(zhì)性狀。水稻籽粒最外層是一層堅(jiān)硬的穎殼(內(nèi)稃和外稃), 在籽粒形成之后, 穎殼的大小不會(huì)再發(fā)生變化, 但是會(huì)隨籽粒的發(fā)育進(jìn)一步硅化、脫水、成熟。所以穎殼發(fā)育在很大程度上決定籽粒形態(tài), 進(jìn)而影響稻米的產(chǎn)量與品質(zhì)形成[1]。

近年來(lái), 人們鑒定了許多與水稻籽粒形態(tài)發(fā)育相關(guān)的基因, 它們中大多數(shù)都是通過(guò)調(diào)控穎殼的細(xì)胞增殖或(和)擴(kuò)展, 進(jìn)而決定籽粒形態(tài), 最終在水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成中發(fā)揮重要作用。這其中大多數(shù)的基因按調(diào)控途徑不同可以分為3類: (1) G蛋白信號(hào)途徑: G蛋白復(fù)合體是一個(gè)由Gα、Gβ和Gγ三個(gè)亞基組成的異源三聚體。在水稻中,編碼Gα亞基, Gβ亞基由基因編碼, 通過(guò)影響細(xì)胞增殖正向調(diào)控穎殼發(fā)育, 突變后籽粒都變小[2-4];、、、、和編碼Gγ亞基, 其中、和編碼非典型的Gγ亞基, 研究表明和通過(guò)介導(dǎo)G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)正向調(diào)控籽粒長(zhǎng)度,通過(guò)與或競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Gβ亞基負(fù)向調(diào)控籽粒長(zhǎng)度[5-10]; 而和主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞激素的合成從而負(fù)調(diào)控水稻籽粒大小[11-12]。(2) 泛素蛋白酶體途徑:基因編碼一個(gè)RING-like E3泛素連接酶, 通過(guò)將底物錨定到蛋白酶體進(jìn)行降解, 從而負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂, 突變后增加了穎殼細(xì)胞的數(shù)目, 最終粒寬和粒重增加[13]?；蚓幋a一個(gè)具有去泛素化酶活性的蛋白酶, 通過(guò)影響穎殼細(xì)胞擴(kuò)展來(lái)控制水稻籽粒的大小和形狀[14-16]。/基因編碼一個(gè)泛素特異性蛋白酶, 在體外具有去泛素化活性, 通過(guò)調(diào)控穎殼橫向細(xì)胞增殖來(lái)正向調(diào)控水稻籽粒寬度[17]。(3) MAPK信號(hào)通路: 絲裂原活化蛋白激酶OsMKK4、OsMKKK10和OsMAPK6組成一個(gè)控制水稻籽粒大小的級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng), OsMKKK10能與OsMKK4互作并將其磷酸化, OsMKK4繼而磷酸化OsMAPK6, 因此, OsMKKK10、OsMKK4和OsMAPK6形成一個(gè)激酶級(jí)聯(lián)模塊, 調(diào)控穎殼細(xì)胞增殖, 最終正向調(diào)控水稻籽粒大小[18-20]。(4) 激素信號(hào)途徑: 在水稻BR合成途徑中,和基因都編碼細(xì)胞色素P450家族蛋白, 是BR油菜素內(nèi)酯素生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶, 通過(guò)調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)展影響穎殼的發(fā)育, 正向調(diào)控籽粒大小[21-23]; 在水稻Auxin信號(hào)途徑中,基因編碼一個(gè)膜定位蛋白, 通過(guò)增加穎殼細(xì)胞增殖與擴(kuò)展正向調(diào)控籽粒大小[24]?；蚓幋a一個(gè)類家族成員的激酶[25], 能與Auxin應(yīng)答轉(zhuǎn)錄抑制因子互作并將其磷酸化,增強(qiáng)OsARF4積累, 負(fù)調(diào)控Auxin信號(hào), 減少穎殼中細(xì)胞的大小和數(shù)量, 從而負(fù)向調(diào)控水稻籽粒的大小[26-27]。除了這些在信號(hào)通路中的基因外,、、和等基因也參與了籽粒長(zhǎng)度的調(diào)控; 其中具有轉(zhuǎn)錄激活活性, 可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能, 促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大調(diào)控籽粒大小[28-29];編碼一個(gè)類似糖原合酶激酶GSK3的激酶, 是粒長(zhǎng)和粒重的負(fù)調(diào)控因子, 能協(xié)同改變穎殼中細(xì)胞的大小和數(shù)量[25];編碼一個(gè)擬南芥LONGIFOLIA蛋白的同源蛋白, 其表達(dá)量增加能促進(jìn)谷粒的縱向細(xì)胞分裂, 并減少橫向細(xì)胞分裂, 導(dǎo)致谷粒變得細(xì)長(zhǎng)[30-31]。另外,編碼IAA-葡萄糖水解酶, 在胚乳果皮的周圍積累, 通過(guò)限制IAA的供應(yīng)影響胚乳合體到細(xì)胞化階段的轉(zhuǎn)變, 從而限制了胚乳的細(xì)胞數(shù)目和籽粒長(zhǎng)度, 而與穎殼的發(fā)育沒(méi)有關(guān)系[32]。

