泛素受體蛋白OsDSK2b負(fù)向調(diào)控水稻葉瘟和滲透脅迫抗性

丁杰榮 馬雅美 潘發(fā)枝 江立群 黃文潔 孫炳蕊 張 靜 呂樹偉 毛興學(xué) 于 航 李 晨,* 劉 清,*

泛素受體蛋白OsDSK2b負(fù)向調(diào)控水稻葉瘟和滲透脅迫抗性

丁杰榮1,**馬雅美1,**潘發(fā)枝2江立群1黃文潔3孫炳蕊1張 靜1呂樹偉1毛興學(xué)1于 航1李 晨1,*劉 清1,*

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所 / 廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 廣東省水稻工程實(shí)驗(yàn)室, 廣東廣州 510640;2華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 廣東廣州 510642;3廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心 / 廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東廣州 510640

泛素受體蛋白DSK2 (dominant suppressor of KAR2)在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中發(fā)揮重要作用, 但其在水稻抗病和滲透脅迫中的作用尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)受多種逆境的調(diào)控, 該基因的表達(dá)水平在稻瘟病菌侵染和20% PEG-6000處理后顯著降低。時(shí)空表達(dá)分析表明基因在三葉期幼苗中的表達(dá)水平最高, 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。接種稻瘟病菌(GD08-T13和Guy11)后, 敲除植株的病斑面積約為0.05 cm2和0.10～0.13 cm2, 遠(yuǎn)小于野生型植株的病斑面積(0.24 cm2和0.31 cm2)。敲除顯著增強(qiáng)水稻的葉瘟抗性。而且在病原菌侵染后, 敲除植株中病程相關(guān)蛋白()基因的表達(dá)受到明顯誘導(dǎo)。敲除也顯著增強(qiáng)水稻的滲透脅迫抗性, 20% PEG-6000模擬滲透脅迫處理后,敲除植株的存活率為58.3%～74.0%, 顯著高于野生型植株的存活率(17.0%)。敲除植株的離子滲透率和植株失水率則顯著低于野生型植株。掃描顯微鏡的結(jié)果表明, 無(wú)論在20% PEG-6000處理前后, 敲除能夠促進(jìn)氣孔的閉合, 且在20% PEG-6000處理后, 這種促進(jìn)作用會(huì)更強(qiáng)。此外, qRT-PCR結(jié)果表明, 在20% PEG-6000處理后,敲除植株中基因以及脫落酸(ABA)合成或通路相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著高于野生型植株, 且敲除植株和的內(nèi)源ABA含量分別為314.2 ng g–1和344.4 ng g–1, 顯著高于野生型植株的內(nèi)源ABA含量(206.8 ng g–1), 揭示參與調(diào)控滲透脅迫的過程同時(shí)涉及ABA依賴和ABA非依賴途徑。本研究通過解析基因在水稻應(yīng)對(duì)生物與非生物脅迫時(shí)所發(fā)揮的調(diào)控作用, 為水稻抗性品種的選育提供了新的候選基因。

水稻(L.); 稻瘟病; 滲透脅迫; PR; DREB; ABA

植物遭受各種逆境脅迫時(shí), 細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生各種有害蛋白, 使植物生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響。泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin/26S proteasome system, UPS)由泛素(ubiquitin, Ub)、泛素激活酶(ubiquitin- activating enzyme, E1s)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin- conjugating enzyme, E2s)、泛素連接酶(ubiquitin ligase enzyme, E3s)和26S蛋白酶體組成, 可以有選擇性地清除細(xì)胞內(nèi)變性、錯(cuò)誤折疊和各種調(diào)節(jié)蛋白, 在植物應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)中起著重要的作用[1-2]。前人研究發(fā)現(xiàn), 擬南芥E3泛素連接酶基因通過調(diào)控脫落酸(abscisic acid, ABA)的合成影響植物耐旱性[3],(C)通過對(duì)茉莉酸(jasmonic acid, JA)含量的影響, 調(diào)節(jié)植物抗性和育性[4]。

DSK2 (dominant suppressor of KAR2)是一類泛素受體蛋白, 存在于人類、擬南芥、水稻、剛性弓形蟲和酵母等物種中[5-7]。DSK2具有UBA (C-terminal ubiquitin-associated domain)和UBL (N-terminal ubiquitin-like domain)結(jié)構(gòu)域, 它們的UBA和UBL結(jié)構(gòu)域可分別與泛素化的底物和蛋白酶體亞基相結(jié)合, 將多泛素化底物轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白酶體進(jìn)行降解[6,8-9]。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)DSK2對(duì)弓形蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制有重要作用。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)DSK2參與球孢白僵菌的分生孢子萌發(fā)、多重脅迫耐受和熱適應(yīng)。擬南芥的DSK2a和DSK2b均可與PEX2、PEX10和PEX12等蛋白互作, 形成過氧化物體膜相關(guān)蛋白降解系統(tǒng), 影響過氧化物酶體的功能[11]。水稻的OsDSK2a則通過調(diào)節(jié)赤霉素代謝平衡影響水稻生長(zhǎng)和鹽脅迫應(yīng)答[7]。植物中對(duì)DSK2的功能研究還較少, 它們?cè)谥参飸?yīng)對(duì)各種脅迫時(shí)所發(fā)揮的功能及其分子機(jī)制仍亟待研究。

稻瘟病會(huì)嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和谷物品質(zhì)[12]。病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein, PR蛋白)通過水解病原菌細(xì)胞壁、降解病原毒素、抑制病原外殼蛋白與植物受體結(jié)合等方式賦予了植株體外抗病原菌的能力[13]。不同基因的抗病機(jī)制也不同, 其中通過過敏反應(yīng)介導(dǎo)的防御途徑和水楊酸介導(dǎo)的抗性反應(yīng)增強(qiáng)對(duì)植株真菌的抵抗能力[14]。能編碼催化降解病原真菌細(xì)胞壁中β-1,3葡聚糖的β-1,3葡聚糖酶[15]。編碼具抗真菌活性的permatins、zeamatins、osmotins和具葡聚糖酶活性的類甜蛋白[16]。編碼的幾丁質(zhì)酶能降解病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)[17]。誘導(dǎo)稻瘟病抗性且防御過程與過敏性反應(yīng)有關(guān)[18]。PR蛋白在植物抗病反應(yīng)中被誘導(dǎo)表達(dá), 在抗病過程中發(fā)揮著重要作用[19]。

