柑橘大實蠅氣味結合蛋白BminOBP6與其氣味配體的互作機制

楊嶺，田曉麗，桂連友，王福蓮，張國輝

柑橘大實蠅氣味結合蛋白BminOBP6與其氣味配體的互作機制

楊嶺1，田曉麗2，桂連友1，王福蓮1，張國輝1

1長江大學農(nóng)學院，湖北荊州 434025；2長江大學生命科學學院，湖北荊州 434025

【】通過構建柑橘大實蠅（）BminOBP6的C末端截短突變體（TOBP6），比較野生型BminOBP6和突變體TOBP6對氣味配體的結合能力，檢測在不同pH條件下二者對氣味配體結合能力的差異，為揭示BminOBP6與配體的互作機制提供參考。【】通過在線工具SWISS MODEL對BminOBP6進行同源建模，根據(jù)構建的3D模型確定將被切除的BminOBP6第6個螺旋（6）之后的C末端序列；設計特異性引物擴增BminOBP6的C末端截短突變體（TOBP6）的編碼序列，即；構建重組表達載體pET32a/，將此重組載體與實驗室保存的重組載體pET32a/分別轉(zhuǎn)入原核細胞BL21（DE3）中，異源表達野生型BminOBP6及其突變體TOBP6；以1-NPN為熒光探針進行熒光競爭結合試驗，檢測BminOBP6和TOBP6在兩種pH環(huán)境（pH 7.4和pH 5.0）下對1-十一醇和(+)-檸檬烯的結合能力?！尽啃蛄斜葘Y果顯示，BminOBP6與致倦庫蚊（）CquiOBP1的序列具有很高的相似性，為62.6%，遠高于30%，因此選擇以CquiOBP1的3D結構作為BminOBP6同源建模模板。模型顯示BminOBP6的6之后是由8個氨基酸殘基（D117—P124）組成的C末端序列，即將被切除的C末端序列。在此基礎上設計引物克隆獲得了編碼TOBP6的cDNA序列，并構建了其重組表達載體pET32a/，該重組載體和pET-32a/重組載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞中進行了異源表達。熒光競爭結合試驗結果顯示，在pH為7.4時，BminOBP6與1-十一醇和(+)-檸檬烯具有很強的結合能力，ki值分別為6.89和9.50 μmol·L-1。當pH降至5.0時，BminOBP6卻喪失了對1-十一醇的結合能力，同時與(+)-檸檬烯的結合能力也大幅減弱，ki值從9.50 μmol·L-1升至31.26 μmol·L-1；而不論在何種pH條件下，TOBP6均喪失了對這兩種氣味配體的結合能力?！尽縫H在柑橘大實蠅 BminOBP6與其配體結合和釋放過程中發(fā)揮了重要作用，并且BminOBP6的C末端在配體的結合中起著關鍵作用。

