BnMAPK2對甘藍(lán)型油菜耐旱性的影響

袁大雙 張曉莉 朱冬鳴 楊友鴻 姚夢楠 梁 穎,*

對甘藍(lán)型油菜耐旱性的影響

袁大雙1,2,3張曉莉1,2朱冬鳴1,2楊友鴻1,2姚夢楠1,2梁 穎1,2,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院 / 油菜工程研究中心, 重慶 400715;2西南大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715;3貴州省六盤水市六枝特區(qū)自然資源局, 貴州六盤水 553400

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)參與植物多種生物及非生物脅迫應(yīng)答過程,屬于MAPK級聯(lián)途徑最下游C族基因。本研究成功獲得超量表達(dá)(OE-MAPK2)和RNA干擾表達(dá)(RNAi-MAPK2)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜, 在干旱條件下, OE-MAPK2植株耐旱性增加, RNAi-MAPK2植株耐旱性降低。相關(guān)生理指標(biāo)試驗結(jié)果證明, 在干旱脅迫下,可減緩葉片脫水程度、促進(jìn)植物體內(nèi)脯氨酸積累、降低丙二醛含量, 在干旱后期增加POD活性。比較干旱相關(guān)基因(、)、互作干旱相關(guān)基因(、)以及依賴ABA信號途徑相關(guān)基因(、、), 在轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中表達(dá)水平變化差異, 結(jié)果表明,可正向調(diào)控、、、、、的表達(dá); 負(fù)調(diào)控的表達(dá), 并且依賴ABA信號途徑相關(guān)基因在OE-MAPK2植株中的表達(dá)變化趨勢和突變體中一致。由此推測可通過調(diào)控植株體內(nèi)滲透能力、葉片含水量、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、清除自由基、降低膜脂過氧化來增加植株耐旱性; 還可通過與互作, 負(fù)調(diào)控基因的表達(dá), 介導(dǎo)STRS2依賴ABA信號途徑, 增加植株的耐旱性。本研究為進(jìn)一步闡明基因的抗逆作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

甘藍(lán)型油菜;; 耐旱性; qRT-PCR

油菜是世界食用植物油的主要來源之一[1]。我國的油菜產(chǎn)量和種植面積分別約占世界的三分之一[1]。長江流域是我國油菜主產(chǎn)區(qū), 但在苗期、發(fā)育期及成熟期常受到不同程度的干旱和高溫脅迫[2-3]。干旱脅迫會造成土壤水分降低, 植株脫水、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和光合產(chǎn)物合成降低, 干旱脅迫, 影響油菜生長發(fā)育, 曾導(dǎo)致我國長江流域油菜產(chǎn)量減產(chǎn)25%～ 32%[2]。因此, 培育抗旱油菜品種己成為油菜生產(chǎn)中亟需解決的重要問題之一。傳統(tǒng)的遺傳育種方法育種周期長, 工作量大。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 基因工程技術(shù)已逐漸成為培育耐熱、抗旱作物新品種的有效手段。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs), 是一類絲氨酸/蘇氨酸白激酶, 普遍存在于真核生物中, MAPK級聯(lián)途徑是一種重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)模式, 特異性感受上游信號分子的刺激從而被激活, 通過磷酸化與去磷酸化逐級活化將脅迫信號放大, 傳遞到終端接收的靶蛋白, 引起細(xì)胞內(nèi)一系列生理生化反應(yīng), 實現(xiàn)細(xì)胞的抗逆功能[4-5]。MAPK級聯(lián)根據(jù)MAPK中的保守TXY基序內(nèi)氨基酸序列特點, 將其分成2個大亞型——TEY和TDY, 前者包括A、B和C 3個族, 后者為D族, 目前對A族和B族的研究較多[6]。研究發(fā)現(xiàn)A族MAPKs主要參與激素響應(yīng)及多種環(huán)境脅迫相關(guān)的途徑, 擬南芥中的MAPK3受多種環(huán)境脅迫所激活[7-8], 且在活性氧的刺激下也可以被激活[9]。研究發(fā)現(xiàn)B族MAPKs也參與由逆境脅迫引起的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)以及細(xì)胞分裂過程。例如, 對擬南芥中MAPK4的研究表明, MAPK4可以被非生物脅迫和生物脅迫所激活[7-8,10]。目前對MAPK C亞族MAPK2的研究主要是基因克隆以及表達(dá)模式分析方面研究發(fā)現(xiàn)MAPK2基因參與多種生物和非生物脅迫, 王偉威等[11]研究表明, 在干旱誘導(dǎo)條件下, 大豆葉片中基因表達(dá)量下降; 還有研究證明,基因在植物多種器官中表達(dá), 參與多種脅迫反應(yīng), 如機(jī)械損傷、鎘脅迫、低溫脅迫、除此外基因還受到外源激素誘導(dǎo)表達(dá), 如脫落酸(abscisic acid, ABA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)都會誘導(dǎo)該基因的表達(dá)[12-14]。說明基因可響應(yīng)多種逆境脅迫反應(yīng), 但基因的表達(dá)模式不同。目前, 關(guān)于中基因?qū)Ω仕{(lán)型油菜抗旱性的影響尚未見報道。本研究中證明基因可提高甘藍(lán)型油菜耐旱性, 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù), 初步探索提高甘藍(lán)型油菜抗旱性的機(jī)制, 為完善甘藍(lán)型油菜耐旱分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甘藍(lán)型油菜品種為Westar、PFGC5941M載體、pENTRY-MCS質(zhì)粒的菌液和pEarleyGate101載體為本研究室提供; RNA提取試劑、DNA限制性內(nèi)切酶、PrimerSTAR DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、qRT-PCR熒光酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司; 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成PCR引物。