干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重影響水稻的生長(zhǎng), 導(dǎo)致水稻減產(chǎn)[20]。植物受到干旱脅迫時(shí), DREB (dehydration responsive element binding)轉(zhuǎn)錄因子能激活干旱等逆境相關(guān)基因的表達(dá), 從而增強(qiáng)植物的耐逆性[21]。ABA合成基因()和()能促進(jìn)ABA的合成和積累, 從而影響()、()、()和()等ABA通路相關(guān)基因的表達(dá), 進(jìn)而影響植株的耐旱性[22-23]。

OsDSK2b是本實(shí)驗(yàn)室前期在研究類胚素蛋白調(diào)控水稻稻瘟病抗性的過程中, 通過酵母雙雜交篩選到的其中一個(gè)候選互作蛋白, 它可能在水稻抗稻瘟病過程中起著重要作用。本研究以野生型日本晴和3個(gè)的CRISPR-Cas9敲除植株為研究對(duì)象, 測(cè)定了在不同逆境處理下的三葉期野生型日本晴和正常生長(zhǎng)條件下的野生型日本晴各部位的表達(dá)水平, 并對(duì)OsDSK2b進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。同時(shí)鑒定了野生型和基因敲除株系稻瘟病和滲透脅迫的表型, 觀察了野生型和基因敲除株系滲透處理前后的氣孔狀況, 并測(cè)定了它們的內(nèi)源ABA含量。本研究還測(cè)定了稻瘟病脅迫處理前后相關(guān)基因的表達(dá)水平和20% PEG-6000處理前后部分基因、ABA合成基因和ABA通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。旨在闡明在水稻耐逆脅迫中的功能及其響應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

使用日本晴(L. spp.)為水稻遺傳轉(zhuǎn)化受體, 所獲得的轉(zhuǎn)基因植株后代均種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)田, 常規(guī)田間種植管理。本研究用的主要試劑有: TRIzol(湖南艾科瑞生物工程有限公司)、KOD FX(東洋紡(上海)生物科技有限公司)、DNA重組試劑盒(南京諾唯贊生物技股份有限公司)、I-HF(New England Biolabs)、T4 DNA連接酶(New England Biolabs)、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)和ProHS SYBR Green Mix(湖南艾科瑞生物工程有限公司)。多靶點(diǎn)基因編輯載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-H、pYLgRNA-OsU6a和pYLgRNA-OsU6b由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士饋贈(zèng)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 本研究所使用的引物信息表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1敲除株系的獲得 從水稻Rice Genome Annotation Project (http://rice.uga.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得()的基因序列, 依據(jù)Xie等[24]提供的方法在第2個(gè)外顯子區(qū)分別設(shè)計(jì)2個(gè)靶點(diǎn)。通過重復(fù)疊加法(Overlapping PCR)構(gòu)建sgRNA表達(dá)盒[25]。第1輪PCR用接頭引物 U-F/-6aF和U-F/-6bF分別擴(kuò)增U6a和U6b啟動(dòng)子; 用接頭引物gR-R/- 6aR和gR-R/-6bR分別擴(kuò)增U6a和U6b終止子。第一輪PCR產(chǎn)物直接稀釋10倍后各取1?μL作為第2輪PCR模板, 用位置特異引物Pps-GGL/ Pgs-GG2和Pps-GG2/Pgs-GGR分別進(jìn)行第2輪擴(kuò)增, 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。利用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒分別回收6a和6b表達(dá)盒。然后每個(gè)表達(dá)盒各取20?ng, 利用I和T4?DNA連接酶將表達(dá)盒連接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H質(zhì)粒。連接完成后, 取一半連接產(chǎn)物通過熱激法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 培養(yǎng)過夜后挑單菌落, 用引物對(duì)SP1/SP2進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR檢測(cè)陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)一步通過測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

選取構(gòu)建好的編輯質(zhì)粒送武漢伯遠(yuǎn)生物有限公司進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化, 共獲得36株T0代轉(zhuǎn)基因植株。采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA, 而后利用OsDSK2bJC-F/ R引物擴(kuò)增編輯位點(diǎn)兩側(cè)的基因組序列。通過DNA測(cè)序檢測(cè)的基因編輯情況。

1.2.2 不同逆境處理及取樣 將野生型日本晴種子置于49℃烘箱2 d以打破休眠, 然后置于清水中室溫浸泡36?h。種子吸漲后, 瀝干表面水分, 并置于32℃培養(yǎng)箱黑暗條件下催芽2d。選取發(fā)芽一致的種子置于96?孔板中, 清水培養(yǎng)至苗長(zhǎng)5cm時(shí), 換成木村營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉期。三葉期的幼苗用于不同逆境處理, 處理?xiàng)l件分別如下: (1) 稻瘟病菌接種: 取大小一致的葉片離體接種稻瘟病菌生理小種Guy11 (具體接種方法見1.2.5), 分別于接種后1、2、3、4和5d取樣; (2) 聚乙二醇6000(PEG-6000)、NaCl處理: 三葉期的幼苗分別置于用木村培養(yǎng)液配置的20% PEG-6000和150mmol L–1NaCl溶液中, 分別于處理前后0、3、6、9、12和24h取樣; (3) ABA處理: 采用葉噴的方法將100μmol L–1ABA溶液均勻噴灑于水稻幼苗表面, 直至培養(yǎng)盆底部有明水出現(xiàn), 分別于處理前后0、3、6、9、12和24h取樣。取樣時(shí), 用剪刀取下幼苗除根部外的地上部所有組織, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3株幼苗混樣, 用錫箔紙包好, 用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)均同時(shí)取一個(gè)未處理樣品作為對(duì)照, 以防止光照對(duì)基因表達(dá)的影響。水稻幼苗培養(yǎng)與逆境處理均于寧波江南儀器廠智能光照培養(yǎng)箱(GXZ型)中完成, 其參數(shù)設(shè)定為: 光照200?μmol m–2s–1, 光周期12h, 溫度28℃, 相對(duì)濕度75%。

