RNA農(nóng)藥的研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景

關(guān) 梅，晁子健，閆 碩，沈 杰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物生物安全系，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物檢疫害蟲(chóng)監(jiān)測(cè)與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

基因干擾（RNAi）是一種在動(dòng)物、植物和微生物中高度保守的基因表達(dá)調(diào)控工具。1998年，F(xiàn)ire等[1]首次在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）中證明了觸發(fā)基因沉默的關(guān)鍵因子是雙鏈RNA（dsRNA），而非單鏈RNA。具體而言，dsRNA被Dicer-like蛋白隨機(jī)剪切成長(zhǎng)度為21～24 nt的小RNA（siRNA或miRNA），siRNA與Argonaute蛋白（AGOs）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISCs），該復(fù)合體與目標(biāo)RNA鏈互補(bǔ)，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制翻譯進(jìn)程[2]。利用RNAi技術(shù)靶向有害生物的必須基因，實(shí)現(xiàn)高效的基因沉默，可有效控制病蟲(chóng)害的發(fā)生?；赗NAi技術(shù)創(chuàng)制的新型核酸農(nóng)藥被稱(chēng)為農(nóng)藥史上第三次革命，與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，具有靶向性高、易降解、靶點(diǎn)豐富及可靈活設(shè)計(jì)等優(yōu)勢(shì)。目前，RNAi在植物病蟲(chóng)害防控領(lǐng)域的應(yīng)用主要通過(guò)4種途徑實(shí)現(xiàn)（圖1）：（1）HIGS，即培育表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物以防治病蟲(chóng)害；（2）VIGS，即利用病毒或微生物表達(dá)和遞送靶標(biāo)生物dsRNA的方法；（3）SIGS，即創(chuàng)制噴灑型RNA農(nóng)藥，直接噴施于植物表面以控制病原菌和害蟲(chóng)[3]；（4）NDGS，即利用納米載體遞送dsRNA以誘導(dǎo)靶標(biāo)基因沉默的方法。

圖1 RNAi 在植物病蟲(chóng)害防控領(lǐng)域的4 種應(yīng)用策略示意圖

本文介紹了以RNAi為核心的病蟲(chóng)害防治技術(shù)的研究現(xiàn)狀，分別論述了基于HIGS、VIGS、SIGS和NDGS策略的RNAi技術(shù)用于防治植物病蟲(chóng)害的應(yīng)用實(shí)例及商業(yè)化情況，并對(duì)核轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因作物和創(chuàng)制噴灑型RNA農(nóng)藥的瓶頸問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)，點(diǎn)明了葉綠體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)和納米載體遞送dsRNA策略的優(yōu)勢(shì)。dsRNA的合成成本、保護(hù)劑和載體制備工藝、轉(zhuǎn)基因植物和載體的生物安全性評(píng)估，仍然是未來(lái)在研發(fā)和商業(yè)化生產(chǎn)中需要關(guān)注的問(wèn)題。