隨著越來(lái)越多的粒形突變體被挖掘, 通過(guò)對(duì)相關(guān)基因的功能研究和調(diào)控機(jī)理分析, 科學(xué)家們已經(jīng)初步解析了調(diào)控水稻籽粒形態(tài)的分子機(jī)制。當(dāng)前, 進(jìn)一步鑒定特異的粒形基因資源, 對(duì)于完善水稻粒形遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 助力粒形分子設(shè)計(jì)育種仍然具有重要意義。

本研究報(bào)道了一個(gè)與水稻粒形發(fā)育相關(guān)的突變體, 主要表現(xiàn)為外稃伸長(zhǎng)導(dǎo)致的籽粒伸長(zhǎng)。遺傳分析表明該突變性狀受一個(gè)單隱性基因控制, 我們將其命名為()。通過(guò)基因定位, 我們將定位在3號(hào)染色體ZLN43和ZLN-1之間, 物理距離大約810 kb。該研究為水稻粒形分子設(shè)計(jì)育種提供了新的基因資源, 為基因的分子功能解析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

突變體來(lái)源于保持系西大1B的EMS誘變?nèi)后w, 連續(xù)多代自交和田間觀察, 突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。以為父本, 溫敏不育系56S、粳稻中花11 (Zhonghua 11, ZH11)和日本晴為母本, 分別配制雜交組合, 收獲的F1和F2用于遺傳分析。利用與ZH11雜交的F1和F2用于基因定位。所有材料種植在歇馬實(shí)驗(yàn)田, 均由西南大學(xué)水稻研究所提供。

1.2 形態(tài)和組織學(xué)分析

在開(kāi)花期, 使用NIKON SMZ1500體式顯微鏡分析野生型和突變小穗的表型特征。在抽穗期, 隨機(jī)選取野生型和突變體小穗進(jìn)行石蠟制片, 并在NIKON E600光學(xué)顯微鏡觀察組織結(jié)構(gòu); 利用HITACHI SU3800掃描電鏡觀察野生型和突變體早期幼穗原基。

1.3 主要農(nóng)藝性狀分析

觀察水稻野生型和的形態(tài)特征及農(nóng)藝性狀。開(kāi)花期, 隨機(jī)選取野生型和各10株, 統(tǒng)計(jì)每穗小花數(shù); 抽穗期, 調(diào)查水稻的株高、節(jié)間長(zhǎng)度、主穗穗長(zhǎng)、一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù); 成熟后, 統(tǒng)計(jì)每穗實(shí)粒數(shù)、粒長(zhǎng)粒寬和米長(zhǎng)米寬, 并對(duì)成熟籽粒穎殼進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.4 遺傳分析