1.2.3 亞細(xì)胞定位 為了檢測(cè)OsDSK2b蛋白的亞細(xì)胞定位, 我們采用引物OsDSK2b-GFP-F/R擴(kuò)增的編碼序列插入35S-GFP載體以產(chǎn)生OsDSK2b-GFP融合蛋白。然后將OsDSK2b-GFP融合蛋白以及35S-GFP空載蛋白按照Z(yǔ)hang等[26]提供的方法分別轉(zhuǎn)入到水稻原生質(zhì)體中。26℃孵育24?h后, 使用激光共聚焦顯微鏡(蔡司LSM710, 德國(guó))觀察GFP熒光。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá) 日本晴不同組織(2周齡幼苗、幼根、莖節(jié)、倒二葉、旗葉、孕穗期根、幼穗和抽穗期穗)以及日本晴三葉期幼苗在稻瘟病分離株Guy11、20% PEG-6000、150 mmol L–1NaCl和100μmol L–1ABA處理的樣品用液氮研磨后, 采用TRIzol法提取總RNA, 微量分光光度計(jì)(NanoDrop One)檢測(cè)RNA濃度并電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。取500ng總RNA用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)? 37℃反應(yīng)15min; 85℃反應(yīng)5s。熒光定量PCR (qRT-PCR)反應(yīng)以cDNA為模板, 內(nèi)參選用基因, 具體反應(yīng)體系包含1μL cDNA模板、10μL ProHS SYBR Green Mix(湖南艾科瑞生物工程有限公司)、正反引物各1 μL和7μL無(wú)菌水。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX Connect Optics Module)里進(jìn)行, 擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃3min; 95℃5s, 60℃30s, 循環(huán)40次?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算用2–ΔΔCt法, 結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。

1.2.5 稻瘟病抗性鑒定 野生型日本晴和敲除植株的稻瘟病抗性鑒定采用活體接種和離體接種2種方法。水稻種子的發(fā)芽過程同上(方法1.2.2), 將3.5 kg從水稻田中挖取的泥土裝入30?cm×15?cm×8 cm的方盆中, 混勻后, 選取發(fā)芽一致的種子播種到方盆中, 置于網(wǎng)室生長(zhǎng)?；铙w接種(打孔接種)使用的菌株為GD08-T13, 具體方法如下: 三葉期的水稻幼苗移栽到直徑為30?cm的黑桶中繼續(xù)培養(yǎng)至分蘗盛期(約播種后42 d左右), 選取生長(zhǎng)較一致的水稻葉片用于稻瘟病菌接種, 其方法參考Ding等[27]。水稻葉片用老鼠耳夾按壓出傷口后用移液槍吸取10 μL濃度為5×105個(gè)孢子 mL–1的菌液(菌液中包含0.05%的吐溫20)滴到傷口中, 再用防水膠布將菌液固定在水稻葉片上。每個(gè)株系至少接種10株, 每株至少接種3片葉。接種后的植株于26℃黑暗培養(yǎng)24 h, 之后轉(zhuǎn)移到網(wǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)6d, 每隔2h噴水一次(每次2 min)以保持濕度。接種7?d后通過ImageJ程序(http://imagej.nih.gov/ij/)測(cè)量病斑面積。將菌斑從葉片上剪下來(lái)后用雙面膠固定在白紙上并照相。

離體接種使用的菌株為Guy11, 具體方法如下: 剪取三葉期水稻幼苗的第1片葉片(從上至下)于方形培養(yǎng)皿(事先于底部平行粘貼2條近邊長(zhǎng)的雙面膠)內(nèi)進(jìn)行固定(葉尖端與末端分別粘于雙面膠, 葉片背面朝上), 將2條脫脂棉卷成適合放入方形培養(yǎng)皿大小的條狀, 蘸取事先加入終濃度為2μg mL–1的激動(dòng)素(kinetin, KT)的無(wú)菌超純水, 輕輕擠去多余的液體,分別貼于葉尖端與葉末端, 蓋上培養(yǎng)皿蓋備用。用灼燒滅菌的打孔器在培養(yǎng)8d后的稻瘟病菌菌落邊緣打取菌碟, 用滅菌的牙簽挑取3～5個(gè)菌碟倒扣(菌絲面朝下)于同一葉片(背面), 以同樣數(shù)量、大小且無(wú)菌的西梅果汁培養(yǎng)基為對(duì)照進(jìn)行接種。接種完成后, 蓋上培養(yǎng)皿蓋(無(wú)需封口), 將整個(gè)方形培養(yǎng)皿輕輕放入托盤中, 小心地向托盤中加入適量無(wú)菌水(注意不要沒過培養(yǎng)皿導(dǎo)致培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)水), 用保鮮膜封住托盤以充分保濕, 最后將整個(gè)托盤置于28℃黑暗處理24h后, 轉(zhuǎn)移至光/暗交替(12 h/12h)條件下繼續(xù)處理, 處理期間可觀察托盤內(nèi)水量, 確保適量的水分, 5d后可開始觀察水稻離體葉片的發(fā)病情況。接種7d后通過ImageJ程序測(cè)量病斑面積, 將接種后的葉片通過雙面膠固定在白紙上并照相。