1.2 BnMAPK2轉(zhuǎn)基因植株載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

已知在甘藍(lán)型油菜中只有一個拷貝[15-17], 以甘藍(lán)型油菜Westar系, cDNA為模板, 用引物FOVMAPK2+ROVMAPK2 (表1)在pfu高保真酶作用下擴(kuò)增基因, 將獲得的片段連接到表達(dá)載體pEarleyGate101上, 獲得超量表達(dá)載體pEarleyGate101-OVBnMAPK2。根據(jù)所獲得的基因片段, 設(shè)計特異性引物, 以pEarleyGate101-OVBnMAPK2質(zhì)粒為模板pfu高保真酶擴(kuò)增基因RNA干擾的反義鏈和正義鏈, 分別命名為iMAPK2-A和iMAPK2-B, 將克隆得到的RNA干擾正、反義片段連接到克隆載體pGEM-T Easy上, 命名為T-iMAPK2-A和T-iMAPK2-B, 提取T-iMAPK2-A和PFGC5941M的質(zhì)粒, 使用限制性內(nèi)切酶II和Ι分別雙酶切T-iMAPK2-A和PFGC5941M載體質(zhì)粒, 電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌, 最后正確的載體PFGC5941M- iMAPK2-A, 將基因的正義干擾片段iMAPK2-B連接到表達(dá)載體PFGC5941M-iMAPK2-A上。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[18]轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜, 試驗材料為甘藍(lán)型油菜Westar品種, 分別以油菜苗的子葉和無子葉的子葉柄為外植體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜。

1.3 干旱處理方法

在一次性培養(yǎng)皿內(nèi)放入2層浸濕的濾紙, 鋪平, 加水至濾紙飽和。將T2代轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜(OE- MAPK2、RNAi-MAPK2)和對照株系(WT)種子均勻擺在濾紙上, 置于人工氣候培養(yǎng)箱正常管理。溫度25℃, 濕度55%, PPFD 18mmol m–2s–1, 光周期14 h/ 10 h (晝/夜)。每日檢查并補(bǔ)充濾紙水分, 同時注意通氣和種子發(fā)霉情況。待油菜下胚軸伸長3～4 cm時移栽到直徑約為12 cm的裝有同等重量田間土∶蛭石(2∶1)的塑料盆缽里, 每盆移栽2棵, 在相同環(huán)境條件下培養(yǎng)至4～6葉期。分別進(jìn)行自然干旱處理(連續(xù)12 d未澆水)和PEG模擬干旱處理(10% PEG- 8000)。

選取長勢一致的油菜幼苗, 停止?jié)菜? 進(jìn)行自然干旱處理, 同時, 每天稱各處理帶株盆缽重量以監(jiān)測各處理失水基本一致。分別于處理0、2、4、6、8和10 d后, 取幼苗葉片作為樣品, 測定干旱相關(guān)生理指標(biāo)。

選取長勢一致的油菜幼苗, 向葉面噴施10% PEG-8000進(jìn)行模擬干旱處理, 分別在噴施0、1、3、9、12 h后, 取葉片保存于-80℃冰箱中, 用于提取RNA對油菜抗旱相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析。

1.4 相關(guān)生理指標(biāo)測定

采用稱重法[19]測定葉片含水量(leaf water content, LWC)。稱取1.0 g的油菜葉片, 于105℃殺青10 min, 80℃烘至恒重后稱出干重, 以(鮮重-干重)/干重來表示葉片的含水量。

研缽內(nèi)加0.1 mol L–1磷酸緩沖液將油菜葉片研磨成10%的樣液, 植物葉片(g)∶磷酸緩沖液(mL) = 1∶9。采用愈創(chuàng)木酚氧化法[20]測定過氧化物酶(POD)活性; 采用羥胺法[21]測定超氧化物歧化酶(SOD)活性; 采用鉬酸銨和可見光法[21]測定過氧化氫酶(CAT)活性; 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[21]測定MDA含量; 試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

采用磺基水楊酸法[21]測定游離脯氨酸含量, 具體方法參見宗學(xué)鳳[21]植物生理研究技術(shù)。

1.5 qRT-PCR

采用Invitrogen公司的TRIzol提取總RNA, 用RNase-free DNaseI (Fermentas公司)去除DNA雜質(zhì), 采用PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa公司)分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以cDNA為模板, Actin7為內(nèi)參, 利用相關(guān)引物(表1), 在模擬干旱條件下, 檢測基因、干旱相關(guān)基因(、、)、BnMAPK2互作蛋白干旱相關(guān)基因(STRS2、CRL1)以及ABA信號通路相關(guān)基因(、、)的表達(dá)情況。