柑橘大實蠅；氣味結合蛋白；同源建模；C末端；原核表達；熒光競爭結合

0 引言

【研究意義】柑橘大實蠅（）屬于雙翅目（Diptera）實蠅科（Tephritidae）[1]，是一種危害柑橘類果實的重要害蟲[2]。柑橘大實蠅主要以幼蟲鉆蛀危害果實，嚴重影響果品的產(chǎn)量和品質(zhì)。由于這種蟲害的隱蔽性，使得化學防治效果不佳，另外長期施用化學農(nóng)藥，容易造成害蟲抗藥性，同時農(nóng)藥的殘留也易引起環(huán)境問題[3-4]。利用昆蟲的嗅覺進行害蟲防治是一項高效、環(huán)保的技術。因此，針對柑橘大實蠅對氣味信息素的嗅覺識別機制，深入研究柑橘大實蠅氣味結合蛋白（odorant-binding protein，OBP）與其配體的互作機制，不僅有利于揭示柑橘大實蠅的嗅覺識別機制，而且可為研發(fā)針對柑橘大實蠅嗅覺的行為調(diào)控技術提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】多數(shù)昆蟲都具有敏感又精密的嗅覺系統(tǒng)，這一系統(tǒng)在昆蟲眾多的生命活動中發(fā)揮著重要作用，比如尋找寄主、交配、覓食、躲避天敵和尋找產(chǎn)卵地點等[5-6]。昆蟲對外界氣味信息素的識別是一個復雜的過程，涉及眾多蛋白，主要包括OBP、氣味受體（olfactory receptor，OR）、離子受體（inotropic receptor，IR）、感覺神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane protein，SNMP）和氣味降解酶（odorant degrading enzyme，ODE）[7-12]。OBP是一類小分子量、親水性分泌蛋白質(zhì)。它能夠識別、結合進入感受器內(nèi)的脂溶性氣味分子，并攜帶氣味分子穿過水性感器淋巴液，運輸至位于嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的OR，從而使化學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘朳7,13-14]。由此可見，OBP與氣味信息素的識別處于整個嗅覺信號轉(zhuǎn)導通路的最前端，理解OBP與氣味信息素的結合機制對于闡釋昆蟲整個嗅覺系統(tǒng)至關重要，因此，對昆蟲OBP的研究是目前該領域研究的熱點之一。大量實驗證據(jù)也表明OBP在昆蟲氣味識別過程中發(fā)揮著重要作用。例如，對cis-vaccenyl acetate（cVA）反應敏感的野生型果蠅（）中的氣味結合蛋白LUSH進行突變體試驗時，LUSH缺失突變體果蠅對cVA完全失去敏感性[15]。在岡比亞按蚊（）中，利用dsRNA使沉默，通過EAG檢測顯示，岡比亞按蚊對吲哚的反應幾乎消失[16]。同樣，沉默和的豌豆蚜（）失去了對其報警信息素()--farnesene（EBF）的感受能力[17]。盡管越來越多的研究證明了OBP在昆蟲嗅覺識別過程中的功能，然而有關昆蟲OBP與其氣味配體間的互作機制至今仍未有定論。起初，基于OBP分子晶體結構的研究，學者們提出了氣味分子與OBP相互作用的觀點[18-19]。經(jīng)典的OBP通常存在6個高度保守的半胱氨酸，它們兩兩形成的二硫鍵成為維持蛋白質(zhì)三級結構的重要部分。同時也經(jīng)過6個螺旋與眾多折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲一同形成復雜的空間結構，其中心一般為疏水性的結合腔，以便于配體的結合與運輸。例如，對家蠶（）BmorPBP1與蠶蛾醇結合復合體晶體結構的研究發(fā)現(xiàn)，BmorPBP1分子中的螺旋1、3、4、5和6圍成一個配體結合腔，配體蠶蛾醇就位于該結合腔內(nèi)[20]。而且發(fā)現(xiàn)BmorPBP1有一個長鏈的C末端，在pH=4.5時，長鏈C末端形成一個額外的螺旋占據(jù)結合腔排擠出配體，即“釋放”配體；而當pH=7.0時，此螺旋從結合腔中脫離，此時空置的結合腔用于結合配體[21]。這種OBP與配體的互作機制，在鱗翅目昆蟲中比較多見，例如舞毒蛾（）LdisPBP[22]、多音天蠶蛾（）ApolPBP[23-24]和臍橙螟（）AtraPBP1[25]。而其他目的昆蟲，雖然它們的OBP并非都具有如鱗翅目昆蟲般的長鏈C末端，但可能有著不同的結合與釋放配體的機制。例如，在雙翅目蚊科昆蟲中，其C末端更像一個蓋子，當配體進入結合腔后，C末端上的氨基酸殘基與OBP分子中第1個螺旋（1）和第3個螺旋（3）上的氨基酸殘基形成pH敏感的分子內(nèi)氫鍵，這樣C末端就被鎖定在結合腔的開口處，進而把配體關閉于結合腔內(nèi)。當環(huán)境pH降低時，氫鍵被破壞，蓋子打開，配體被釋放[26-28]。從以上兩種pH誘導的OBP與配體的互作模式來看，C末端在此過程中發(fā)揮了重要作用。因此學者們通過構建敲除C末端的OBP突變體，比較突變體與野生型OBP在結合氣味配體能力上的差異，但并未得到一致的結果。比如，當C末端被切除后，腰帶長體繭蜂（）McinOBP4和舞毒蛾LdisPBP2對其氣味配體的結合能力顯著下降[22,29]。但在BmorPBP[30]、AtralPBP[25]和棉鈴蟲（）HarmPBP1[31]中，C末端的切除并未影響這些OBP與其配體的結合能力，甚至升高。以上這些差異表明不同OBP與其配體的互作機制存在差異。【本研究切入點】實驗室前期研究結果表明，柑橘大實蠅BminOBP6對(+)-檸檬烯、1-十一醇有很強的結合能力[32]，但是有關BminOBP6與這些氣味配體的結合與釋放機制仍不清楚?！緮M解決的關鍵問題】通過構建柑橘大實蠅氣味結合蛋白BminOBP6的C末端截短突變體（TOBP6），比較野生型BminOBP6和突變體TOBP6對氣味配體的結合能力，同時檢測在不同pH條件下二者對配體結合能力差異，為揭示BminOBP6與配體的互作機制提供參考。