以和溫敏不育系56S、粳稻中花11 (ZH11)和日本晴為親本雜交獲得F1代, 觀察由F1代自交獲得的F2代群體的分離情況, 并對(duì)群體中與突變體相似植株和正常單株進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 利用SAS軟件進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)。

1.5 基因定位與候選基因分析

利用BSA法定位目標(biāo)基因[33], 采用CTAB法提取親本和基因池DNA[34], 按堿煮法提取群體DNA[35]。SSR引物序列參照http://www.gramene.org/microsat/, 由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。定位區(qū)間的注釋基因信息來(lái)源于生物學(xué)網(wǎng)站http://www.gramene.org/和http://rice. plantbiology.msu.edu/。

定位區(qū)間的候選基因序列差異分析使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。在孕穗期, 分別選取野生型與突變體植株的3 cm長(zhǎng)的幼穗, 送生物公司(北京諾禾致源科技股份有限公司)進(jìn)行RNA的提取、建庫(kù)測(cè)序和參考考基因組比對(duì)。比對(duì)結(jié)果轉(zhuǎn)化為bam格式文件, 結(jié)合水稻參考基因組和注釋文件使用IGV (Integrative Genomics Viewer)瀏覽器對(duì)bam文件進(jìn)行可視化瀏覽, 在定位區(qū)間內(nèi)比較野生型與突變體cDNA序列的差異。

1.6 qRT-PCR分析

在孕穗期, 分別選取野生型與突變體植株的3 cm長(zhǎng)的幼穗, 提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。利用熒光(SYBR Green)定量PCR的預(yù)混體系和Bio-RadX96 PCR儀, 以作為內(nèi)參, 設(shè)3次重復(fù), PCR擴(kuò)增程序如下: 95℃預(yù)變性60 s; 95℃變性15 s, 60℃退火15 s, 70℃延伸60 s, 共40個(gè)循環(huán)。所得數(shù)據(jù)使用2–ΔΔCt法計(jì)算RQ與SD值, 并使用檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 lgdp突變體的表型分析

正常的野生型水稻小穗由1對(duì)退化的副護(hù)穎、1對(duì)護(hù)穎和1朵頂生小花構(gòu)成。小花由外稃、內(nèi)稃、漿片、雄蕊和雌蕊四輪花器官組成。副護(hù)穎和護(hù)穎及內(nèi)外稃成1/2互生葉序排列在小穗軸與小花軸上, 內(nèi)外稃邊緣勾合, 能正常結(jié)實(shí)(圖1A～D)。與正常的野生型水稻小穗相比,突變體小穗的內(nèi)輪花器官基本沒(méi)有變化, 但突變體外稃長(zhǎng)度顯著增加, 寬度顯著減小, 質(zhì)地薄軟, 內(nèi)稃退化(圖1- F～I(xiàn), K～N)。根據(jù)內(nèi)稃主體退化程度, 將突變體分為2種類型: Type 1和Type 2。Type 1內(nèi)稃主體完全退化消失,只留下與外稃勾連的邊緣部分, 同時(shí)內(nèi)輪花器官暴露在外(圖1-F～I(xiàn)); Type2保留了內(nèi)稃主體和邊緣的完整形態(tài), 內(nèi)外稃邊緣能正常勾合, 但是與野生型相比, 內(nèi)稃主體部分明顯變小, 同時(shí)但由于外稃顯著伸長(zhǎng), 外稃上半部分不能與內(nèi)稃形成完全的閉合結(jié)構(gòu)(圖1-K～N)。同時(shí)觀察野生型水稻小穗的外稃和內(nèi)稃主體部分的細(xì)胞組成, 發(fā)現(xiàn)其主要由硅化上表皮、纖維后壁組織、海綿薄壁組織和下表皮組成(圖1-D)。與野生型水稻小穗相比,突變體2種類型的內(nèi)外稃厚壁細(xì)胞明顯減少, 而且上表皮的硅化程度明顯減弱(圖1-I, N), 這可能是導(dǎo)致穎殼韌性減少的主要原因。進(jìn)一步利用掃描電鏡觀察野生型和突變體早期幼穗原基(小穗第6～7期), 發(fā)現(xiàn)野生型內(nèi)外稃原基發(fā)育完整, 并呈現(xiàn)“半閉合”狀態(tài), 將內(nèi)輪器官原基包裹在內(nèi)(圖1-E); 與野生型相比, Type1內(nèi)稃原基已經(jīng)出現(xiàn)“淺V狀”開(kāi)裂結(jié)構(gòu)(圖1-J); Type2內(nèi)稃原基中部也出現(xiàn)明顯的發(fā)育遲緩(圖1-O), 這與成熟后內(nèi)稃的退化表型是相符合的。根據(jù)表型分析結(jié)果,基因可能參與了水稻外稃和內(nèi)稃主體部分的發(fā)育調(diào)控。