1.2.6 滲透脅迫表型鑒定 木村培養(yǎng)液培養(yǎng)的三葉期野生型日本晴和敲除植株幼苗用于滲透脅迫表型鑒定, 滲透脅迫采用20% PEG-6000處理。三葉期的水稻幼苗用包含20%PEG-6000的木村培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d, 復(fù)水繼續(xù)培養(yǎng)5 d, 之后統(tǒng)計(jì)株高, 用包含20%PEG-6000的木村培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d, 復(fù)水繼續(xù)培養(yǎng)5 d, 之后統(tǒng)計(jì)存活率。離子滲透率測(cè)定方法如下: 選取20% PEG-6000處理前(0 h)和處理后(24 h和48 h)的三葉期水稻植株上長(zhǎng)勢(shì)一致的倒二葉, 置于10?mL蒸餾水中孵育過夜, 用電導(dǎo)率計(jì)(B-173, 筆式, HORIBA, 日本)測(cè)定葉片煮沸前后的電導(dǎo)率, 離子滲漏率以煮沸前后電導(dǎo)率值的比值表示。植株失水率測(cè)定方法如下: 取三葉期長(zhǎng)勢(shì)基本一致的水稻幼苗地上部(除根部以外的部分)并立即放在干凈的濾紙上, 稱取初始凈重, 計(jì)時(shí)為0min。之后在30、60、90、120、180、240和300min 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)稱重, 計(jì)算水稻幼苗的相對(duì)失水率。相對(duì)失水率(%)=(初始鮮重-測(cè)定時(shí)鮮重)/初始鮮重×100。

1.2.7 氣孔成像與觀察 選取三葉期野生型日本晴和敲除植株20% PEG-6000處理前和處理4 h的倒二葉, 立即置于戊二醛(生工生物工程(上海)股份有限公司)溶液中固定。氣孔照片采用激光共聚焦掃描顯微鏡(S-3400N, 日立, 日本)拍攝。對(duì)葉片背面的氣孔開度、氣孔大小和密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.8 ABA含量測(cè)定 選取三葉期野生型日本晴和敲除植株20% PEG-6000處理前和處理4 h的地上部用于ABA含量測(cè)定, 每個(gè)重復(fù)至少取15株幼苗。樣品前處理參考Pan等[28]和Hui等[29]的方法, 具體如下: 稱取100 mg新鮮水稻粉末樣品(或50?mg冷凍干燥粉末樣品), 加入500 μL異丙醇∶水提取液, 置于4℃振搖30 min, 再加入1 mL二氯甲烷, 充分混勻后, 在4℃下11,766轉(zhuǎn) min–1離心10 min, 取上清液800 μL置于氮?dú)獯蹈珊? 隨后用甲醇水將樣品復(fù)溶, 轉(zhuǎn)移到帶有150 μL內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中用于LC-MS分析。

色譜質(zhì)譜條件: 本試驗(yàn)采用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(API4000, AB SCIEX, 美國(guó))進(jìn)行激素分析。色譜柱: C18色譜柱(XBridge BEH C18, 2.5 μm, 2.1 mm′100.0 mm, Waters), 流速為0.1 mL min–1, 柱溫為30℃。色譜分離系統(tǒng)采用梯度洗脫, A相為0.1%甲酸+5 mmol L–1甲酸銨?+?超純水, B相為0.1%甲酸+ 5 mmol L–1甲酸銨+甲醇, 進(jìn)樣量為10 μL。洗脫梯度為: 0～2 min, 30% B; 2～20 min, 30%～100%B; 20～22 min, 100% B; 22～25min, 100%～30% B; 25～30min, 30% B。質(zhì)譜分析系統(tǒng)采用電噴霧離子源(ESI)和三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器(API 4000), 采用定量模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)采集數(shù)據(jù)。離子極性, 負(fù)離子; 電噴霧電壓, ?4500 V; 離子源溫度, 550℃; 氣源, 氮?dú)? 氣簾氣, 25 psi; 霧化氣, 55 psi; 碰撞氣, 55 psi。用分析軟件 Analyst 1.5.2 (AB SCIEX, 美國(guó))進(jìn)行儀器的控制和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集與處理。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 不同逆境處理、抗性基因表達(dá)檢測(cè)和ABA含量檢測(cè), 均進(jìn)行2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn), 不同逆境處理和抗性基因表達(dá)檢測(cè)每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù), ABA含量檢測(cè)每次設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)?？共∫约皾B透脅迫表型鑒定分別進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn), 每次實(shí)驗(yàn)至少設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(版本23)中的Dunnett’s測(cè)驗(yàn), 所有數(shù)據(jù)用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多種脅迫影響OsDSK2b的表達(dá)

通過檢測(cè)稻瘟病菌接種、滲透脅迫、高鹽和ABA處理后三葉期水稻幼苗中的表達(dá)量, 發(fā)現(xiàn)的表達(dá)顯著地受稻瘟病菌侵染、滲透脅迫、高鹽脅迫和ABA處理的影響。上述脅迫處理后, 水稻中的表達(dá)量發(fā)生不同程度的變化。稻瘟病菌侵染顯著抑制的表達(dá), 在處理后的1d,的表達(dá)量顯著降低, 約為處理前的1/3, 并一直維持至5d后。高鹽脅迫誘導(dǎo)的持續(xù)表達(dá), 在處理后的3h,的表達(dá)量顯著升高, 之后呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài), 并一直維持到24 h后(圖1-A)。滲透脅迫和ABA處理均使的表達(dá)量在處理后3h達(dá)到峰值, 后又在處理后的12 h降至處理前水平(圖1-A)。這些結(jié)果表明,很可能在水稻生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

2.2 OsDSK2b在水稻不同部位的表達(dá)模式和蛋白的亞細(xì)胞定位

為了更好地探究基因在水稻抗逆中的功能, 我們檢測(cè)了該基因在水稻不同組織的表達(dá)情況以及該蛋白的亞細(xì)胞定位。熒光定量PCR的結(jié)果表明,在野生型日本晴的營(yíng)養(yǎng)組織和生殖組織中均有不同程度表達(dá)(圖1-B)。值得注意的是,在水稻兩周齡幼苗的地上部中檢測(cè)到較高的轉(zhuǎn)錄水平, 而在幼根和抽穗期穗中較低, 在莖、倒二葉、旗葉、孕穗期根和幼穗則處于中間水平, 表明在2周齡幼苗中的表達(dá)水平最高。亞細(xì)胞定位的分析結(jié)果顯示, 對(duì)照(空載) GFP蛋白的綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜和細(xì)胞核中均有分布, 而OsDSK2b-GFP融合蛋白的綠色熒光信號(hào)主要分布于細(xì)胞質(zhì)中, 表明OsDSK2b是一個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)的蛋白(圖1-C)。

