海南羅勒精油成分及其抗氧化作用評(píng)價(jià)

周 欣 宋 寧 弓 寶 林 景▲

1.海南省第五人民醫(yī)院制劑科，海南?？?570206；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450046；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所（海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室），海南?？?570311

羅勒為熱帶、亞熱帶草本植物，其來(lái)源于唇形科羅勒屬植物羅勒（Ocimnm basilicum L.），又名九層塔、蘭香、香草等，目前在我國(guó)華南、華東等多省區(qū)均有分布[1]。在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，羅勒常用于治療胃腸不適、外感風(fēng)寒、中暑、跌打損傷以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥[2]；而東南亞國(guó)家如泰國(guó)、越南等在食品加工、餐飲等行業(yè)常將羅勒作為香辛調(diào)料使用。羅勒的莖、葉富含特殊氣味的芳香精油，這既是羅勒的主要化學(xué)成分，也是其發(fā)揮功效的主要內(nèi)在活性物質(zhì)。種植企業(yè)對(duì)羅勒的栽培均旨在提高其精油成分含量方面，并通過(guò)精油單體分離生產(chǎn)出供藥用或調(diào)香用的原料[3]。近年來(lái)羅勒在我國(guó)規(guī)?；耘喾N植面積增加，栽培的品種主要為5個(gè)種和3個(gè)變種，而不同來(lái)源的羅勒品種其化學(xué)成分及生物活性相差較大[4]。海南地處亞熱帶和熱帶交接處，其獨(dú)特的氣候區(qū)域，使本地產(chǎn)的羅勒與其他省份所產(chǎn)的羅勒品種有所區(qū)別[5]，目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)海南羅勒的化學(xué)成分及生物活性進(jìn)行報(bào)道。

本研究利用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的海南羅勒精油進(jìn)行成分分析，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)測(cè)，以期為海南羅勒的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

樣品于2021年6月采集于海南萬(wàn)寧興隆南藥園內(nèi)的羅勒地上部分，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所王德立研究員鑒定為唇形科羅勒屬植物Ocimum basilicum L.，采收后放置通風(fēng)陰涼干燥處待用；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-7890A，MS-5975C-MSD，美國(guó)安捷倫公司），HP-5MS色譜柱（5%Benzomethylsiloxane，30 m×0.25 mm×0.25μm）；揮發(fā)油提取裝置；96孔板（Gracia Chemical Technology Co.Ltd）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；分析天平（Mettler-Toledo Instruments，Ltd）；移液器（20 μl，200 μl，DRAGON-MED）；乙醚（Diethyl）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、無(wú)水乙醇（Ethanol）、無(wú)水硫酸鈉（Sodium Sulfate）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、氯化鐵（Ferric Chloride）均為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

2 方法

2.1 海南羅勒精油GC-MS分析

2.1.1 海南羅勒精油提取制備 參照賈小麗等[6]水蒸氣蒸餾提取羅勒精油的方法進(jìn)行樣品的提取。將陰干后的海南羅勒全草粉碎成粗粉，稱取100 g置入圓底燒瓶中，使用揮發(fā)油提取裝置，采用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行精油提取和收集，油水混合液使用乙醚萃取后用無(wú)水Na2SO4干燥，然后揮干乙醚，獲得可流動(dòng)的淡黃色精油0.2%（g/g）。

2.1.2 儀器分析條件 參考文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，對(duì)氣相色譜儀進(jìn)行分析條件的設(shè)置，從50℃開(kāi)始升溫，以每分鐘2℃速率升溫至180℃，再以每分鐘5℃升溫至280℃；選用氦氣作為載氣；色譜柱的流量為每分鐘1.0 ml，進(jìn)樣口溫度為250℃；分流比為100∶1。EI源：電離電壓為70 eV的，離子源溫度為230℃，掃描范圍：50～ 500 amu；進(jìn)樣量為 1.0 μl，按照上述分析條件進(jìn)行分析鑒定，應(yīng)用NIST譜庫(kù)檢索和質(zhì)譜分析相結(jié)合的方法進(jìn)行化學(xué)成分的確認(rèn)，同時(shí)使用面積歸一化法對(duì)各組分的相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算。

2.2 海南羅勒精油的抗氧化作用評(píng)價(jià)

2.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 TPTZ工作液配制[9-10]：按照10∶1∶1的比例，將pH為3.6的醋酸鈉緩沖溶液（3 μmol/L）、TPTZ（10 mmol/L）、氯化鐵溶液（20 mmol/L）新鮮配制后，混合均勻。自由基清除率的測(cè)定：取100 μl DPPH的乙醇稀釋液（6.5×10-5mol/L）置于96孔板中，同時(shí)加入10 μl精油，混勻后，設(shè)定在517 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次計(jì)算平均吸收值，并按照下列公式計(jì)算：

式中：A0為DPPH溶液100 μl+蒸餾水10 μl的吸光度；A1為 DPPH 液 100 μl+10 μl精油的吸光度；A2為10 μl精油+100 μl無(wú)水乙醇的吸光度。