圖1 野生型和突變體lgdp的表型觀察

A: 野生型小穗; B: 圖A中小穗去掉外稃后的形態(tài); C: 野生型小穗的橫切面; D: 圖C的局部放大; E: 野生型早期幼穗原基; F, K:的Type1和Type2兩種小穗類型; G: 圖F中小穗去除外稃后的形態(tài); H:小穗的橫切面; I: 圖H的局部放大; J: Type1早期幼穗原基; L: 圖K中小穗去除外稃后的形態(tài): M:小穗的橫切面; N: 圖M的局部放大; O: Type2早期幼穗原基?？s寫: le: 外稃; sl: 護(hù)穎; lo: 漿片: pa: 內(nèi)稃; pi: 雌蕊。標(biāo)尺: A為22 mm; B為20 mm; C為240 μm; D為75 μm; E, J, O為100 μm; F, G, K, L為23 mm; H為300 μm; I為78 μm; M為300 μm, N為80 μm。

A: WT spikelet; B: the lemma and palea were removed in A; C: the transverse sections of WT spikelet; D: amplified part of Fig. 1-C; E: scanning electron microscopy (SEM) mi-croscopical structure of wild-type spikelet primordium; F, K: Type1 and Type2 spikelets of; G, L: the lemma and palea were removed in F, K; H: transverse sections of Type1spikelet; I: amplified part of picture H; J: SEM mi-croscopical structure of Type1spikelet primordium; M: transverse sections ofType2spikelet; N: amplified part of picture. O: SEM mi-croscopical structure of Type1spikelet primordium; le: lemma; sl: sterile lemma; lo: lodicule; pa: palea; pi: pistil; st: stamen. Bar: 22 mm (A); 20 mm (B); 240 μm (C); 75 μm (D); 100 μm (E, J, O); 23 mm (F, G, K, L); 300 μm (H); 78 μm (I); 300 μm (M); 80 μm (N).

2.2 lgdp突變體的農(nóng)藝性狀分析

對(duì)田間種植的野生型和突變體觀察發(fā)現(xiàn), 與野生型相比,突變體的株高顯著增高, 增幅達(dá)到19.14% (圖2-A, F)。統(tǒng)計(jì)節(jié)間長(zhǎng)度和穗長(zhǎng), 發(fā)現(xiàn)突變體I至V節(jié)間(倒一節(jié)間至倒五節(jié)間)長(zhǎng)度分別較野生型增長(zhǎng)10.87%、6.73%、62.41%、298.89%、165.01%, 穗長(zhǎng)也較野生型增長(zhǎng)8.76% (圖2-G, H); 這表明突變體株高增高是由節(jié)間長(zhǎng)度和穗長(zhǎng)伸長(zhǎng)所致, 其中節(jié)間長(zhǎng)度以IV至V增幅最為明顯。突變體和野生型在枝梗數(shù)、每穗小花數(shù)和每穗實(shí)粒數(shù)也存在顯著差異, 其中, 一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)各增多37.5%和19.84% (圖2-I, J), 每穗小花數(shù)顯著增多21.89% (圖2-K); 但由于穎殼開(kāi)裂, 突變體每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重都極顯著下降, 分別降低52.35%、53.33%和44.25% (圖2-L, Q～R)。分析成熟籽粒和米粒, 發(fā)現(xiàn)突變體粒長(zhǎng)顯著伸長(zhǎng), 但米長(zhǎng)有所下降; 同時(shí)粒寬下降, 米寬顯著減少(圖2-B～E, M～P)。因此突變體成熟籽粒相較于野生型顯得更為細(xì)長(zhǎng), 但是米粒表現(xiàn)細(xì)小。