表1 本研究所用引物

1.6 試驗數(shù)據(jù)處理

由Microsoft Excel 2010和Gradphad 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表制作, 試驗數(shù)據(jù)均設(shè)置3個重復(fù), 使用2–ΔΔCt方法分析qRT-PCR數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnMAPK2轉(zhuǎn)基因植株獲得

由圖1可知, OE-MAPK2植株、RNAi-MAPK2植株以及WT植株中基因的表達(dá)范圍分別為0.77～1.65、0.03～0.04、0.11～0.16。超量表達(dá)植株中基因表達(dá)量是野生型的7～15倍, 而野生型植株中基因表達(dá)量是干擾植株的3.67～5.33倍, 說明轉(zhuǎn)基因植株較穩(wěn)定可用于后續(xù)研究。

圖1 轉(zhuǎn)基因植株BnMAPK2和野生型植株表達(dá)量的鑒定

相同處理標(biāo)以不同字母的柱值在< 0.05 水平差異顯著。

Different lowercase letters are significantly different at< 0.05 within the same treatment.

2.2 模擬干旱條件下BnMAPK2基因的表達(dá)模式

模擬干旱脅迫下不同材料中表達(dá)有顯著差異, 在干旱處理1 h和3 h時基因的表達(dá)量逐漸上升, 3 h時上升到最高峰, 說明的表達(dá)量明顯受干旱脅迫的誘導(dǎo); 在模擬干旱處理6 h時基因表達(dá)量下降到最低值, 9 h開始回升, 直到12 h時基因表達(dá)量與0 h基因表達(dá)量接近, 趨于穩(wěn)定; 在模擬干旱處理整個時期中超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量均極顯著高于WT,而干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量均極顯著低于WT?？梢? 本試驗的轉(zhuǎn)基因材料為純合、相對穩(wěn)定的株系,超量表達(dá)植株中基因表達(dá)量高,對干旱脅迫有響應(yīng)。

圖2 干旱條件下BnMAPK2基因的表達(dá)量

數(shù)據(jù)表示為平均值±SD (= 3)。

Data are presented as means ± SDs (= 3).

2.3 干旱脅迫下植株葉片含水量和表型分析

在正常澆水的情況下, 轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株正常生長并長勢基本一致(圖3-A), 對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉齡進(jìn)行統(tǒng)計, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株之間并未達(dá)到顯著性差異(圖3-B), 說明基因?qū)χ仓昝缙诓o顯著性影響。如圖3-A所示, 在干旱處理初期轉(zhuǎn)基因植株與WT植株的葉片含水量變化不大, WT和干擾植株含水量在91%～88%, 超量表達(dá)植株含水量在92%～90%。隨著干旱處理時間延長, 植株的葉片含水量逐漸下降, 當(dāng)自然干旱第8天和第10天時野生型和超量表達(dá)植株葉片含水量達(dá)到顯著性差異。自然干旱第10天時, 超量表達(dá)植株OE-MAPK2-29、野生型植株以及干擾表達(dá)植株RNAi-MAPK2-63葉片的含水量平均為83%、70.86%和67%。和干旱處理第6天相比, 野生型和干擾植株含水量比自然干旱6 d時下降了18%, 超量表達(dá)植株含水量只下降7%。在干旱10 d時對野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型對比(圖3-D), 發(fā)現(xiàn)野生型植株葉片發(fā)生黃化和卷曲, 干擾植株葉片黃化且嚴(yán)重卷曲, 野生型植株和干擾植株都發(fā)生嚴(yán)重萎蔫, 但過表達(dá)植株葉片未發(fā)生黃化、葉片輕微卷曲萎蔫程度較輕。表明可緩解干旱脅迫下植株葉片脫水, 提高植株耐旱性。

2.4 干旱脅迫下BnMAPK2對油菜葉片脯氨酸含量影響

由圖4可知, 在干旱脅迫初期, 轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片脯氨酸含量均較低, 隨著干旱脅迫進(jìn)行, 均呈上升趨勢, 干旱處理第6天時, 脯氨酸含量均急劇上升, 此時0E-MAPK2-29、WT以及RNAi- MAPK2-62植株體內(nèi)脯氨酸含量分別平均為4161.62、2354.39和2221.31 μg g–1, 與干旱處理第4天相比, 超量表達(dá)植株平均提高20.07～29.04倍, 野生型植株平均提高20.14倍, 干擾植株中脯氨酸含量平均提高18.04～19.58倍。當(dāng)干旱處理第10天時OE-MAPK2植株和WT植株都達(dá)到顯著性差異, OE-MAPK2-29、WT以及RNAi-MAPK2-63體內(nèi)脯氨酸的含量分別為5012.94、4480.26和3230.31 μg g–1, 可見可加快干旱脅迫下脯氨酸的積累。

圖3 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片含水量變化和表型分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±SD (= 3)。*、**和***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。顯著性均指轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間比較。

Data are presented as means ± SDs (= 3). *, **, and *** indicate significant differences at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively. Significance refers to the difference between the transgenic plant and the wild type.