(圖1)

A:在稻瘟病分離株Guy11、20% PEG-6000、150mmol L–1NaCl和100μmol L–1ABA處理前后的相對(duì)表達(dá)量; B:在日本晴不同組織(2周齡幼苗、幼根、莖節(jié)、倒二葉、旗葉、孕穗期根、幼穗和抽穗期穗)中的相對(duì)表達(dá)量; C: OsDSK2b蛋白在水稻原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位(標(biāo)尺為10 μm)。數(shù)據(jù)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差) (Dunnett’s test, *:

A: the relative expression levels ofbefore and after Guy11, 20% PEG-6000, 150?mmol L–1NaCl, and 100 μmol L–1ABA treatments. B: the relative expression levels ofin different tissues of Nipponbare (two-week-old seedlings, young roots, node, second leaf, flag leaves, root of booting stage, young panicle, and panicle of heading stage). C: the subcellular localization of OsDSK2b in rice protoplast (Bar: 10 μm). Values are means?(±?SDs) from three biological replicates (by Dunnett’s test, *:< 0.05, **:< 0.01).

2.3 敲除OsDSK2b增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性

為了明確在水稻中的功能, 我們利用CRISPR-cas9技術(shù)敲除了野生型日本晴中的, 獲得了26個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因株系, 最后挑選了3個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系(、和)用于后續(xù)的表型鑒定。其中插入了堿基T,缺失堿基T,缺失堿基TAGTC (圖2-A)。敲除植株與野生型植株無(wú)明顯的表型差異。

為了鑒定在水稻抗病中的功能, 我們?cè)谝吧椭仓旰颓贸仓甑姆痔Y盛期采用活體接種(打孔接種)的方法接種稻瘟病菌生理小種GD08-T13, 接種7d后測(cè)量其發(fā)病面積。結(jié)果表明,敲除植株比野生型植株對(duì)GD08-T13的抗性顯著增強(qiáng)(

2.4 OsDSK2b調(diào)控病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步探究調(diào)控水稻稻瘟病抗性的分子機(jī)制, 我們對(duì)野生型日本晴和敲除植株中的基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定, 分析了8個(gè)基因(、、、、、、和)在稻瘟病菌Guy11侵染前后的表達(dá)模式。結(jié)果表明, 正常條件下敲除植株中和基因的表達(dá)水平顯著高于野生型植株(圖3)。病原菌侵染后, 野生型和敲除植株中、、、、和的轉(zhuǎn)錄均被誘導(dǎo)。侵染2d后, 敲除植株中、和的表達(dá)水平顯著高于野生型植株, 而侵染4d后, 它們的表達(dá)水平在野生型和敲除植株中則無(wú)顯著差異。侵染2d后,、和在敲除植株中的表達(dá)水平與野生型植株相比并無(wú)顯著差異, 而侵染4d后, 它們?cè)谇贸仓曛械谋磉_(dá)水平顯著高于野生型植株(圖3)。綜上所述, 敲除介導(dǎo)的水稻稻瘟病抗性增強(qiáng)很可能與基因的激活密切相關(guān)。

2.5 敲除OsDSK2b增強(qiáng)水稻對(duì)滲透脅迫的抗性

為了進(jìn)一步探究在水稻滲透脅迫中的調(diào)控作用, 將野生型日本晴和敲除植株的三葉期幼苗, 置于含有20% PEG-6000的木村培養(yǎng)液中分別處理3d和5?d, 復(fù)水培養(yǎng)5?d后觀察表型。20% PEG-6000處理前, 敲除植株與野生型生長(zhǎng)情況基本一致。滲透脅迫處理3?d并復(fù)水培養(yǎng)5?d后, 野生型和敲除植株的葉片均出現(xiàn)了干枯和卷曲, 且敲除植株、和的綠色部分的株高(11.03、12.13和11.01 cm)顯著高于野生型植株的株高(8.28 cm)(圖4-A, B)。20% PEG-6000處理5?d并復(fù)水培養(yǎng)5?d后, 絕大多數(shù)的野生型植株已死亡, 而大多數(shù)的敲除植株仍存活, 敲除植株、和的存活率(62.5%、58.3%和74.0%)顯著高于野生型植株的存活率(17.0%)(圖4-C, D)。20% PEG-6000處理前后離子滲透率測(cè)定結(jié)果表明, 脅迫處理?xiàng)l件下, 野生型和敲除植株葉片的離子滲透率均出現(xiàn)了增加, 在處理后的24 h, 敲除植株、和葉片的離子滲透率分別為7.4%、7.6%和6.9%, 顯著低于野生型植株葉片的離子滲透率(12.0%) (圖4-E)。在處理后的48 h, 敲除植株、和葉片的離子滲透率(11.0%、10.2%和10.7%), 也顯著低于野生型植株葉片的離子滲透率(18.0%) (圖4-E)。

圖2 敲除OsDSK2b增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性

A:的結(jié)構(gòu)和各敲除株系的靶序列突變情況。外顯子和內(nèi)含子分別用黑色矩形和黑線表示, 紅色字體表示CRISPR載體構(gòu)建的靶序列, 藍(lán)色字體表示插入的堿基, 省略號(hào)表示缺失的堿基; B: 打孔接種GD08-T13菌株7 d后, 野生型日本晴和敲除株系的表型圖; C: 打孔接種GD08-T13菌株7 d后,敲除株系和野生型日本晴的病斑面積統(tǒng)計(jì)圖; D: 離體接種Guy11菌株7 d后, 野生型日本晴和敲除株系的表型圖; E: 接種Guy11菌株7 d后,敲除株系和野生型日本晴的病斑面積統(tǒng)計(jì)圖。數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差) (Dunnett’s測(cè)驗(yàn), *:

A:the gene structure ofand mutation of target sequence inknockout strains. Exon and intron are represented by the blank rectangle black line. Red font represents the target sequence in CRISPR vector construction, blue fonts represent the inserted bases, and ellipsis represent the missing bases; B: the phenotype of wild-type Nipponbare andknockout plants 7 d after inoculation with GD08-T13 using the punch method; C: the lesion sizes of wild-type Nipponbare andknockout plants 7 d after inoculation with GD08-T13 using the punch method; D: the phenotype of wild-type Nipponbareandknockout plants 7 d after inoculation with Guy11; E: The lesion sizes of wild-type Nipponbare andknockout plants 7 d after inoculation with Guy11. Values are means?(±?SDs) from three biological replicates (Dunnett’s test, *:

(圖3)

稻瘟病菌Guy11接種前(0 h)和接種后(2 d和4 d), 野生型日本晴和敲除植株葉片中的基因的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)(Dunnett’s測(cè)驗(yàn), *:

The relative expression levels ofgenes inleaves ofwild-type Nipponbareandknockout plants before (0?h) and after (2 d and 4 d) pathogen inoculation with Guy11. Values are means (±?SDs) from three biological replicates (Dunnett’s test, *:< 0.05; **:< 0.01).

此外, 我們還對(duì)野生型和敲除植株地上部的離體失水率進(jìn)行了測(cè)定, 結(jié)果顯示在整個(gè)失水過程中, 3個(gè)敲除株系的失水率均明顯低于野生型植株(圖4-F)。已有研究表明植物的失水率與氣孔密切相關(guān)[30]。為了明確敲除導(dǎo)致的滲透脅迫抗性增強(qiáng)是否與植株的氣孔有關(guān), 我們檢測(cè)了野生型和敲除植株葉片上的氣孔大小、氣孔密度以及20% PEG-6000處理前后氣孔的張開度。結(jié)果如圖5-A所示, 一共發(fā)現(xiàn)了3種類型的氣孔(全開、半開和全閉合)。正常條件下, 野生型氣孔全開類型占比30.52%, 而敲除株系中氣孔全開類型的比例為24.16%～ 26.25%。野生型氣孔全閉合類型占比43.15%, 而敲除株系中氣孔全閉合類型的比例為51.87%～54.08% (圖5-B)。20% PEG-6000處理?xiàng)l件下, 野生型氣孔全開類型占比10.29%, 而敲除株系中氣孔全開類型的比例為2.32%～3.03%。野生型氣孔全閉合類型占比44.52%, 而敲除株系中氣孔全閉合類型的比例為65.15%～71.23% (圖5-C)。野生型和敲除植株葉片上氣孔的大小和密度均無(wú)顯著差異(圖5-D, E)。上述結(jié)果表明敲除能夠促進(jìn)氣孔的閉合, 從而增強(qiáng)植株的滲透脅迫抗性。

(圖4)

A: 20% PEG-6000處理前與處理3?d再?gòu)?fù)水生長(zhǎng)5?d后, 野生型日本晴和敲除株系的表型圖; B: 20% PEG-6000處理3?d再?gòu)?fù)水生長(zhǎng)5 d后, 野生型日本晴和株高統(tǒng)計(jì)圖; C: 20% PEG-6000處理前與處理5?d再?gòu)?fù)水生長(zhǎng)5d后, 野生型日本晴和敲除株系的表型圖; D: 20% PEG-6000處理5 d再?gòu)?fù)水生長(zhǎng)5d后, 野生型日本晴和的存活率統(tǒng)計(jì)圖; E: 20% PEG-6000處理前后, 野生型日本晴和的離子滲透率統(tǒng)計(jì)圖; F: 野生型日本晴與敲除株系地上部在0、30、60、90、120、180、240和300 min的離體失水率統(tǒng)計(jì)圖。數(shù)據(jù)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差) (Dunnett’s測(cè)驗(yàn), *:

A: the phenotype of wild-type Nipponbare andknockout plants under normal condition or 3 d 20% PEG-6000 treatment and 5 d recovery; B: the plant height of wild-type Nipponbare andknockout plants under normal condition or 3 d 20% PEG-6000 treatment and 5 d recovery; C: the phenotype of wild-type Nipponbare andknockout plants under normal condition or 5 d 20% PEG-6000 treatment and 5 d recovery; D: the survival rates of wild-type Nipponbare andknockout plants under normal condition or 5 d 20% PEG-6000 treatment and 5 d recovery; E: the ion leakage of wild-type Nipponbare andknockout plants before and after osmotic stress treatment; F: the water loss rates of seedlings ofwild-type Nipponbare andknockout plants at 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, and 300?min. Values are means (± SDs) of three biological replicates (Dunnett’s test, *:

圖5 敲除OsDSK2b降低氣孔開度

A: 不同開放程度的氣孔圖。標(biāo)尺為10 μm; B: 正常條件下和20% PEG-6000處理4 h后, 野生型日本晴和敲除株系中3種不同開放程度的氣孔占比統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果以3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)表示, 每個(gè)重復(fù)至少統(tǒng)計(jì)300個(gè)以上氣孔; C: 野生型日本晴和敲除株系中氣孔密度統(tǒng)計(jì)圖; D: 野生型日本晴和敲除株系中氣孔大小統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果以3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)表示, 每個(gè)重復(fù)至少統(tǒng)計(jì)100個(gè)氣孔。

A: the stomata with different opening degrees. Bar: 10 μm; B: the stomatal proportions of three different degrees of opening on the leaves of wild-type Nipponbare andknockout plants under normal condition and after 20% PEG-6000 treatment for 4 h. Values are means (± SDs) of three biological replicates, and at least 300 stomata were calculated in each replicate; C: the stomatal density of wild-type Nipponbare andknockout plants; D:the stomatal size of wild-type Nipponbare andknockout plants. Values are means (± SDs) of three biological replicates, and at least 100 stomata were calculated in each replicate.