2 利用HIGS策略防控病蟲(chóng)害

2.1 核轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

研究人員已成功實(shí)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)調(diào)控病蟲(chóng)害生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因dsRNA，降低靶基因的表達(dá)量，導(dǎo)致靶標(biāo)生物死亡或發(fā)育畸形，從而控制病蟲(chóng)害發(fā)展的策略。通過(guò)核轉(zhuǎn)基因工程向細(xì)胞核導(dǎo)入外源基因的核基因轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種主要的HIGS策略[4]。例如，在對(duì)咀嚼式口器害蟲(chóng)的防治中，Zhu等[5]報(bào)道了一種表達(dá)棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）蛻皮基因（ECR）dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草，幼蟲(chóng)取食煙草后出現(xiàn)死亡和蛻皮缺陷的現(xiàn)象，從而提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)害蟲(chóng)的抗性。在另一項(xiàng)報(bào)道中，Mamta等[6]選擇了害蟲(chóng)蛻皮必需的幾丁質(zhì)酶基因（HaCHI）作為靶標(biāo)，構(gòu)建了表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因番茄和煙草品系，取食轉(zhuǎn)基因植物的棉鈴蟲(chóng)表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩和高死亡率，蛹和成蟲(chóng)均出現(xiàn)了發(fā)育畸形的現(xiàn)象。在對(duì)刺吸式害蟲(chóng)的防治中，Coleman等[7]采用表達(dá)dsRack1，dsMpC002和dsMpPIntO2的轉(zhuǎn)基因擬南芥飼喂蚜蟲(chóng)，蟲(chóng)體內(nèi)的基因表達(dá)量降低70%，蚜蟲(chóng)的繁殖能力下降40%～60%。Murtaza等[8]通過(guò)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表達(dá)蚜蟲(chóng)巨噬細(xì)胞抑制因子（MIF1）的dsRNA，誘導(dǎo)蚜蟲(chóng)基因沉默并導(dǎo)致死亡，不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系對(duì)蚜蟲(chóng)基因沉默的效率為30%～62%。在植物病害防控領(lǐng)域，Nowara等[9]將靶向病原菌葡聚糖轉(zhuǎn)移酶基因（GTF1/2）的dsRNA轉(zhuǎn)入大麥和小麥中，有效抑制了真菌的生長(zhǎng)，提高了大麥和小麥植株對(duì)病原菌的抗性。在對(duì)土傳病害的防治中，Zhang等[10]報(bào)道了一種表達(dá)microRNA166和microRNA159的小RNA轉(zhuǎn)基因棉花，靶向沉默大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）中的毒力基因和菌絲生長(zhǎng)基因，提高了轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性。Matho等[11]構(gòu)建了表達(dá)病原菌CgCOM1基因siRNA的轉(zhuǎn)基因辣椒和番茄，其對(duì)炭疽病原菌分生孢子的萌發(fā)、胚管發(fā)育、菌絲形成和生長(zhǎng)有抑制作用，增強(qiáng)了茄科作物對(duì)炭疽病的抗性。

2.2 基于核轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因作物的瓶頸

雖然核轉(zhuǎn)基因技術(shù)在防治病蟲(chóng)害領(lǐng)域取得了顯著成果，但是傳統(tǒng)核轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)的dsRNA會(huì)進(jìn)入植物細(xì)胞質(zhì)，被植物自身的Dicer酶識(shí)別和剪切，導(dǎo)致dsRNA無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定積累，難以被加工成有效的siRNA，影響了對(duì)靶標(biāo)生物的RNAi效率和防控效果，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲(chóng)效果不明顯[12]。以葉綠體基因組作為遺傳操作平臺(tái)的葉綠體（質(zhì)體）基因工程技術(shù)克服了核轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的缺陷，拓寬了植物基因工程在防治病蟲(chóng)害領(lǐng)域的應(yīng)用[12-13]。

2.3 葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

植物細(xì)胞中質(zhì)體基因組的拷貝數(shù)可達(dá)1萬(wàn)，且缺乏RNAi機(jī)制，使得質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為表達(dá)dsRNA的理想工具[14]。近年來(lái)，相比于核轉(zhuǎn)基因技術(shù)，葉綠體基因工程的優(yōu)勢(shì)逐漸顯現(xiàn)，如減少了核轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響；在葉綠體中能穩(wěn)定積累dsRNA以避免進(jìn)入植物自身的RNAi系統(tǒng)等，這使得葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為植物基因工程的一個(gè)新研究熱點(diǎn)。Zhang等[15]報(bào)道了一種馬鈴薯質(zhì)體基因組表達(dá)dsACT的方法，可用于馬鈴薯甲蟲(chóng)（Leptinotarsa decemlineata）的防控。由于質(zhì)體中積累了豐富的dsRNA，且維持了dsRNA的完整性，使得質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)的RNAi效率比核轉(zhuǎn)基因技術(shù)更高。最近，Zhang等[16]報(bào)道了能夠表達(dá)dsRNA或發(fā)夾RNA（hpRNA）的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，用于防治茄二十八星瓢蟲(chóng)（Henosepilachna vigintioctopunctata）。與核轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，葉綠體介導(dǎo)的RNAi不會(huì)影響轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片的正常發(fā)育和形貌，且在害蟲(chóng)取食葉片后，幼蟲(chóng)的死亡率更高，有效減少了茄二十八星瓢蟲(chóng)對(duì)茄科作物的危害。在另一項(xiàng)報(bào)道中，Wu等[17]分別通過(guò)核轉(zhuǎn)基因技術(shù)和葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育了表達(dá)西花薊馬（Frankliniella occidentalis）β-actin、Tubulin、V-ATPase和Snf7基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)現(xiàn)利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的dsRNA表達(dá)量比核轉(zhuǎn)基因技術(shù)更多，提高了西花薊馬的致死率，為植物提供了更有效的保護(hù)，但基于葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)西花薊馬[17]、桃蚜（Myzus persicae）和煙粉虱（Bemisia tabaci）等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治效率并不相同[18]，可能與不同物種間的攝食習(xí)慣以及對(duì)RNAi的敏感程度存在差異有關(guān)。目前，葉綠體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)在防治植物病害方面的研究較少，但有一些基于葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)抗菌蛋白，用于提高植物抗病性的研究，如Degray等[19]報(bào)道了一種表達(dá)抗菌肽的轉(zhuǎn)基因煙草，其葉片及葉片提取物均對(duì)真菌的生長(zhǎng)和發(fā)育有抑制作用。