2.2.2 評(píng)價(jià)海南羅勒精油抗氧化能力 在96孔板中加入10 μl海南羅勒精油，同時(shí)加入TPTZ工作液150 μl，混勻后，在538 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以FeSO4為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以其濃度為橫坐標(biāo)，紫外吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出回歸方程。將海南羅勒油的抗氧化能力以換算的FRAP值表示，以1 FRAP單位與1 μmol/L FeSO4的抗氧化能力相對(duì)等，即單位體積下海南羅勒精油的抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的物質(zhì)的量（μmol/L）。

3 結(jié)果

3.1 海南羅勒揮發(fā)油中的成分分析

結(jié)果共鑒定出化學(xué)成分27種，其中萜烯類成分占海南羅勒精油總量的78.24%。具體成分及相對(duì)含量見(jiàn)表1。

表1 海南羅勒精油中主要成分及相對(duì)含量

3.2 海南羅勒精油抗氧化能力評(píng)價(jià)

以FeSO4為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以其濃度為橫坐標(biāo)，紫外吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)計(jì)算得出回歸方程如下：y=0.0022x+0.4545，相關(guān)系數(shù)R2=0.9987，見(jiàn)圖 1。

圖1 以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

海南羅勒精油對(duì)DPPH自由基的清除能力及抗氧化能力測(cè)定見(jiàn)圖2～3。從圖2結(jié)果可以看出，海南羅勒精油對(duì)DPPH自由基的清除隨著時(shí)間的推移而逐步增強(qiáng)，在50 min時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到59.10%，說(shuō)明海南羅勒精油可清除DPPH自由基且清除能力較好。從圖3結(jié)果可以得出，海南羅勒精油抗氧化能力較好，且其抗氧化能力隨著時(shí)間增加而增長(zhǎng)，至60 min時(shí)可達(dá)到313.50 μmol/L。

圖2 海南羅勒精油對(duì)DPPH自由基的清除能力（%）

圖3 海南羅勒精油的抗氧化能力（μmol/L）

4 討論

目前全世界羅勒屬植物有150余種[4]，常規(guī)種有疏柔毛羅勒、丁香羅勒、檸檬羅勒等。近年來(lái)隨著我國(guó)羅勒引種栽培面積的逐年增加，對(duì)羅勒揮發(fā)油的生物活性及臨床應(yīng)用研究逐漸受到了人們的關(guān)注。已有研究報(bào)道羅勒揮發(fā)油具有較好的抑菌、抗炎作用[4]，抗抑郁作用[11-12]，臨床可用于治療慢性腹瀉[13]、不孕癥[14]等，在我國(guó)維藥等少數(shù)民族醫(yī)學(xué)里，羅勒還被認(rèn)為具有降血糖、抗血栓、降血脂等作用[15]。

據(jù)報(bào)道，不同栽培種及變種的羅勒，其揮發(fā)油成分類別及含量有一定差異，而植物精油的化學(xué)成分和含量又與其生物活性關(guān)系密切[4]，如亳州疏毛羅勒揮發(fā)油中萜類物質(zhì)占60.61%，其對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌有很好的抑菌效果[16]；漳州產(chǎn)的甜羅勒以及云南產(chǎn)的甜羅勒揮發(fā)油中芳樟醇、丁香酚等含量均較高[8，17]，而甜羅勒對(duì)高血壓患者療效較好[18]；大型羅勒精油中香葉醛含量較高，能較好地清除自由基[19]；丁香羅勒揮發(fā)油中丁香酚含量較高，其在抗氧化性及抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌能力方面較強(qiáng)[11]。張帥等[20]對(duì)兩廣以及浙江等地的羅勒進(jìn)行了成分檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有成分中成分含量差異可達(dá)10倍以上，在抗抗菌活性方面也有很大的區(qū)別。

本研究采用傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾的方法對(duì)海南羅勒精油進(jìn)行提取，并對(duì)其進(jìn)行主要成分的分析和比對(duì)，共鑒定出27個(gè)化學(xué)成分，主要以萜烯類化學(xué)成分為主，相對(duì)含量較大的成分有反-3-苯基-2-丙烯酸甲酯（25.60%）、p-烯丙基茴香醚（23.43%）、β-芳樟醇（14.24%）等，這與文獻(xiàn)報(bào)道的其他區(qū)域羅勒精油成分有很大差異[21]。反-3-苯基-2-丙烯酸甲酯作為高級(jí)香料添加劑，在食品、日用化妝品等領(lǐng)域被廣泛使用，但其合成品存在合成效率低以及副反應(yīng)多等問(wèn)題[22-24]，因此是否能將海南羅勒作為其生產(chǎn)的原料來(lái)源值得深入探討。如今，尋找更安全、更有效的天然抗氧化產(chǎn)品是很多產(chǎn)業(yè)尤其是食品工業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)[24]，實(shí)驗(yàn)表明，海南羅勒精油具有較好的抗氧化活性，短時(shí)間內(nèi)清除自由基的能力可達(dá)到50%以上，因此海南羅勒具備作為新一代天然、安全抗氧化劑原料的開(kāi)發(fā)潛力。

本研究?jī)H對(duì)海南羅勒成分及清除自由基能力進(jìn)行了初步的分析和觀察，對(duì)海南羅勒的抗菌能力以及藥效活性成分分析等工作尚未完成，后期課題組將針對(duì)其藥效作用及物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行更深層次的探索。