2.6 OsDSK2b調(diào)控抗逆相關(guān)基因的表達(dá)

為了深入探究調(diào)控水稻滲透脅迫的分子機(jī)制, 在正常和20% PEG-6000處理?xiàng)l件下, 分析了野生型和敲除植株之間抗逆相關(guān)基因的表達(dá)水平。選取了4個(gè)與脫水脅迫密切相關(guān)的基因(、、和)、2個(gè)ABA合成基因(和)和4個(gè)ABA通路相關(guān)基因(、、和)進(jìn)行分析。在正常條件下, 只有、和在敲除植株中的表達(dá)水平顯著高于野生型。20% PEG-6000處理?xiàng)l件下, 上述10個(gè)基因的表達(dá)在野生型和敲除植株中均受到顯著誘導(dǎo), 且它們?cè)谇贸仓曛械谋磉_(dá)水平均顯著高于野生型植株(圖6)。結(jié)果表明在滲透脅迫條件下能夠調(diào)控脫水脅迫相關(guān)基因以及ABA通路相關(guān)基因的表達(dá)。

2.7 OsDSK2b影響內(nèi)源ABA的積累

ABA合成和通路相關(guān)基因的表達(dá)變化預(yù)示著很有可能可以調(diào)控內(nèi)源ABA的水平。為了驗(yàn)證這一猜想, 我們利用LC-MS測(cè)定了野生型和敲除植株中在正常條件和20% PEG-6000處理后的ABA含量。結(jié)果表明, 在正常條件下, 野生型和敲除植株中的ABA含量并無(wú)明顯差異。在20% PEG-6000處理后, 野生型和敲除植株的ABA含量均顯著上升, 且敲除植株和中的內(nèi)源ABA含量(314.2 ng g–1和344.4 ng g–1)顯著高于野生型植株的內(nèi)源ABA含量(206.8 ng g–1) (圖7)。這表明敲除能夠影響脅迫條件下植株體內(nèi)ABA的積累。

(圖6)

A: 20% PEG-6000處理前(0 h)和處理后(4 h)野生型日本晴和敲除株系中基因的相對(duì)表達(dá)量; B: 20% PEG-6000處理前(0 h)和處理后(4 h)野生型日本晴和敲除株系中ABA信號(hào)通路相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差) (Dunnett’s測(cè)驗(yàn), *:

A: the relative expression levels ofgenes in wild-type Nipponbare andknockout plants before (0 h) and after (4 h) 20% PEG-6000 treatment; B: the relative expression levels of ABA-related genes in wild-type Nipponbare andknockout plants before (0 h) and after (4 h) 20% PEG-6000 treatment. Values are means?(±?SDs) from three biological replicates (Dunnett’s test, *

圖7 OsDSK2b影響20% PEG-6000處理下水稻內(nèi)源ABA的積累

數(shù)據(jù)均為6個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)(Dunnett’s測(cè)驗(yàn), *:

Values are means?(±?SDs) from six biological replicates (Dunnett’s test, *:

3 討論

DSK2是一類可以將泛素化底物轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白酶體進(jìn)行降解的泛素受體蛋白, 對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育、耐熱、耐鹽等起著重要作用[6-7,10]。本研究發(fā)現(xiàn)野生型株系受到稻瘟病菌的侵染后,表達(dá)量顯著下調(diào),敲除株系對(duì)稻瘟病的抗性顯著強(qiáng)于野生型株系, 這說明能負(fù)向調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 受到稻瘟病侵染后,敲除株系中的部分基因比野生型株系上調(diào)程度顯著更大, 說明對(duì)水稻稻瘟病抗性的影響與基因的差異表達(dá)有關(guān)。植株受到稻瘟病脅迫后,的下調(diào)表達(dá)能提高部分基因的轉(zhuǎn)錄水平, 進(jìn)而增強(qiáng)植株對(duì)稻瘟病的抗性。不同類型基因的抗病機(jī)制有所不同[14-18]。本研究也發(fā)現(xiàn)不同基因在敲除株系稻瘟病菌侵染后有不同的響應(yīng)模式。更值得注意的是, 在稻瘟病菌接種前,敲除株系中的和基因的表達(dá)量顯著高于野生型株系。已有研究表明,表達(dá)量的變化會(huì)影響水稻對(duì)白葉枯病的抗性[31-33]。這預(yù)示著可能也影響著水稻對(duì)白葉枯的抗性。

本研究還發(fā)現(xiàn)敲除能增強(qiáng)植株的20% PEG-6000處理后的滲透脅迫抗性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 20% PEG-6000處理后, 4個(gè)脫水脅迫密切相關(guān)的基因(、、和)、2個(gè)ABA合成基因(和)和4個(gè)ABA通路相關(guān)基因(、、和)的表達(dá)在野生型和敲除植株中均受到顯著誘導(dǎo), 且它們?cè)谇贸仓曛械谋磉_(dá)水平均顯著高于野生型植株。眾所周知, 植物對(duì)逆境的應(yīng)答主要分為ABA依賴和ABA非依賴型的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[34]。轉(zhuǎn)錄因子DREB通過ABA非依賴途徑被激活后, 會(huì)特異結(jié)合啟動(dòng)子的DRE/CRT順式作用元件并調(diào)控耐逆相關(guān)基因的表達(dá), 過表達(dá)等基因有利于增強(qiáng)植物的耐逆性[21,35]。20% PEG-6000處理后,敲除植株中基因的表達(dá)水平均顯著高于野生型植株, 可能賦予了敲除植株更強(qiáng)的滲透脅迫抗性。已有研究表明, 內(nèi)源ABA濃度能夠影響植物氣孔的開閉[36]。在水分脅迫下, 植物內(nèi)源ABA含量增加, 導(dǎo)致氣孔關(guān)閉, 最終減少了由于蒸騰作用帶來(lái)的水分損失[36]。本研究中, 我們也發(fā)現(xiàn)敲除會(huì)影響植株的氣孔開閉度,滲透脅迫下,敲除植株中的氣孔開放程度顯著低于野生型植株。內(nèi)源ABA的定量結(jié)果顯示, 滲透脅迫下,敲除植株中的內(nèi)源ABA含量顯著高于野生型植株, 這剛好與敲除植株中擁有更多閉合氣孔的結(jié)果是相吻合的。綜上所述, 敲除導(dǎo)致的滲透脅迫抗性增強(qiáng)與ABA依賴和ABA非依賴型的信號(hào)均密切相關(guān)。