1 材料與方法

試驗于2021年10月至2022年11月在長江大學農(nóng)學院昆蟲生理生化實驗室完成。

1.1 供試昆蟲

供試柑橘大實蠅均來自長江大學農(nóng)學院昆蟲化學生態(tài)實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

TM（TMVersion 2.0）、DL2000 DNA Marker、H I、d III、T4 DNA Ligase均購自寶生物工程（大連）有限公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit，Omega；pGEM-T easy vector，Promega；Trans5感受態(tài)細胞、BL21（DE3）感受態(tài)細胞，北京全式金生物技術有限公司；T100TMPCR儀、Gel DocXR+凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機，寧波新芝；Ni-NTA His·Bind Resin純化樹脂，上海七海復泰生物科技有限公司；重組腸激酶（enterokinase），上海近岸科技有限公司；12.5% SDS-PAGE彩色凝膠快速配膠試劑盒（紅色），武漢普美克生物技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；F-7000熒光分光光度計，HITACHI。

1.3 BminOBP6的同源建模

使用SignalP5.0網(wǎng)站（https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5.0）預測BminOBP6信號肽序列。通過在線工具SWISS MODEL（https://swissmodel. expasy.org/）對BminOBP6進行同源建模。使用Pro-CHECK對BminOBP6的3D模型進行評估[33]。使用Chimera 1.13.1軟件對BminOBP6的3D模型進行必要的顏色修飾。

1.4 BminOBP6的C末端截短突變體（TOBP6）編碼序列的擴增

根據(jù)構建的BminOBP6的3D模型確定將被切除的BminOBP6第6個螺旋（6）之后的C末端序列，設計特異性引物TOBP6-EF（5′-CGCCAG GAACCGC-3′）和TOBP6-ER（5′- CCCTTA GGCCTTCTTCCAGC-3′）PCR擴增BminOBP6的C末端截短突變體（TOBP6）cDNA，引物序列中下劃線分別表示H I和d III酶切位點。

以實驗室已有pGEM-T easy/為模板擴增，PCR反應體系（25 μL）：pGEM-T easy/2 μL、TM（TMVersion 2.0）酶12.5 μL、上游引物TOBP6-EF 1 μL、下游引物TOBP6-ER 1 μL、ddH2O 8.5 μL。反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃25 s，34個循環(huán)；72℃延伸5 min；12℃ ∞。PCR產(chǎn)物使用1%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，Gel Extraction Kit（Omega）回收目的片段。將回收得到的目的片段連接pGEM-T easy vector后轉(zhuǎn)化Trans5感受態(tài)細胞中過夜培養(yǎng)，而后挑取單克隆菌落培養(yǎng)，進行菌液PCR（程序與前一致）驗證，將驗證正確的樣品送樣測序。引物合成及序列測定均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.5 TOBP6表達載體的構建

將測序正確的菌液擴大培養(yǎng)后用Plasmid Mini Kit（Omega）提取pGEM-T/質(zhì)粒。pGEM-T/和表達載體pET-32a（+）用限制性內(nèi)切酶H I和d III進行雙酶切，酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，膠回收產(chǎn)物使用T4 DNA Ligase加入Ligation Buffer進行連接，然后轉(zhuǎn)化至Trans5感受態(tài)細胞中過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落培養(yǎng)，進行菌液PCR（程序同前一致）驗證，將驗證正確的菌液送樣測序。取測序正確的菌株擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒pET-32a/，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）表達菌株中，培養(yǎng)過夜，挑選單克隆菌落培養(yǎng)并進行菌液PCR驗證。