3 利用VIGS策略防控病蟲(chóng)害

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，利用VIGS策略不僅能夠改善農(nóng)藝性狀，還能防治病蟲(chóng)害，為作物提供保護(hù)。病毒是VIGS策略中的主要載體，由于病毒獨(dú)特的侵染機(jī)制，能有效幫助dsRNA逃脫生物體的物理和生理屏障，在寄主體內(nèi)實(shí)現(xiàn)dsRNA的高效遞送[20]。例如，Taning等[21]對(duì)昆蟲(chóng)單鏈RNA病毒進(jìn)行修飾，用于表達(dá)黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）特異性的dsRNA，從而促進(jìn)了昆蟲(chóng)吸收dsRNA的能力。此外，利用微生物表達(dá)和遞送dsRNA的方法也被歸屬于VIGS策略。例如，采用能產(chǎn)生dsRNA的大腸桿菌（Escherichia coli）喂養(yǎng)昆蟲(chóng)，不僅可以避免dsRNA被昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)中的酶降解，還能實(shí)現(xiàn)dsRNA的可持續(xù)供應(yīng)[22]。此外，利用共生菌產(chǎn)生害蟲(chóng)特異性的dsRNA，是一種無(wú)創(chuàng)傷遞送dsRNA的方法，適用于多種靶標(biāo)害蟲(chóng)[23]。當(dāng)靶標(biāo)害蟲(chóng)攝入共生細(xì)菌后，細(xì)菌能在害蟲(chóng)體內(nèi)持續(xù)增殖，保障充足的dsRNA，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)的基因沉默[24]。在植物病害防治應(yīng)用中，Islam等[25]報(bào)道了一種基于微細(xì)胞遞送的dsRNA策略，用于防治灰霉病。由微細(xì)胞同時(shí)遞送多個(gè)dsRNA比單一dsRNA的RNAi效率更高，對(duì)灰葡萄孢的生長(zhǎng)具有更高的抑制活性，但利用病毒或微生物作為表達(dá)和遞送的載體，在實(shí)際應(yīng)用中存在傳播病原物的風(fēng)險(xiǎn)。