圖2 野生型(WT)和突變體lgdp的株型與粒形

A: 野生型和的植株; B: 野生型和籽粒寬度比較; C: 野生型和籽粒(去殼)寬度比較; D: 野生型和籽粒長(zhǎng)度比較; E: 野生型和籽粒(去殼)長(zhǎng)度比較; F: 株高統(tǒng)計(jì); G: 節(jié)間長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì); H: 穗長(zhǎng)統(tǒng)計(jì); I: 一次枝梗數(shù)統(tǒng)計(jì); J: 二次枝梗數(shù)統(tǒng)計(jì); K: 每穗小花數(shù); L: 每穗實(shí)粒數(shù)統(tǒng)計(jì); M: 粒寬統(tǒng)計(jì); N: 籽粒(去殼)寬度統(tǒng)計(jì); O: 粒長(zhǎng)統(tǒng)計(jì); P: 籽粒(去殼)長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì); Q: 結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì); R: 千粒重統(tǒng)計(jì)。**表示在0.01概率水平差異顯著, *表示在0.05概率水平差異顯著。標(biāo)尺: A為40 cm; B為33 mm; C為40 mm; D為90 mm。

A: plants of WT and; B: the comparison of grain width between WT and; C: the comparison of kernel width between WT and; D: the comparison of grain length between WT and; E: the comparison of kernel length between WT and;F: the statistics of plant height. G: the number of internodes; H: the statistics of panicle height; I: the number of primary branch; J: the number of secondary branch; K: the number of spikelets; L: the number of seeds per panicle; M: the statistics of grain width; N: the statistics of kernel width; O: the statistics of grain length; P: the statistics of kernel length; Q: the statistics of seed-setting rate; R: the statistics of 1000-grain weight. ** and * indicate significant difference between WT andby-test at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively. Bar: 40 cm (A); 33 mm (B); 40 mm (C); 90 mm (D).

2.3 lgdp突變體籽粒穎殼細(xì)胞學(xué)觀察

水稻籽粒形態(tài)主要由穎殼細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞大小決定。為進(jìn)一步明確籽粒伸長(zhǎng)的原因, 對(duì)野生型和突變體成熟籽粒穎殼進(jìn)行掃描電鏡觀察分析。首先確定外稃長(zhǎng)度較野生型增長(zhǎng)11.46%, 但是內(nèi)稃長(zhǎng)度較野生型極顯著減低(圖3-A, B, G, H); 進(jìn)一步觀察野生型和同一行內(nèi)外稃外表皮細(xì)胞數(shù)目, 發(fā)現(xiàn)與野生型相比內(nèi)外稃外表皮上同一行細(xì)胞總數(shù)各增加11.66%和38.62% (圖3-I, J); 同時(shí)在相同視野下觀察野生型和內(nèi)外稃外表皮細(xì)胞數(shù), 統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞大小情況, 發(fā)現(xiàn)的內(nèi)外稃外表皮細(xì)胞都較野生型變小, 其中外稃外表皮細(xì)胞減小34.94%, 內(nèi)稃外表皮細(xì)胞減小15.25% (圖3-K, L)。綜上, 雖然穎殼細(xì)胞大小變小, 但由于外稃細(xì)胞數(shù)目增加幅度更大, 從而導(dǎo)致外稃和籽粒伸長(zhǎng); 而在內(nèi)稃中, 由于細(xì)胞大小減小的幅度更大, 同時(shí)由于內(nèi)稃主體部分的退化, 從而內(nèi)稃的長(zhǎng)度沒(méi)有明顯的增加。這些結(jié)果表明正向調(diào)控穎殼細(xì)胞的增殖, 同時(shí)負(fù)向調(diào)控穎殼細(xì)胞擴(kuò)展。