1.6 BminOBP6和TOBP6的原核表達與蛋白純化

將實驗室保存的測序正確的pET32a/菌液與驗證正確的pET32a/表達菌株擴大培養(yǎng)后，以1﹕100的比例分別加入LB（含Amp 50 mg·mL-1）液體培養(yǎng)基中，在37℃，200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至OD600達到0.6，加入終濃度0.5 mmol·L-1IPTG繼續(xù)以37℃，200 r/min誘導表達6 h。誘導完成后以4℃，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，通過SDS-PAGE電泳檢測表達情況。用裂解緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol·L-1NaCl，0.5% TritonX-100，2 mg·mL-1溶菌酶）重懸菌體，對重懸菌液進行超聲破碎：超聲時間4 s、間隔時間5 s，總時間30 min。破碎完畢后以4℃，12 000 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀，通過SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達形式。使用Ni-NTA His·Bind Resin純化樹脂純化含有目的融合蛋白的溶液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒分別測定兩目的融合蛋白濃度，并在透析后利用重組腸激酶切除His-Tag獲得不含標簽的目的蛋白。

1.7 BminOBP6與TOBP6的熒光競爭結合試驗

競爭結合試驗在F-7000熒光分光光度計上進行：容器為1 cm寬的四通石英比色皿，分光光度計設置狹縫寬度10 nm，激發(fā)波長370 nm，發(fā)射光譜范圍為370—550 nm。使用色譜級甲醇（麥克林，≥99.9%）作為溶劑將熒光探針1-NPN（TCI，＞98.0%）、1-十一醇（TCI，＞99.0%）、(+)-檸檬烯（TCI，＞95.0%）均配置為100 mmol·L-1的母液，用封口膜封存于-20℃，使用時均稀釋為1 mmol·L-1的工作液。試驗開始前使用Tris-HCl（pH 7.4/5.0）緩沖液將蛋白稀釋至2 μmol·L-1的工作濃度。

在比色皿中加入pH 7.4/5.0的2 μmol·L-1蛋白溶液2 mL，隨后加入1 mmol·L-1的1-NPN使其終濃度依次為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 μmol·L-1，使其熒光強度達到飽和。每次加入1-NPN后使其反應1 min，再記錄熒光強度。每組試驗重復3次。比色皿用透析液洗凈。采用SigmaPlot 14.0軟件對1-NPN濃度與其對應的熒光最大值進行非線性回歸擬合分析，并用Scatchard法線性化曲線，計算蛋白與1-NPN的結合常數(shù)。

在競爭結合試驗中，向比色皿中加入pH 7.4/5.0的2 μmol·L-1蛋白溶液2 mL，隨后加入1-NPN使其終濃度為2 μmol·L-1，混勻后向溶液中加入氣味配體使其終濃度依次為0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、28、32、36、40 μmol·L-1，每次加入氣味配體后使其反應1 min，再記錄熒光強度。每組試驗重復3次。假設蛋白活性為100%，且在飽和狀態(tài)下配體與蛋白按照1﹕1的比例結合，根據(jù)公式Ki=IC50/[1+（1-NPN）/K1-NPN]計算解離常數(shù)，其中，IC50為熒光強度值下降至初始值50%時加入的氣味配體濃度，1-NPN為未結合的1-NPN的濃度，K1-NPN為蛋白/1-NPN的結合常數(shù)。

2 結果

2.1 BminOBP6同源建模以及TOBP6序列確認

通過SignalP 5.0結果可知，BminOBP6蛋白的N端存在信號肽部分，由第1—31位氨基酸組成，是分泌型蛋白。將BminOBP6除信號肽的氨基酸序列提交至SWISS MODEL進行同源序列搜索。結果表明，BminOBP6與致倦庫蚊（）CquiOBP1（PDB ID：3OGN）具有非常高的序列相似性，為62.6%（圖1-A）。同源建模要求目的蛋白的氨基酸序列須與模板蛋白的氨基酸序列相似性高于30%[34-35]。因此，CquiOBP1適合作為BminOBP6同源建模的模板序列。構建好的BminOBP6的3D模型經(jīng)Pro-CHECK檢測評估結果顯示（圖1-C），模建蛋白91.7%的殘基落在最佳區(qū)域（紅色區(qū)域A、B、L），8.3%的殘基落入許可區(qū)（棕色區(qū)域a、b、l、p），沒有殘基落在勉強許可區(qū)（亮黃色區(qū)域～a、～b、～l、～p），也沒有殘基落在不允許區(qū)（淺黃色區(qū)域）。落在最佳區(qū)域的殘基為91.7%，大于90%，說明BminOBP6模型屬于高質(zhì)量模型，可靠性高。