圖4 自然干旱條件下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株脯氨酸和丙二醛的對比

數(shù)據(jù)表示為平均值±SD (= 3)。*、**和***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。顯著性均指轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間比較。

Data are presented as means ± SDs (= 3). *, **, and *** indicate significant differences at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively. Significance refers to the difference between the transgenic plant and the wild type.

2.5 干旱脅迫下BnMAPK2對油菜葉片丙二醛含量影響

由圖4-B可知, 在整個干旱時期丙二醛的含量逐漸增加, WT植株葉片中丙二醛的含量都顯著高于超量表達(dá)植株, 在干旱處理4 d時, 干擾植株中丙二醛含量極顯著高于野生型, 此時RNAi- MAPK2-63植株和WT植株中丙二醛植株含量分別為17.01 nmol g–1和10.32 nmol g–1。在干旱后期第8天和第10天時, 超量表達(dá)植株中丙二醛的含量顯著低于WT植株, 第8天時OE-MAPK2- 28植株中丙二醛的含量平均為18.01 nmol g–1, 野生型植株中丙二醛的含量平均為28.34 nmol g–1, 野生型植株中的含量是超量表達(dá)植株的1.57倍, 可見可降低油菜幼苗葉片丙二醛的積累, 減輕細(xì)胞膜的氧化損傷。

2.6 干旱脅迫下BnMAPK2對植株葉片抗氧化酶活性的影響

由圖5可知, 在自然干旱處理過程中OE-MAPK2、RNAi-MAPK2和WT植株葉片中POD、SOD和CAT都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, SOD和CAT的活性均在處理6 d時達(dá)到峰值, 在整個干旱處理時期, 轉(zhuǎn)基因植株中SOD和CAT含量都未與WT植株達(dá)到差異顯著性水平, 雖在第10天時OE-MAPK2植株中SOD含量高于WT, CAT含量低于WT, 但都未達(dá)到顯著性水平。OE-MAPK2、RNAi-MAPK2和WT植株中POD的含量在干旱處理第8天時達(dá)到峰值, 且此時RNAi-MAPK2植株中POD含量與WT植株達(dá)到差異顯著性水平。當(dāng)干旱處理第10天時, OE-MAPK2和RNAi-MAPK2植株中POD含量都與WT植株達(dá)到顯著性差異, 其中OE-MAPK2-28植株中POD的含量平均為941.47 U mg–1protein, 野生型植株中平均為605.44 U mg–1protein, RNAi-MAPK2- 63植株中POD含量為496.21 U mg–1protein, OE-MAPK2-28植株中POD含量是野生型的1.56倍, 野生型植株中POD含量是干擾表達(dá)植株的1.22倍。表明在干旱脅迫下對SOD和CAT活性無顯著影響, 可能通過提高POD抗氧化酶活性減少自由基積累, 從而抵御干旱對油菜的傷害。

圖5 自然干旱條件下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株抗氧化酶含量的對比

數(shù)據(jù)表示為平均值±SD (= 3)。*、**和***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。顯著性均指轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間比較。

Data are presented as means ± SDs (= 3). *, **, and *** indicate significant differences at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively. Significance refers to the difference between the transgenic plant and the wild type.

2.7 轉(zhuǎn)基因油菜苗期葉片干旱相關(guān)基因表達(dá)量分析

為初步探索提高植株耐旱性機(jī)理, 在模擬干旱條件下檢測轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中與干旱有關(guān)基因、以及的表達(dá)情況。如圖6所示, 在干旱脅迫下,以及的表達(dá)模式都是先上升后下降, 其中基因的表達(dá)量在3 h達(dá)到最高值, 此時OE-MAPK2-28植株中的表達(dá)量為9.54, WT植株中的表達(dá)量為0.61, RNAi-MAPK2植株中為0.44, 在整個干旱處理過程中, 只有在干旱處理1 h和3 h時, OE-MAPK2植株與野生型植株中基因的表達(dá)量達(dá)到差異顯著性。基因的表達(dá)量在干旱處理1 h時達(dá)到最大值, 在未處理時, OE-MAPK2植株中基因的表達(dá)量顯著高于WT植株, 但在整個模擬干旱處理期間, 轉(zhuǎn)基因植株中基因的表達(dá)量都未與野生型植株達(dá)到差異顯著性。在整個干旱處理時期和未處理時期OE-MAPK2植株中基因的表達(dá)量均與WT植株達(dá)到顯著性差異, OE-MAPK2植株中基因的表達(dá)量在干旱處理1 h時達(dá)到峰值, 其中OE-MAPK2-29植株的表達(dá)量為3.05, 野生型植株中的表達(dá)量為0.52, 隨著干旱脅迫進(jìn)行, 超量表達(dá)植株中基因表達(dá)量逐漸下調(diào), 但WT植株和RNAi-MAPK2植株中基因的表達(dá)量在干旱處理12 h達(dá)到最大值, 此時OE-MAPK2-29植株、RNAi-MAPK2-62以及WT植株中該基因表達(dá)量分別是1.24、1.96和1.60。表明在干旱脅迫下,正向調(diào)控和基因的表達(dá)量以提高植株的耐旱性, 且發(fā)生在干旱脅迫初期; 對基因表達(dá)無顯著影響。