是的同源基因。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn), 正常條件下,敲除株系的株高顯著低于野生型株系, 鹽脅迫條件下,敲除株系的存活率顯著高于野生型株系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), OsDSK2a通過與EUI (ELONGATED UPPERMOST INTERNODE)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)GA分解代謝, 進(jìn)而影響水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)鹽脅迫的抗性[7]。在正常條件下, OsDSK2a介導(dǎo)EUI的降解以維持植物正常生長(zhǎng)。在鹽脅迫條件下, OsDSK2a表達(dá)水平降低, 從而釋放EUI蛋白, 使植株GA水平降低, 通過抑制植物生長(zhǎng)速度來(lái)提高植株存活率[7]。本研究發(fā)現(xiàn)與一樣, 在水稻的各個(gè)組織部位都有表達(dá)。但是, 正常條件下,敲除株系與野生型株系在表型上無(wú)顯著差異。而Kaur等[11]在擬南芥中通過microRNA降低基因的表達(dá)量, 對(duì)植株的生長(zhǎng)也無(wú)明顯影響。這說明具有與不一樣的生物學(xué)功能,參與水稻響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制也可能不同于, 具體機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究證明了負(fù)向調(diào)控水稻的稻瘟病抗性和滲透脅迫抗性。初步證明通過影響基因的表達(dá), 調(diào)控水稻的稻瘟病抗性。通過ABA信號(hào)依賴和ABA非依賴通路途徑, 調(diào)控水稻的滲透脅迫抗性。本研究還發(fā)現(xiàn)參與水稻響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制不同于它的同源基因, OsDSK2b與相關(guān)蛋白的互作機(jī)理仍有待探究。此外, 本研究結(jié)果預(yù)示可能還參與調(diào)控水稻的白葉枯抗性。具有功能多效性, 深入探究它在水稻逆境脅迫下功能及其調(diào)控的分子機(jī)制, 將為培育強(qiáng)耐逆性和高抗病性的水稻品種奠定理論基礎(chǔ)。

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Ubiquitin receptor protein OsDSK2b plays a negative role in rice leaf blast resistance and osmotic stress tolerance

DING Jie-Rong1,**, MA Ya-Mei1,**, PAN Fa-Zhi2, JIANG Li-Qun1, SUN Bing-Rui1, ZHANG Jing1, LYU Shu-Wei1, MAO Xing-Xue1, YU Hang1, LI Chen1,*, and LIU Qing1,*

1Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory of New Technology in Rice Breeding / Guangdong Rice Engineering Laboratory, Guangzhou 510640, Guangdong, China;2South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China;3Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory for Crop Germplasm Resources Preservation and Utilization, Guangzhou 510640, Guangdong, China

The ubiquitin receptor protein DSK2 (dominant suppressor of KAR2) plays an important role in the growth, development, and stress tolerance in plant, but its role in rice disease resistance and osmotic stress has not been reported yet. In this study, we identified thatwas regulated by various stresses, and the relative expression level of this gene decreased significantlyafterinfection and 20% PEG-6000 treatment. The spatio-temporal expression analysis showed that the relative expression level ofwas highest at three-leaf seedlingstage. The subcellular localization analysis demonstrated that OsDSK2b was localized in the cytoplasm in rice protoplast. The lesion area ofknockout plants was about 0.05 cm2and 0.10–0.13 cm2, which was much smaller than wild-type plants (0.24 cm2and 0.31 cm2) after inoculation with(GD08-T13 and Guy11). Compared with wild-type plants, knockout ofsignificantly enhancedthe leaf blast resistance in rice, and the relative expression levels of pathogenesis-related protein () genes were induced significantlyinknockout plants after(Guy11) infection. The knockout ofalso significantly enhanced the osmotic stress tolerance in rice.knockout plants had higher survival rate (58.3%–74.0%) than wild-type plants (17.0%) after 20% PEG-6000 treatment. Meanwhile, compared with wild-type plants,knockout plants had lower ion permeability and water loss rate after 20% PEG-6000 treatment. Scanning microscopy revealed that knockout ofcould promote the stomatal closure both before and after 20% PEG-6000 treatment, and the promotion effect was stronger after osmotic stress treatment. In addition, qRT-PCR results showed that the relative expression level ofgenes and abscisic acid (ABA) synthesis or pathway-related genes were significantly higher inknockout plants than wild-type plants after osmotic stress treatment.The endogenous ABA contents ofandknockout plants were 314.2 ng g–1and 344.4 ng g–1, respectively, which were significantly higher thanwild-type plants (206.8 ng g–1). These results indicated thatcould regulate rice osmotic stress through both the ABA-dependent and ABA-independent pathways. This study provides a new candidate gene for the breeding of rice resistant varieties by analyzing the regulatory role ofin rice coping with biotic and abiotic stresses.

rice (L.); rice blast; osmitic stress; PR; DREB; ABA

10.3724/SP.J.1006.2023.22039

本研究由廣東省發(fā)展和改革委、農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳投資項(xiàng)目(粵發(fā)改農(nóng)經(jīng)[2021]272號(hào)), 科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高水平人才建設(shè)項(xiàng)目(R2020PY-JX001)和廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行費(fèi)專項(xiàng)(2020B1212060047)資助。

This study was supported by the Investment Project of Department of Agriculture and Rural Affairs, Development and Reform Commission, Guangdong province (Yue Fa Gai Nong Jing [2021]272), the Special Fund for Scientific Innovation Strategy-Construction of High Level Academy of Agriculture Science (R2020PY-JX001), and the Guangdong Key Laboratory of New Technology in Rice Breeding (2020B1212060047).

劉清, E-mail: liuqing198504@126.com; 李晨, E-mail: 2369538973@qq.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

丁杰榮, E-mail: jierongdjr@163.com; 馬雅美, E-mail: mayamei@gdaas.cn

2022-06-22;

2022-11-25;

2022-12-07.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20221206.1614.006.html

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