BminOBP6具備OBP家族的典型特征：具有6個保守的半胱氨酸殘基以及與之對應的二硫鍵。其最后一個螺旋6在第116號丙氨酸結束，從第117號天冬氨酸到124號脯氨酸形成了由8個氨基酸殘基組成的C末端序列（D117—P124），即將被切除的C末端序列（圖1-B）。圖1-D表示去除C末端序列（D117—P124）的TOBP6。在A116后插入一個終止子密碼子并移除之后由8個氨基酸殘基（D117—P124）組成的C末端，即TOBP6的氨基酸序列。

A：BminOBP6與模板蛋白CquiOBP1氨基酸序列同源性比對Sequence alignment between BminOBP6 and CquiOBP1；B：BminOBP6三維結構3D structure of BminOBP6；C：BminOBP6 Pro-CHECK質(zhì)量評估結果the result of Pro-CHECK quality assessment of 3D structure of BminOBP6；D：BminOBP6的C末端截短突變體（TOBP6）三維結構3D structure of BminOBP6 C terminus-truncated mutant (TOBP6)

2.2 TOBP6編碼序列的克隆

根據(jù)以上推導出的TOBP6氨基酸序列，結合由核苷酸推導的BminOBP6的氨基酸序列（圖2），獲得編碼TOBP6的cDNA序列，即圖2中綠色背景的核苷酸序列。以此為基礎設計TOBP6上游引物TOBP6-EF和下游引物TOBP6-ER，利用PCR擴增后獲得351 bp的特異性條帶，該基因片段符合預期結果。連接至pGEM-T easy載體與pET-32a（+）載體后得到的測序結果與理論序列一致（圖2）。編碼116個氨基酸，分子量為13 464.27 Da，等電點為5.26。

方框內(nèi)為起始密碼子；信號肽序列添加了下劃線；圓圈內(nèi)為6個保守的半胱氨酸；“*”表示終止密碼子；綠色背景為TOBP6的cDNA；“→”和“←”分別標記了TOBP6上游和下游引物設計位置The start codon is boxed; Signal peptide part is underlined; Conservative cysteine sites are circled; “*” stands for the stop codon; The green background represents cDNA of TOBP6; “→” and “←” mark positions of the upstream and downstream primers of TOBP6, respectively

2.3 BminOBP6與TOBP6的原核表達與蛋白純化

含有表達載體pET-32a/、pET-32a/的BL21（DE3）表達菌株分別經(jīng)IPTG誘導表達后，SDS-PAGE檢測結果顯示，表達出了目的融合蛋白并且均大量累積于包涵體中（圖3，A4、B4）。在包涵體中表達的蛋白往往沒有生物活性，因此對其中的融合蛋白按照已報道的研究進行了變性、復性處理[32]。復性后的目的融合蛋白利用Ni-NTA His·Bind Resin純

A：1：未經(jīng)誘導的pET-32a/BminOBP6表達產(chǎn)物Expression products of pET-32a/BminOBP6 without induction；2：經(jīng)誘導的pET-32a/BminOBP6表達產(chǎn)物Expression products of pET-32a/BminOBP6 with induction；3：BminOBP6上清The supernatant of BminOBP6；4：BminOBP6包涵體The inclusion body of BminOBP6；5：BminOBP6帶有His-Tag BminOBP6 with His-Tag；6：BminOBP6去除His-Tag BminOBP6 without His-Tag；M1：寶生物蛋白分子量標準TaKaRa protein molecular weight marker；M2：賽默飛預染蛋白分子量標準Thermo scientific pageruler prestained protein ladder。B：1：未經(jīng)誘導的pET-32a/TOBP6表達產(chǎn)物Expression products of pET-32a/TOBP6 without induction；2：經(jīng)誘導的pET-32a/TOBP6表達產(chǎn)物Expression products of pET-32a/TOBP6 with induction；3：TOBP6上清The supernatant of TOBP6；4：TOBP6包涵體The inclusion body of TOBP6；5：TOBP6帶有His-Tag TOBP6 with His-Tag；6：TOBP6去除His-Tag TOBP6 without His-Tag；M2：賽默飛預染蛋白分子量標準Thermo scientific pageruler prestained protein ladder