圖6 干旱條件下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中干旱相關(guān)基因表達(dá)情況

數(shù)據(jù)表示為平均值±SD (= 3)。*、**和***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。顯著性均指轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間比較。

Data are presented as means ± SDs (= 3). *, **, and *** indicate significant differences at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively. Significance refers to the difference between the transgenic plant and the wild type.

2.8 BnMAPK2互作基因表達(dá)量分析

在我們研究室前期篩選到的與BnMAPK2發(fā)生互作的蛋白相關(guān)基因中找到與植株抗旱性有關(guān)的基因和, 在模擬干旱條件下檢測了OE- MAPK2、RNAi-MAPK2和WT植株中和基因表達(dá)情況, 由圖7可知, 在干旱條件下,基因先下降后上升。在干旱處理3 h時, 植株中基因的表達(dá)量下降到最低值, 此時OE-MAPK2-28、RNAi-MAPK2-62以及野生型植株表達(dá)量分別是2.80、0.35和1.85, 干擾表達(dá)植株顯著性低于野生型, 超量表達(dá)植株高于野生型植株, 但未達(dá)到差異顯著性。干旱處理6 h后基因表達(dá)量開始上調(diào), 在12 h達(dá)到峰值, 此時OE-MAPK2植株中該基因的表達(dá)量顯著性高于WT, RNAi-MAPK2植株中該基因的表達(dá)量低于WT, 但未達(dá)到差異顯著性。

在未干旱處理的情況下, OE-MAPK2植物中基因的表達(dá)水平顯著性低于WT植株, 其中OE-MAPK2-28植株中該基因表達(dá)量為0.26, WT植株表達(dá)量為1, 而RNAi-MAPK2植物中的表達(dá)水平顯著性高于WT, 其中RNAi-MAPK2-62植株中表達(dá)量為1.54。在干旱處理條件下,基因的表達(dá)量逐漸下降, 這與基因是一種應(yīng)激反應(yīng)抑制因子有關(guān)。在干旱處理前期1 h和3 h, OE-MAPK2植株中基因的表達(dá)量顯著性低于野生型, 干擾表達(dá)植株中該基因表達(dá)量高, 但未與野生型達(dá)到差異顯著性, 其中OE-MAPK2-28、WT和RNAi-MAPK2- 64植株中基因的表達(dá)量分別為0.06、0.28和0.20。在干旱處理后期, OE-MAPK2植株與WT植株中該基因的表達(dá)量都未達(dá)到差異顯著性?；蚴歉珊得{迫反應(yīng)正向調(diào)控因子,是干旱脅迫反應(yīng)抑制因子研究結(jié)果顯示能正向調(diào)控基因表達(dá), 在干旱處理前期負(fù)調(diào)控基因表達(dá), 說明正向調(diào)控植株干旱脅迫反應(yīng)。

圖7 干旱條件下BnMAPK2互作基因表達(dá)情況

數(shù)據(jù)表示為平均值±SD (= 3)。*、**和***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。顯著性均指轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間比較。

Data are presented as means ± SDs (= 3). *, **, and *** indicate significant differences at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively. Significance refers to the difference between the transgenic plant and the wild type.

2.9 ABA信號途徑相關(guān)基因表達(dá)量分析

有研究表明和都參與ABA依賴途徑提高植株的耐旱性, 因此參照Kant[22], 在干旱條件下檢測了OE-MAPK2、RNAi-MAPK2和WT植株中STRS2ABA信號途徑有關(guān)基因以及的表達(dá)量。在干旱處理過程中3個基因表達(dá)模式都是先上升后下降(圖8)。在未干旱處理時, OE-MAPK2和RNAi-MAPK2植株中基因的表達(dá)量與野生型植株達(dá)到顯著性差異, 其中OE-MAPK2-29植株、WT植株以及RNAi-MAPK2-64植株中基因的表達(dá)量分別為1.50、1.02和0.63。基因的表達(dá)量在干旱處理9h達(dá)到高峰, 此時OE-MAPK2和RNAi-MAPK2植株中該基因的表達(dá)水平均與WT植株達(dá)到極顯著性。在未處理時, OE-MAPK2植株中基因的表達(dá)量與WT植株達(dá)到顯著性差異, 其中OE-MAPK2-30植株中基因的表達(dá)量為1.27, 野生型植株中0.49。干旱條件下,基因的表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值, OE-MAPK2-30植株、WT植株以及RNAi- MAPK2-63中的表達(dá)量分別為2.88、2.07以及1.67, 超量表達(dá)植株都與野生型植株達(dá)到差異顯著性, 干擾植株中只有RNAi-MAPK2-63與野生型植株達(dá)到差異顯著性。在未處理時, OE-MAPK2和RNAi- MAPK2植株中基因的表達(dá)量都未與WT植株達(dá)到差異顯著性, 在干旱處理1h時基因表達(dá)量達(dá)到最大值, 此時, OE-MAPK2植株中基因的表達(dá)水平極顯著性高于WT植株, 其中OE-MAPK2-28植株和WT植株中基因的表達(dá)量分別為1.99和0.91。表明在干旱脅迫過程中基因通過與基因互作, 通過STRS2-ABA信號途徑, 提高植株耐旱性。