4 利用SIGS策略防控病蟲(chóng)害

研究人員對(duì)噴灑型RNA農(nóng)藥防治農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害進(jìn)行了廣泛的試驗(yàn)，證明SIGS是一種具有潛力的非轉(zhuǎn)基因RNAi策略[3]。SIGS策略比HIGS策略在病蟲(chóng)害防治中具有更廣闊的應(yīng)用前景。例如，噴灑型的RNA農(nóng)藥研發(fā)成本低，周期較短，應(yīng)用場(chǎng)景多且無(wú)需面臨嚴(yán)格的市場(chǎng)監(jiān)管和登記審查。當(dāng)dsRNA能夠廉價(jià)、大規(guī)模地生產(chǎn)時(shí)，噴灑型RNA農(nóng)藥將是防治病蟲(chóng)害的理想藥劑。例如，Chakraborty等[26]將針對(duì)煙粉虱h(huán)sp70基因的dsRNA藥劑直接噴灑于辣椒植株上，煙粉虱取食后死亡率為67.7%，成功誘導(dǎo)了煙粉虱中靶基因的沉默，且減少了蟲(chóng)體內(nèi)病毒的數(shù)量，從而使病毒病在辣椒植株中的傳播效率降低了75%。針對(duì)另一種傳播病原微生物的害蟲(chóng)，Killiny等[27]在體外直接噴灑靶向柑橘木虱（Diaphorina citri）抗性代謝基因（p450）的dsRNA。該dsRNA藥劑能穿透害蟲(chóng)的角質(zhì)層并成功誘導(dǎo)RNAi，提升了害蟲(chóng)對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)藥劑的敏感水平。在植物病害防治領(lǐng)域，Wang等[28]直接在水果、蔬菜和花卉葉面噴灑靶向灰葡萄孢（Botrytis cinerea）DCL1和DCL2基因的dsRNA，成功誘導(dǎo)了灰葡萄孢中靶基因的沉默，有效抑制了灰葡萄孢的生長(zhǎng)和分生孢子的形成，提升了采后果蔬對(duì)灰葡萄孢的抗性。Duanis-Assaf等[29]以灰葡萄孢的菌膜合成基因?yàn)榘袠?biāo)，合成了噴灑型dsERG1、dsERG11和dsERG13藥劑，顯著抑制了果蔬表面灰葡萄孢分生孢子的萌發(fā)和胚管的伸長(zhǎng)。在對(duì)另一種氣傳病害的防治中，Sarkar等[30]將針對(duì)稻瘟病原的dsMoDES1藥劑直接噴灑于植物表面，病原菌的靶基因表達(dá)量降低了35%，減少了葉片表面病原菌的豐度，抑制了病原菌的生長(zhǎng)和分生孢子的形成。

5 利用NDGS策略防控病蟲(chóng)害

5.1 創(chuàng)制噴灑型RNA農(nóng)藥的瓶頸

噴灑型RNA農(nóng)藥在植物表面能直接被昆蟲(chóng)或病原微生物吸收，誘導(dǎo)有害生物靶標(biāo)基因的沉默。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，噴灑型RNA農(nóng)藥受諸多環(huán)境因素限制。有研究報(bào)道，直接噴施的dsRNA暴露于空氣中會(huì)被核酸酶和紫外線(xiàn)降解[3]，而在自然環(huán)境中，雨水沖刷和氣流變化會(huì)直接影響植物葉面dsRNA的積累量，導(dǎo)致無(wú)法觸發(fā)有效的RNAi反應(yīng)。昆蟲(chóng)或病原微生物內(nèi)部的核酸酶和pH環(huán)境都會(huì)影響dsRNA的穩(wěn)定性[12]，嚴(yán)重影響了RNA農(nóng)藥在有害生物體內(nèi)的干擾效率。此外，昆蟲(chóng)的體壁和微生物的細(xì)胞壁是阻礙dsRNA攝入的主要物理屏障，降低了噴灑型RNA農(nóng)藥的遞送效率。Qiao等[31]發(fā)現(xiàn)多種致病性病原菌對(duì)dsRNA的攝取效率不同，導(dǎo)致不同病原菌對(duì)RNAi的敏感性存在差異。例如，疫霉吸收dsRNA的能力非常有限，炭疽菌則不能直接吸收dsRNA，而有益真菌綠色木霉吸收dsRNA的能力較弱。因此，研發(fā)納米載體保護(hù)和遞送dsRNA來(lái)克服噴灑型RNA農(nóng)藥應(yīng)用瓶頸已成為前沿?zé)狳c(diǎn)。

5.2 納米載體對(duì)dsRNA的保護(hù)

由于dsRNA被植物吸收不是一個(gè)瞬時(shí)的過(guò)程，有延遲效應(yīng)，噴灑型RNA農(nóng)藥在田間的應(yīng)用效率與dsRNA在環(huán)境中的穩(wěn)定性密切相關(guān)。高效的RNAi依賴(lài)于充足的dsRNA，但實(shí)際應(yīng)用中諸多因素會(huì)影響dsRNA在植物表面的積累。基于納米載體的遞送策略能高效保護(hù)dsRNA，提升dsRNA在工作環(huán)境下的穩(wěn)定性。納米載體不僅能增加dsRNA在葉面的滯留量，減少因噴霧飄移而造成的損失[3]，還能保護(hù)dsRNA免受核酸酶降解和生物體內(nèi)pH微環(huán)境的影響，提高dsRNA在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性[32]。有研究報(bào)道以生物黏土作為dsRNA的遞送載體，發(fā)現(xiàn)其能夠減少dsRNA因沖淋而產(chǎn)生的流失，提升了RNAi效率，延長(zhǎng)了植物對(duì)病毒病的抗性周期[33]。在另一項(xiàng)報(bào)道中，陽(yáng)離子聚合物作為dsRNA的遞送載體，在昆蟲(chóng)高堿性的腸道環(huán)境中為dsRNA提供了保護(hù)，提升了甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的RNAi效率[34]。