化樹脂進行純化。SDS-PAGE檢測結果顯示獲得了高純度的目的融合蛋白（圖3，A5、B5），其中橙色箭頭標示了pET-32a/BminOBP6融合蛋白，綠色箭頭標示了pET-32a/TOBP6融合蛋白。蛋白純化透析后用重組腸激酶切除His-Tag并再次純化，純化后蛋白與目的蛋白理論分子量BminOBP6：14 433.38 Da（圖3，A6）；TOBP6：13 464.27 Da（圖3，B6）相符。采用BCA蛋白濃度測定法測定純化后BminOBP6的蛋白濃度為0.24 mg·mL-1，TOBP6的蛋白濃度為0.265 mg·mL-1，蛋白純度與濃度均較高，可用于后續(xù)熒光競爭結合試驗。

2.4 BminOBP6與TOBP6的熒光競爭結合試驗

不同pH條件下，BminOBP6和TOBP6與熒光探針1-NPN的結合曲線及Scatchard方程如圖4，A1、B1、C1、D1，并計算得出它們與1-NPN的結合常數(shù)Kd：pH 7.4條件下BminOBP6與1-NPN的Kd=（5.60±0.33）μmol·L-1（圖4，A1）、TOBP6與1-NPN的Kd=（15.55±1.15）μmol·L-1（圖4，C1）；pH 5.0條件下BminOBP6與1-NPN的Kd=（14.68±1.08）μmol·L-1（圖4，B1）、TOBP6與1-NPN的Kd=（30.06±0.72）μmol·L-1（圖4，D1）。

A：pH 7.4條件下的BminOBP6 BminOBP6 at pH 7.4；B：pH 5.0條件下的BminOBP6 BminOBP6 at pH 5.0；C：pH 7.4條件下的TOBP6 TOBP6 at pH 7.4；D：pH 5.0條件下的TOBP6 TOBP6 at pH 5.0。1：與1-NPN的結合曲線及Scatchard方程Binding curves and Scatchard plots of protein and 1-NPN；2：與1-十一醇的競爭結合曲線Binding curves of protein to 1-undecanol；3：與(+)-檸檬烯的競爭結合曲線Binding curves of protein to (+)-limonene

不同pH條件下，BminOBP6和TOBP6與其配體1-十一醇和(+)-檸檬烯的熒光競爭試驗結果表明，在pH為7.4時，BminOBP6與1-十一醇和(+)-檸檬烯均表現(xiàn)出很強的結合能力，ki值分別為（6.89±0.20）和（9.50±0.45）μmol·L-1（圖4，A2、A3，表1）。當pH降至5.0時，BminOBP6卻喪失了對1-十一醇的結合能力，同時與(+)-檸檬烯的結合能力也大幅減弱，ki值從（9.50±0.45）μmol·L-1升至（31.26±1.06）μmol·L-1（圖4，B2、B3，表1）。而不論在何種pH條件下，TOBP6均喪失了對這兩種氣味配體的結合能力（圖4，C2、C3、D2和D3，表1）。

表1 BminOBP6和TOBP6與氣味配體的結合特性

表中數(shù)值均表示為平均值±標準誤；“-”表示不能計算出IC50值

The values in the table are showed as mean±SE; “-” indicates that the IC50value can’t be calculated