圖8 ABA途徑相關(guān)基因表達(dá)模式

數(shù)據(jù)表示為平均值±SD (= 3)。*、**和***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。顯著性均指轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間比較。

Data are presented as mean ± SD (= 3). *, **, and *** indicate significant differences at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively. Significance refers to the difference between the transgenic plant and the wild type.

3 討論

菜籽油是世界上產(chǎn)量豐富的食用油之一, 芥酸和硫代葡萄糖苷含量低。甘藍(lán)型油菜(, 2=38, AACC)結(jié)實率較高, 被廣泛種植, 其種植面積占我國油菜種植面積80%, 但其耐旱性相對較弱, 易遭旱害[23]。干旱影響了甘藍(lán)型油菜的產(chǎn)量和推廣種植, 若能培育抗旱性品種, 不僅能提高油菜產(chǎn)量還能加大我國土地利用率, 為我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)做出貢獻(xiàn)。MAPK級聯(lián)途徑是一種信號傳導(dǎo)分子, 在植物中MAPK不但參與植物生物學(xué)調(diào)控機(jī)制, 還參與生物和非生物的脅迫應(yīng)答[24]。本研究利用轉(zhuǎn)基因(OE-MAPK2, RNAi-MAPK2)甘藍(lán)型油菜和Westar (WT)野生型植株, 在干旱條件下進(jìn)行生理特性和干旱相關(guān)基因表達(dá)水平的比較, 證明該基因可提高植株的耐旱性, 且發(fā)現(xiàn)在模擬干旱條件下在脅迫處理前期基因表達(dá)量劇增, 說明該基因在干旱脅迫初期改變相關(guān)基因表達(dá)來提高植株耐旱性。為了進(jìn)一步了解耐旱機(jī)制, 篩選與BnMAPK2互作并與干旱有關(guān)基因, 在干旱條件下檢測互作基因以及互作基因參與信號途徑有關(guān)基因的表達(dá)量。研究結(jié)果表明,基因在干旱條件下可通過減少植株葉片水分的流失、增加植株葉片中脯氨酸的含量、提高POD活性以及減少植株中丙二醛的積累來提高植株抗旱性, 并且基因能正向調(diào)控與干旱相關(guān)基因和基因的表達(dá)量。脯氨酸作為一種相容的滲透劑, 脯氨酸參與滲透調(diào)節(jié)、穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu), 還是一種自由基清除劑和抗氧化劑[25-26]。脯氨酸還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞溶質(zhì)酸度, 在緩解壓力后充當(dāng)碳和氮儲備, 并且可以充當(dāng)能夠激活防御反應(yīng)的信號分子[27]。有研究表明, 當(dāng)植株遇到干旱環(huán)境, 體內(nèi)脯氨酸含量會迅速上升, 在抗旱植株中上升率比普通材料高[28], 并且積累的脯氨酸通過減輕組織脫水以及保護(hù)細(xì)胞膜和酶來增加植株耐旱性[29-31]。在干旱條件下, 植物體內(nèi)膜脂中飽和脂肪酸的含量會增加而不飽和脂肪酸的含量會下降, 細(xì)胞膜流動性發(fā)生變化, 膜通透性增大, 丙二醛(MDA)含量增多。隨著外界環(huán)境脅迫的加劇, 植物細(xì)胞膜損傷程度加重, 最終會造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞。研究表明, 抗旱性強(qiáng)的作物品種較抗旱性弱的作物品種細(xì)胞膜脂過氧化程度較輕, 體內(nèi)的丙二醛含量增加幅度也較小。在干旱脅迫下植物體內(nèi)會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng), 產(chǎn)生多種自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)如: HO2–、OH–、O2–等, 這些活性氧會被植物體產(chǎn)生的抗氧化劑和抗氧化酶清除。因此, 編碼抗氧化劑和抗氧化酶的基因在植物受到逆境時會表達(dá)上調(diào)[32]。植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的相關(guān)基因過表達(dá), 可提高植物的抗氧化能力, 以此增加植株耐旱性; 有研究發(fā)現(xiàn), 隨著植物體內(nèi)抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)量或者POD、SOD、CAT含量越多, 植物抗旱性越強(qiáng)[33]。(Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate Synthase)基因是植物滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因, 編碼植物體內(nèi)脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因,通過反饋抑制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控來調(diào)節(jié)脯氨酸的生物合成[34], 在干旱、鹽分和寒冷脅迫條件下表達(dá)增加, 導(dǎo)致植物細(xì)胞積累大量脯氨酸, 以減少脅迫對植株損害。對大麥、水稻和其他植物的研究表明, 在干旱和鹽脅迫條件下,基因的表達(dá)和活性水平上調(diào), 從而增加了脯氨酸含量[35-37]。(Sumo Conjugation Enzyme,)是一種通過翻譯后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的蛋白, 編碼SUMO (小泛素樣修飾劑)連接酶, 該連接酶引導(dǎo)小蛋白SUMO通過異肽鍵連接到目標(biāo)蛋白[38]并加以修飾。在各種防御機(jī)制中, SUMO途徑被認(rèn)為是最重要的, 因為受此途徑調(diào)節(jié)的幾種核蛋白參與多種細(xì)胞功能, 例如對壓力的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA代謝、能量新陳代謝、修復(fù)受損DNA、確?；蚪M穩(wěn)定性和核運輸[39]。一般而言, SUMO途徑有其自己特定的一組酶E1、E2和E3。SUMO結(jié)合酶SCE1 (E2)是該途徑中非常重要的成員, 即使沒有E3的參與, 它也可以將SUMO轉(zhuǎn)移到其靶蛋白上[40]。這種酶定位于細(xì)胞核, 這種蛋白質(zhì)水平降低的植物在根生長抑制試驗中對ABA表現(xiàn)出更高的敏感性。有研究者發(fā)現(xiàn),過表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植物中的泛素化修飾水平、抗氧化能力和干旱響應(yīng)基因表達(dá)來提高耐旱性[41]。此外,基因的過表達(dá)改變了轉(zhuǎn)基因水稻植物的生物量和谷物產(chǎn)量參數(shù)?；蛟谵D(zhuǎn)基因水稻植物中的過表達(dá)增強(qiáng)了干旱脅迫耐受性。相反,轉(zhuǎn)基因水稻植株對干旱脅迫高度敏感[42]。由此推測通過增加和的表達(dá)量, 促進(jìn)植物體內(nèi)脯氨酸的合成和泛素化修飾水平,通過調(diào)控植株體內(nèi)滲透能力、葉片含水量、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、清除自由基降低膜脂過氧化來增加植株耐旱性。