5.3 納米載體對(duì)dsRNA的遞送

基于納米載體的遞送策略還能有效促進(jìn)dsRNA在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散、攝取和內(nèi)體逃逸，通過(guò)上調(diào)一些與攝取機(jī)制相關(guān)的基因，激活網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，提升dsRNA的遞送效率[35-36]。在細(xì)胞攝取納米R(shí)NA復(fù)合物后，有些帶胺基的納米載體在細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境中會(huì)出現(xiàn)質(zhì)子化效應(yīng)，誘發(fā)溶酶體逃逸，釋放dsRNA或siRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，大幅度提升RNAi的遞送效率[36]。例如，Zheng等[37]報(bào)道了一種含有表面活性劑、陽(yáng)離子型納米載體和dsRNA的混合制劑，該制劑可以快速穿透蚜蟲(chóng)體壁進(jìn)入血腔，有效提升了dsRNA的遞送效率，導(dǎo)致蚜蟲(chóng)靶基因的表達(dá)量下降了95%。此外，這種納米載體還能穿透植物表皮屏障，將外源dsRNA送入植物體內(nèi)，提升了dsRNA進(jìn)入植物細(xì)胞的能力。Yang等[38]報(bào)道了納米載體遞送的miRNA可被擬南芥和玉米高效吸收，在植物根系和莖段中均能夠檢測(cè)到大量的miRNA存在，比單一的dsRNA進(jìn)入植物內(nèi)部的效率更高。油菜的葉片也能吸收葉片正面噴灑的dsRNA，從而對(duì)葉片背面的蚜蟲(chóng)產(chǎn)生胃毒效果[39]。

6 RNA農(nóng)藥應(yīng)用實(shí)例

6.1 轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)RNAi的應(yīng)用實(shí)例

基于轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)在防治病蟲(chóng)害領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。Baum等[40]通過(guò)轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgifera）的dsV-ATPaseA基因，誘導(dǎo)蟲(chóng)體內(nèi)靶基因沉默，導(dǎo)致幼蟲(chóng)出現(xiàn)死亡和發(fā)育遲緩的現(xiàn)象。在一些包含田間試驗(yàn)的科研型案例中，基于轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)用于防治病蟲(chóng)害展現(xiàn)出良好的商業(yè)化前景。例如，Liang等[41]報(bào)道了一種表達(dá)綠盲蝽（Apolygus lucorum）致死基因（LIM）dsRNA的轉(zhuǎn)基因棉花植株。在田間試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因棉花的葉片受損面積比正常植株減少了46%～53%，轉(zhuǎn)基因棉花的單鈴重量較正常植株增大了48%，有效減少了綠盲蝽對(duì)棉花產(chǎn)量和質(zhì)量的損害。Mao等[42]用轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草表達(dá)棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的CYP6AE14基因dsRNA，誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的基因沉默，導(dǎo)致幼蟲(chóng)生長(zhǎng)遲緩，降低了幼蟲(chóng)對(duì)棉酚的耐受能力，提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)棉鈴蟲(chóng)的抗性，為田間治理棉鈴蟲(chóng)提供了可行策略。此外，在防治植物病害的應(yīng)用方面，Zhang等[43]報(bào)道了一種表達(dá)大麗輪枝菌疏水蛋白vdH1基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因棉花，并在田間得到成功應(yīng)用。由于轉(zhuǎn)基因棉花表達(dá)真菌vdH1基因的dsRNA能夠成功運(yùn)輸?shù)秸婢?xì)胞中，并誘導(dǎo)病菌的基因沉默，阻礙了病原菌微菌核的形成，有效提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)大麗輪枝菌的抗性。拜耳、先正達(dá)等國(guó)際農(nóng)藥公司投入大量的人力和財(cái)力，并掀起了研發(fā)和商品化轉(zhuǎn)基因植物的熱潮。目前，拜耳公司在轉(zhuǎn)基因玉米方面的研發(fā)已取得了顯著成果，并基本投入商業(yè)化生產(chǎn)[44]。