2.4 lgdp的遺傳分析

以突變體為父本, 溫敏不育系56S、粳稻中花11 (ZH11)和日本晴(NIP)為母本, 分別配制雜交組合, F1植株表型未出現(xiàn)表型分化, 然后對(duì)F1進(jìn)行自交, F2出現(xiàn)表型分離, 正常植株和突變植株數(shù)量之比經(jīng)卡方驗(yàn)證符合3︰1 (表1), 這表明突變性狀受1對(duì)隱性基因控制。

圖3 野生型(WT)和突變體lgdp穎殼的掃描電鏡(SEM)觀察

A: 野生型的成熟籽粒穎殼; B:突變體的成熟籽粒穎殼; C, D: 掃描電鏡觀察外稃外表皮; E, F: 掃描電鏡觀察內(nèi)稃外表皮; G: 外稃長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì); H: 內(nèi)桴長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì); I: 外稃外表皮縱行細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì); J: 內(nèi)稃外表皮縱行細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì): K: 外稃外表皮細(xì)胞大小統(tǒng)計(jì); L: 內(nèi)稃外表皮細(xì)胞大小統(tǒng)計(jì)?？s寫: le: 外稃; pa: 內(nèi)稃。**表示在0.01概率水平差異顯著, *表示在0.05概率水平差異顯著。標(biāo)尺: A、B為5 mm; C～F為300 μm。

A: grain glume of WT; B: grain glume of; C, D: the epidermal cells of lemma of WT andwere observed by scanning electron microscope; E, F: the epidermal cells of palea of WT andwere observed by scanning electron microscope; F: lemma length statistics; G: number of longitudinal epidermal cells in lemma; H: number of longitudinal epidermal cells in palea; I: number of longitudinal epidermal cells in palea; J: number of epidermal cells in lemma per unit area. K: statistics of cell size of palea epidermis. L: statistics of cell size of lemma epidermis. le: lemma; pa: palea. ** and * indicate significant difference at< 0.01 and< 0.05 between WT andby-test, respectively. Bar: 5 mm (A, B); 300 μm (C–F).

表1 野生型和lgdp突變體F2分離的卡方測(cè)驗(yàn)

56S: 瀘56S ; ZH11: 中花11號(hào); NIP: 日本晴。56S: Lu 56S; ZH11: Zhonghua 11; NIP: Nipponbare.

2.5 LGDP基因的定位與候選基因分析

選用與ZH11的F2群體用于基因定位。首先在F2中選出10株突變單株和10株表型正常的單株構(gòu)建突變池和正常池, 用先前篩選好的大約100對(duì)1B與ZH11差異SSR和In/Del標(biāo)記篩選基因池, 發(fā)現(xiàn)位于3號(hào)染色體的SSR標(biāo)記RM6038和RM1002在基因池間存在差異; 進(jìn)一步用這2個(gè)標(biāo)記突變體群體, 重組子個(gè)數(shù)分別為8個(gè)和4個(gè), 根據(jù)重組子的從屬關(guān)系將基因初步定位在RM6038和RM1002之間; 進(jìn)一步在定位區(qū)間設(shè)計(jì)新的SSR和In/Del標(biāo)記, 發(fā)現(xiàn)ZLN30、ZLN43、ZLN-1、ZLN46在親本和基因池間呈現(xiàn)多態(tài)性, 進(jìn)一步用其分析群體, 分別鑒定出重組子4、3、2和3個(gè), 根據(jù)重組子的從屬關(guān)系將基因初步定位在ZLN43和ZLN-1之間, 物理距離大約810 kb (圖4-A)。為了確定候選基因, 首先利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù), 在定位區(qū)間中比較野生型和突變體表達(dá)基因的序列差異, 在中發(fā)現(xiàn)編碼MADS-box的轉(zhuǎn)錄因子OsMADS1的第8外顯子中有一段29 bp的缺失(圖4-B); 進(jìn)一步通過(guò)PCR驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果(圖4-C); 在中該缺失會(huì)導(dǎo)致基因出現(xiàn)移碼突變, 造成蛋白翻譯的提前終止, 從而缺失C端的19個(gè)氨基酸殘基(圖4-C)。