為進(jìn)一步了解耐旱機(jī)制, 本研究前期對互作蛋白做了篩選, 從互作蛋白中挑選與干旱相關(guān)基因和, 結(jié)果顯示可正調(diào)控和負(fù)調(diào)控。基因(Cinnamoyl coA: NADP oxidoreductase-like 1)編碼肉桂酰輔酶A, 屬于NADP氧化還原酶。有研究表明ABA、干旱和熱激對有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用, 在種子中有很高的表達(dá)水平[43]。如, 最近研究表明,作為一種PA (phaseic acid)還原酶, PA是ABA的主要分解代謝物, 在結(jié)構(gòu)上與ABA相關(guān), 并具有類ABA激素活性, 通過調(diào)節(jié)擬南芥中的PA穩(wěn)態(tài)而在ABA響應(yīng)和干旱耐受性中發(fā)揮作用[44]。()屬于DEA (D/H)-box RNA helicase家族, 它以依賴ATP的方式, 催化能量穩(wěn)定的雙鏈RNA二級結(jié)構(gòu)的解鏈, 從而在多種生物過程中發(fā)揮作用, 包括轉(zhuǎn)錄、RNA剪接、運輸和翻譯[45]。有研究報道,的轉(zhuǎn)錄水平在冷脅迫下顯著上調(diào), 而它們的轉(zhuǎn)錄水平在鹽脅迫或干旱脅迫下下調(diào);突變體對干旱、鹽、熱脅迫表現(xiàn)出耐受性增強(qiáng), 因此被命名為應(yīng)激反應(yīng)抑制基因[46]。另有研究證明, 在脅迫條件下,可抑制依賴ABA和不依賴ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的激活, 參與植物多種脅迫反應(yīng)[22]?；プ鞯鞍紫嚓P(guān)基因都參與ABA途徑提高植株的抗旱性, 并且有研究者提出通過依賴ABA信號途徑提高植株對非生物脅迫抵御能力的模型圖[44]。因此本研究參照Kant等[22]研究, 在干旱脅迫條件下檢測OE-、RNAi-和WT植株中STRS2-ABA途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量, 分別是以及。是由ABA誘導(dǎo)的脫水基因[47], 并且需要蛋白質(zhì)生物合成來表達(dá)ABA依賴性基因, MYC和MYB的識別位點位于RD22啟動子的67 bp區(qū)域。有研究證明, 在干旱條件下, MYC和MYB蛋白都在基因響應(yīng)植株脫水和ABA誘導(dǎo)表達(dá)中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子[47]。蔗糖非發(fā)酵(SNF1)相關(guān)蛋白激酶是一組在多種生理活動中發(fā)揮作用的蛋白激酶, 可以通過磷酸化下游蛋白質(zhì)羥基, 誘導(dǎo)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因表達(dá), 廣泛參與植物抵抗逆境過程[48]。本研究結(jié)果顯示這些基因在OE-植株中的表達(dá)水平趨勢和在突變體植株中一樣。有研究表明, ABA可減少基因的表達(dá)量, 以此增加ABA信號途徑中相關(guān)基因的表達(dá), 增加植株的抗旱性[22]。在本研究中,干旱脅迫條件下,基因在OE-植株中表達(dá)量下調(diào)。因此推測基因與基因互作, 可使基因表達(dá)量下調(diào), 通過依賴STRS2-ABA信號途徑, 促進(jìn)ABA信號途徑中耐旱性相關(guān)基因的表達(dá), 以此增加植株的耐旱性。