6.2 非轉(zhuǎn)基因形式RNA農(nóng)藥的應(yīng)用實(shí)例

目前，非轉(zhuǎn)基因形式RNA農(nóng)藥在田間的有效性得到了越來(lái)越多的驗(yàn)證，但非轉(zhuǎn)基因形式的RNA農(nóng)藥在田間應(yīng)用案例較少，主要的障礙可能是生產(chǎn)dsRNA的成本高昂。dsRNA制劑易應(yīng)用于甲蟲(chóng)類(lèi)害蟲(chóng)。例如，Petek等[45]報(bào)道了在田間噴施dsRNA藥劑以防治馬鈴薯甲蟲(chóng)。在噴藥初期，dsRNA藥劑對(duì)害蟲(chóng)的防治效果為32%，不如化學(xué)藥劑的防治效果，但在施藥7 d后，dsRNA制劑的防治效果與市售殺蟲(chóng)劑類(lèi)似，達(dá)到了84%～95%[45]。在對(duì)另一種甲蟲(chóng)的防治研究中，Chen等[46]在田間噴灑了6種用細(xì)菌表達(dá)的dsRNA藥劑，在施藥8 d內(nèi)，茄二十八星瓢蟲(chóng)的死亡率達(dá)到100%，在施藥后的10 d內(nèi)茄二十八星瓢蟲(chóng)的平均死亡率仍大于90%，且對(duì)天敵龜紋瓢蟲(chóng)（Propylea japonica）幾乎沒(méi)有負(fù)面影響。在田間噴灑RNA農(nóng)藥防治其他害蟲(chóng)，如鱗翅目和半翅目害蟲(chóng)的效果似乎不如甲蟲(chóng)類(lèi)，部分原因在于甲蟲(chóng)類(lèi)具有較少的降解酶且dsRNA不易被溶酶體消化，因而適合用于RNAi[12]。Ma等[39]報(bào)道了一種大腸桿菌表達(dá)雙基因（ATP-d和ATP-G）dsRNA的藥劑，在溫室中對(duì)蚜蟲(chóng)的防效達(dá)60%。2019年，拜耳公司申請(qǐng)了噴灑型dsRNA用于防治蜜蜂狄斯瓦螨（Varroa destructor）的產(chǎn)品登記。2022年，美國(guó)Greenlight Biosciences公司宣布申請(qǐng)登記了一種用于防治馬鈴薯甲蟲(chóng)的噴灑型dsRNA制劑。在防治植物病害方面，該公司宣布正在積極研發(fā)基于RNAi策略防治白粉病和灰霉病的噴霧型產(chǎn)品，預(yù)計(jì)于2025年獲得批準(zhǔn)上市。硅羿科技有限公司研發(fā)的煙草花葉病毒核酸干擾素目前已經(jīng)完成登記測(cè)試，這種干擾素能夠有效減少病毒病對(duì)煙草或其他茄科植物造成的經(jīng)濟(jì)損失。

7 展望

7.1 靶基因的篩選

靶基因篩選是影響RNAi效率的關(guān)鍵因素之一。理想的靶基因應(yīng)該具備高致死和低劑量敏感等特點(diǎn)。若單個(gè)靶基因效果不好，可以2個(gè)或多個(gè)靶基因同時(shí)干擾，從而提升有害生物的死亡率[47]。靶基因的篩選和挖掘是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，需要更多的研發(fā)投入。