2.6 粒形基因的表達(dá)分析

為探究調(diào)控粒長(zhǎng)的機(jī)制, 我們對(duì)野生型與中已知的控制粒長(zhǎng)的基因表達(dá)進(jìn)行了qPCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 相比野生型,、、基因在中表達(dá)顯著上調(diào), 而、基因表達(dá)量變化不明顯(圖5)。由于、都是主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂來(lái)正向影響籽粒的長(zhǎng)度, 這表明基因可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控、等粒長(zhǎng)正向調(diào)控因子, 從而影響了穎殼的細(xì)胞增殖并決定籽粒的長(zhǎng)度發(fā)育。另外,基因在突變體中的表達(dá)也出現(xiàn)顯著上調(diào), 然而該基因主要是通過(guò)抑制胚乳的發(fā)育影響粒長(zhǎng), 這可能與本研究中的米粒變細(xì)小有一定的關(guān)系。

圖4 LGDP基因的精確定位

A:基因的定位; B:候選基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析; C:候選基因的PCR分析和序列比對(duì)。N: 天冬酰胺; E: 谷氨酸; A: 丙氨酸; D: 天冬氨酸; M: 蛋氨酸; V: 纈氨酸; H: 組氨酸; TGA: 終止密碼子。

A: mapping of thegene; B: RNA-sequencing analysis ofcandidate gene;C: PCR analysis and sequence alignment ofcandidate gene. N: asparagine; E: glutamic acid; A: alanine; D: aspartic acid; M: methionine; V: valine; H: histidine; TGA: the terminate codon.

圖5 粒形相關(guān)基因表達(dá)分析

將1B的穗中的轉(zhuǎn)錄水平設(shè)置為1.0, Bar值表示3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD; **表示在0.01概率水平差異顯著。

Set the transcription level in the panicle of 1B to 1.0, Bars represent standard deviation (= 3); ** indicates significant difference at< 0.01 between 1B andby-test.

3 討論

水稻粒形是衡量稻米外觀品質(zhì)的主要指標(biāo), 同時(shí)也是影響水稻產(chǎn)量性狀的重要因素之一, 因此克隆相關(guān)水稻粒形基因?qū)τ诮馕隽Ｐ伟l(fā)育調(diào)控分子機(jī)制具有重要意義。本研究中突變體屬于長(zhǎng)籽粒類型突變, 表型為外稃伸長(zhǎng)變薄, 內(nèi)稃主體或邊緣退化, 我們將其定位到在ZLN43和ZLN-1之間; 進(jìn)一步通過(guò)定位區(qū)間測(cè)序發(fā)現(xiàn), 與野生型1B對(duì)比, 在突變體中編碼一個(gè)MIKC型MADS-box家族蛋白第8外顯子中有一段29 bp的缺失, 這表明突變體的表型是由的突變所引起的。()和()都是基因的等位突變體。突變體表現(xiàn)出內(nèi)外稃伸長(zhǎng), 穎殼開(kāi)裂, 雌雄蕊數(shù)目異常, 部分穎花甚至產(chǎn)生額外的小花[36];突變體的表型為內(nèi)外稃過(guò)度生長(zhǎng)且開(kāi)裂, 種子裸露, 漿片同源轉(zhuǎn)化為內(nèi)外稃狀結(jié)構(gòu)等[37]; 這種突變程度較為嚴(yán)重的原因可能是突變位點(diǎn)發(fā)生在基因中更為保守的區(qū)域[36-37], 而突變表型主要位于穎殼上, 對(duì)應(yīng)內(nèi)輪花器官未見(jiàn)明顯異常, 這表明突變體是的弱等位突變體。