根據(jù)干旱作用機(jī)理, 干旱相關(guān)基因可以分為兩大類: 一類是功能基因, 其基因表達(dá)與植株抵御脅迫能力直接相關(guān), 如參與滲透保護(hù)物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶基因、活性氧清除物質(zhì)及保護(hù)酶合成相關(guān)基因, 以及各種蛋白酶基因等; 另一類是調(diào)節(jié)基因, 可通過調(diào)控多種抗旱相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 增加植株耐旱性, 如多種脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、蛋白磷酸酶基因、蛋白激酶基因等[49]。由此推測,可通過調(diào)控兩類干旱相關(guān)基因的表達(dá), 增加植株耐旱性。一類是功能基因和, 通過調(diào)控功能基因表達(dá), 調(diào)節(jié)植株體內(nèi)滲透能力、葉片含水量、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及清除自由基來降低膜脂過氧化程度增加植株抗旱性; 還有一類是調(diào)節(jié)基因和, 通過與調(diào)節(jié)基因互作參與ABA信號途徑, 促進(jìn)耐旱性相關(guān)基因的表達(dá)來增加植株耐旱性。雖有研究證明基因參與ABA信號途徑, 但具體調(diào)控路徑還未有人報道, 所以本研究只研究了STRS2-ABA信號途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量, 關(guān)于基因與互作怎樣調(diào)控植株干旱脅迫還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

能響應(yīng)干旱脅迫, 在干旱處理3 h表達(dá)量達(dá)到最大, 12 h該基因的表達(dá)量下降到與未處理時接近。可通過增加功能基因(脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因)和(SUMO連接酶)基因的表達(dá), 促進(jìn)植物體內(nèi)脯氨酸的合成和泛素化修飾水平通過調(diào)控植株體內(nèi)滲透能力、葉片含水量、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、清除自由基降低膜脂過氧化來增加植株耐旱性?；蜻€可以通過與應(yīng)激反應(yīng)負(fù)調(diào)控因子(DEAD-box RNA helicases)互作, 使基因表達(dá)量下調(diào), 介導(dǎo)STRS2-ABA信號途徑, 促進(jìn)ABA信號途徑中與干旱相關(guān)基因的表達(dá), 以此增加植株的抗旱性。

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Effects ofon drought tolerance in

YUAN Da-Shuang1,2,3, ZHANG Xiao-Li1,2, ZHU Dong-Ming1,2, YANG You-Hong1,2, YAO Meng-Nan1,2, and LIANG Ying1,2,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University / Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed, Chongqing 400715, China;2Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China;3Natural Resources Bureau of Liuzhi Special Economic Zone, Liupanshui City, Guizhou Province, Liupanshui 553400, Guizhou, China

The mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade is involved in various biotic and abiotic stress responses in plants.belongs to the most downstream C-family genes in the MAPK cascade pathway. In this study,overexpression (OE-MAPK2) and RNA interference expression (RNAi-MAPK2) transgenicwere successfully obtained. Under drought conditions, the drought tolerance of OE-MAPK2 plants was increased, and the drought tolerance of RNAi-MAPK2 plants was decreased. The related physiological indicators showed that under drought stresscould slow down the degree of leaf dehydration, promote the accumulation of proline in plants, reduce the content of malondialdehyde, and increase the activity of POD at the later stage of drought. We compared the differences in the relative expression levels between transgenic and wild-type plants in the drought-related genes (,),-interacting drought-related genes (,), and-dependent ABA signaling pathway-related genes (,,). The results showed thatpositively regulated the relative expression levels of,,,,, and, negatively regulated the relative expression levels of, and the relative expression trends of genes related to STRS2-dependent ABA signaling pathway in OE-MAPK2 plants andmutants were consistent. Therefore, it was speculated thatcan increase plant drought tolerance by regulating thepermeability, leaf water content, cell membrane and protein structure stability, scavenging free radicals, and reducing membrane lipid peroxidation, which can also negatively regulateby interacting with. The relative expression of the genes mediated the-dependent ABA signaling pathway and increased the drought tolerance of plants. This study lays a foundation for further elucidating the anti-stress mechanism ofgene.

;; drought tolerance; qRT-PCR

10.3724/SP.J.1006.2023.24153

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31872876)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31872876).

梁穎, E-mail: yliang@swu.edu.cn

E-mail: 1967548139@qq.com

2022-07-01;

2022-10-10;

2022-10-26.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20221025.1337.004.html

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