7.2 低成本dsRNA的研發(fā)與工藝優(yōu)化

基于RNAi技術(shù)防治病蟲(chóng)害的商業(yè)化案例有限，很大程度上受限于dsRNA的研發(fā)成本和復(fù)雜的工藝。目前，無(wú)論是在體內(nèi)或體外合成dsRNA，主要是依賴(lài)噬菌體的T7序列和RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄獲得特異性序列[48]。在植物基因工程中，培育表達(dá)靶標(biāo)生物dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物耗時(shí)長(zhǎng)、步驟復(fù)雜、效率低且成本高昂。在噴灑型RNA農(nóng)藥的研發(fā)中，如果采用商業(yè)化試劑盒合成所需的dsRNA，步驟雖然相對(duì)簡(jiǎn)單，但試劑成本高昂，生產(chǎn)規(guī)模小，且容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致dsRNA質(zhì)量不佳。大腸桿菌或酵母表達(dá)體系是dsRNA低成本大批量合成的最常用工具。例如，Ma等[49]報(bào)道了一種用于大量表達(dá)dsRNA的工程菌。較目前市面上廣泛使用的L4440-HT115（DE3）系統(tǒng)，新表達(dá)體系的dsRNA產(chǎn)率可提升3倍。美國(guó)Greenlight Biosciences公司建立了以釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)dsRNA的平臺(tái)，通過(guò)在酵母中表達(dá)dsRNA用于害蟲(chóng)治理。該公司還開(kāi)發(fā)了成本為0.5美元/g的dsRNA產(chǎn)品用于抗病或殺蟲(chóng)，適合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。此外，利用微生物產(chǎn)生特異性的dsRNA以誘導(dǎo)靶標(biāo)生物的RNAi，在防治病蟲(chóng)害方面具有良好的應(yīng)用前景。由于真菌、病毒或細(xì)菌的修飾相對(duì)容易，且能持續(xù)產(chǎn)生dsRNA，因而在基因遞送和蛋白質(zhì)表達(dá)方面都有應(yīng)用[44,50]。由于納米材料載體對(duì)RNA制劑的高效保護(hù)和遞送作用，低成本環(huán)保型納米載體的需求無(wú)疑會(huì)越來(lái)越大。目前，我國(guó)科研界使用較多的星形陽(yáng)離子聚合物納米載體（SPc）的生產(chǎn)成本約為1.3美元/g，當(dāng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)后，能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本[32]。

7.3 基于遞送策略的安全性

目前，基于納米載體、菌液或病毒的遞送策略已被證實(shí)能有效提高dsRNA的遞送效率并為其提供保護(hù)。其中，納米材料作為遞送載體的生物安全性一直備受關(guān)注，即納米材料的降解問(wèn)題、在環(huán)境中的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性[51]。Dong等[52]評(píng)估了星型陽(yáng)離子納米載體（SPc）對(duì)天敵昆蟲(chóng)的生物毒性。正常田間使用濃度無(wú)不良副作用，只有在極高濃度下，雖然不會(huì)影響異色瓢蟲(chóng)（Harmonia axyridis）卵的孵化率，但會(huì)降低多種膜蛋白和溶酶體基因的表達(dá)量，損傷昆蟲(chóng)的腸道組織，導(dǎo)致幼蟲(chóng)死亡。另外，Yan等[53]利用黑腹果蠅作為模式昆蟲(chóng)，評(píng)估了作為dsRNA的遞送載體SPc對(duì)幼蟲(chóng)生活性狀的影響。該研究發(fā)現(xiàn)，只有極高濃度（1 g/L）的SPc才會(huì)對(duì)果蠅的壽命、生育能力、攀爬能力以及抗逆性產(chǎn)生不利的影響，長(zhǎng)期飼喂SPc則會(huì)積累在果蠅腸道組織中，并引起全身性變化。這些工作為評(píng)估納米材料的生物安全性提供了方法和參考。另外，基于微生物系統(tǒng)的遞送平臺(tái)在環(huán)境中傳播也可能會(huì)對(duì)人產(chǎn)生潛在的威脅。

7.4 基于4種策略的應(yīng)用前景

7.4.1 HIGS策略

生物技術(shù)的快速發(fā)展使得培育抗蟲(chóng)或抗病轉(zhuǎn)基因作物的方法越來(lái)越豐富，尤其是質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)在防治病蟲(chóng)害領(lǐng)域的應(yīng)用。有研究報(bào)道，質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)表達(dá)多基因組元件，可同時(shí)賦予轉(zhuǎn)基因植物對(duì)蟲(chóng)害、病害和非生物脅迫條件的抗性[54]。雖然在一些單子葉植物中，由于缺乏葉片的再生體系，質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)無(wú)法利用多次再生培養(yǎng)和篩選來(lái)獲得轉(zhuǎn)化植株，但該技術(shù)符合植物基因工程未來(lái)的發(fā)展方向，即安全、穩(wěn)定和高效地表達(dá)有害生物的靶標(biāo)基因dsRNA，因而將廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