在前人研究中還分離并克隆了一個(gè)控制水稻產(chǎn)量和提升稻米品質(zhì)的重要基因QTL位點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)其就是的一個(gè)可變剪切形式的突變體, 該轉(zhuǎn)錄因子可以與G蛋白復(fù)合體γ亞基DEP1和GS3直接互作, 并促進(jìn)對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性, 從而參與介導(dǎo)了G蛋白對(duì)水稻粒形的調(diào)控途徑[38]。可變剪接蛋白OsMADS1lgy3會(huì)產(chǎn)生細(xì)長(zhǎng)粒, 提高稻谷的品質(zhì)和產(chǎn)量。是的另外一個(gè)等位基因,6剪切方式的改變?cè)斐善淞Ｖ嘏c產(chǎn)量的增加[39]。比較和、, 它們的突變位點(diǎn)都發(fā)生在蛋白質(zhì)的C區(qū), 說(shuō)明C區(qū)的改變并不會(huì)造成基因功能的完全丟失, 但C區(qū)與穎殼長(zhǎng)度密切相關(guān)。從表型和突變位點(diǎn)上看,、、都屬于的弱等位突變體, 與不同的是,、后兩者的籽粒略微伸長(zhǎng), 內(nèi)外稃形態(tài)正常, 可以直接用于生產(chǎn)當(dāng)中; 而的籽粒伸長(zhǎng)程度雖然明顯長(zhǎng)于, 但是由于內(nèi)稃退化, 而造成結(jié)實(shí)率有所下降, 不能直接利用于實(shí)際生長(zhǎng)。雖然如此, 本研究為通過(guò)為核心的粒形分子設(shè)計(jì)育種提供了一個(gè)新的可能的思路, 即可以通過(guò)創(chuàng)造更多基因C區(qū)的等位突變體, 去挖掘出粒形更長(zhǎng)且內(nèi)外稃發(fā)育正常能直接用于實(shí)際生產(chǎn)的突變體; 或通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種, 使的內(nèi)稃形態(tài)缺陷恢復(fù)正常, 形成產(chǎn)量穩(wěn)定的細(xì)長(zhǎng)粒表型。

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Identification and gene mapping of long grain and degenerated palea () in rice (L.)

LIN Xiao-Xin, HUANG Ming-Jiang, WEI Yi, ZHU Hong-Hui, WANG Zi-Yi, LI Zhong-Cheng, ZHUANG Hui, LI Yan-Xi, LI Yun-Feng*, and CHEN Rui*

Rice Research Institute, Southwest University / Academy of Agricultural Sciences, Southwest University / Transgenic Plants and Safety Control, Chongqing Key Laboratory, Chongqing 400715, China

The grain shape, which consists of grain length and grain width, is the primary determinant of grain yield and one of the important appearance quality traits in rice. It is of great significance to identify the related genes associated with grain shape and to study molecular mechanisms for improving the yield and quality of rice. In this study, a long grain mutant named() deriving from EMS (ethyl methane sulfonate) mutation groups of1B was reported.Inmutant, the elongation of lemma resulted in a long grain. Further SEM analysis revealed that the main reason for lemma elongation was the extremely significant increase in the number of glume cells. Genetic analysis showed that thetrait was regulated by a pair of recessive genes. Using BSA method and the F2population crossingwith ZH11, the target gene was located between the molecular markers ZLN43 and ZLN-1 on chromosome 3, with a physical distance of about 810 kb. The analysis of RNA-seq and PCR indicated thecandidate gene might encode a MADS-box protein. The qPCR referred thatnegatively regulated the relative expression levels of several positive grain length regulatory factors,,,, which affected the cell proliferation of glumes and the grain length. The results of this study laid a foundation for the molecular function analysis ofgene in the future.

rice (L.); grain shape; cell number; gene mapping

10.3724/SP.J.1006.2023.22028

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32172044)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32172044).

陳銳, E-mail: chenruin998@gmail.com; 李云峰, E-mail: liyf1980@swu.edu.cn

E-mail: 2393551889@qq.com

2022-05-09;

2022-10-10;

2022-11-17.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20221116.1824.002.html

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