7.4.2 VIGS策略

在農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理方面，以病毒或微生物作為dsRNA的載體用于觸發(fā)靶標(biāo)生物RNAi的策略具有應(yīng)用潛力。未來(lái)，將病毒或微生物作為dsRNA的高效遞送載體，還需要開(kāi)發(fā)導(dǎo)入產(chǎn)生特異性dsRNA所需模板的有效方法[44]，為大規(guī)模創(chuàng)制施用藥劑奠定基礎(chǔ)。另外，病毒或微生物在田間大規(guī)模施用之前，亟需解決的是在環(huán)境中釋放病毒或微生物所引起的潛在問(wèn)題。

7.4.3 SIGS策略

近年來(lái)，噴灑型RNA農(nóng)藥在病蟲(chóng)害防治領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，研發(fā)噴灑型RNA農(nóng)藥所需的時(shí)間比培育轉(zhuǎn)基因植物短，噴灑型RNA農(nóng)藥能夠相對(duì)快速地應(yīng)對(duì)新環(huán)境和新入侵的病蟲(chóng)害，從而實(shí)現(xiàn)病蟲(chóng)害的應(yīng)急管理。雖然，噴灑型RNA農(nóng)藥在田間大規(guī)模應(yīng)用之前還需要克服諸多瓶頸限制，但目前已有基于載體或其他保護(hù)劑的遞送系統(tǒng)用于提升dsRNA的穩(wěn)定性和遞送效率，從而實(shí)現(xiàn)噴灑型RNA農(nóng)藥對(duì)病蟲(chóng)害的高效治理。

7.4.4 NDGS策略

利用納米載體來(lái)保護(hù)和遞送RNA農(nóng)藥快速進(jìn)入植物和害蟲(chóng)體內(nèi)無(wú)疑具備廣闊的發(fā)展前景。此外，可通過(guò)研發(fā)多元化的RNA制劑解決RNA農(nóng)藥田間防效不理想的困境。Yan等[55]提出了一種利用納米載體同時(shí)遞送藥劑和靶向害蟲(chóng)藥劑敏感基因或抗藥基因的RNA農(nóng)藥新策略。Li等[56]采用納米載體同時(shí)遞送苦參堿和靶向桃蚜的dsRNA。納米載體通過(guò)內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)結(jié)合苦參堿，同時(shí)借助外部基團(tuán)的電荷作用及氫鍵作用進(jìn)一步結(jié)合dsRNA，通過(guò)RNAi引起桃蚜細(xì)菌性感染，防效可提升至90%，與化學(xué)農(nóng)藥的防效相當(dāng)。這種利用納米載體同時(shí)裝載dsRNA和藥劑的新思路可以治理害蟲(chóng)的抗藥性、大幅度提升害蟲(chóng)的防治效果。Wei等[57]利用納米載體遞送棉蚜CYP6CY3基因的dsRNA，干擾了棉蚜的解毒基因，使得抗性蚜蟲(chóng)恢復(fù)了對(duì)吡蟲(chóng)啉的敏感性，致死率從40%上升到80%。Qu等[58]報(bào)道了一種基于納米載體同時(shí)遞送dsRNA和噻蟲(chóng)嗪的復(fù)合藥劑。干擾蚜蟲(chóng)對(duì)噻蟲(chóng)嗪應(yīng)急響應(yīng)基因synapsin之后，半數(shù)致死劑量條件下的噻蟲(chóng)嗪對(duì)蚜蟲(chóng)的致死率上升至100%，低劑量噻蟲(chóng)嗪對(duì)蚜蟲(chóng)的致死率也能達(dá)到90%。未來(lái)，還應(yīng)該進(jìn)一步設(shè)計(jì)智能響應(yīng)型納米載體（機(jī)器人），實(shí)現(xiàn)多功能、精準(zhǔn)靶向和可控遞送，不斷提升RNA農(nóng)藥的田間效果，使其接近或達(dá)到化學(xué)農(nóng)藥的防治效果。