3 討論

3.1 pH對BminOBP6配體結合與釋放的影響

OBP在昆蟲外周嗅覺系統(tǒng)中的主要功能是結合、運輸脂溶性的氣味信息素穿過水性觸角淋巴液，將其運送至嗅覺神經(jīng)樹突膜表面的OR，進而激活OR[7]。大量的研究已表明，昆蟲OBP可以特異性結合其氣味信息素[15-17,36-37]。然而，這些OBP是如何釋放氣味配體激活OR？關于這個問題目前學界主流理論是一種依賴pH變化的氣味配體釋放機制。這種理論認為昆蟲的大部分感器淋巴液的pH接近中性，由于感覺神經(jīng)元膜上的帶負電荷的脂質(zhì)頭基，使得膜附近淋巴液的pH降低約2個pH單位[38-40]。這種pH的改變使得到達感覺神經(jīng)元膜附近的配體-OBP復合體中的OBP構象發(fā)現(xiàn)變化，從而釋放配體。目前已有許多實例證明了這一現(xiàn)象，比如，家蠶的氣味結合蛋白BmorPBP在中性pH條件下對蠶蛾醇具有很強的結合能力，當pH降低為酸性（pH=5.0）后，BmorPBP對蠶蛾醇親和性大幅下降[30]。類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在臍橙螟AtraPBP1[25]、多音天蠶蛾AploPBP[23-24]、舞毒蛾LdisPBP[22]、岡比亞按蚊AgamOBP1[26]、埃及伊蚊（）AaegOBP1[27]和致倦庫蚊CquiOBP1[28]中。但有些OBP則不遵守這種規(guī)則，pH的改變不會影響它們空間結構及其對配體的結合能力。例如，埃及伊蚊AaegOBP22[41]和岡比亞按蚊AgamOBP20[42]。本研究結果顯示，BminOBP6在接近中性pH（7.4）條件下對其氣味配體1-十一醇和(+)-檸檬烯表現(xiàn)出強結合能力。但在酸性pH（5.0）條件下，BminOBP6完全失去了對1-十一醇的結合能力，同時對(+)-檸檬烯的結合能力也極大地減弱（圖4、表1）。這表明BminOBP6釋放配體的機制也屬于pH誘導的配體釋放機制。

3.2 C末端對BminOBP6配體結合與釋放的影響

BminOBP6在酸性pH條件為什么能夠完成配體的釋放？這種配體釋放機制在柑橘大實蠅同目昆蟲蚊類中研究的最清楚。對AgamOBP1[26]、AaegOBP1[27]和CquiOBP1[28]的研究發(fā)現(xiàn)，當配體進入結合腔后，這些OBP的C末端氨基酸殘基與OBP其他部位的氨基酸殘基會形成pH敏感的分子內(nèi)氫鍵（比如在CquiOBP1中，C末端的V125與第1個螺旋的H23和第3個螺旋的Y54形成了4個分子內(nèi)氫鍵），這樣OBP C末端就被鎖定在結合腔的開口，此時的C末端像一個蓋子封在OBP結合腔的開口處，當環(huán)境pH降低時，那些對pH敏感的分子內(nèi)氫鍵被破壞，蓋子打開，配體被釋放。從同源建模的氨基酸序列及其二級結構比對情況（圖1）可以看出，BminOBP6的C末端與CquiOBP1的C末端高度相似，而且在BminOBP6第1個螺旋上同樣出現(xiàn)了組氨酸殘基H22（在CquiOBP1中是H23），在BminOBP6第3個螺旋上同樣出現(xiàn)了酪氨酸殘基Y53（在CquiOBP1中是Y54）。因此，BminOBP6很可能具有與CquiOBP1相似的配體釋放機制。

由以上這種pH誘導的配體釋放機制可以看出，OBP的C末端在其中起到重要作用。本研究為檢測BminOBP6的C末端在其與配體分子互作過程中的重要性，構建了切去C末端（D117—P124）的BminOBP6突變體TOBP6。熒光競爭結合試驗結果表明，無論哪種pH（7.4或5.0）條件下，TOBP6均完全失去了與其配體的結合能力（圖4），這與前人的研究結果不同。在BmorPBP[30]、AtralPBP[25]和HarmPBP1[31]中，無論是中性pH還是酸性pH條件下，C末端的切除并未降低這些OBP與其配體的結合能力。這說明BminOBP6的C末端首先影響的是BminOBP6與其配體的結合過程，或者稱為配體的上載過程。然而，目前有關OBP對其氣味配體的上載過程的研究鮮有報道。GONG等研究[22,43]認為，昆蟲OBP對氣味配體的上載過程可能是一個逐步進行的過程，首先氣味配體與OBP外部結合位點結合，然后在C末端的幫助下，把氣味配體引入OBP的配體結合腔內(nèi)部。筆者認為這個外部結合位點應該位于OBP的C末端序列以及連接OBP第2和第3個螺旋的環(huán)狀區(qū)。BminOBP6的C末端是否具有結合其氣味配體的外部位點？如果有，BminOBP6的C末端是如何把氣味配體引入結合腔中的？這些重要問題都需要進一步研究探索。

4 結論

柑橘大實蠅BminOBP6的配體釋放機制是一種pH誘導的配體釋放機制，推測在此過程中BminOBP6的C末端發(fā)揮了重要作用，同時，BminOBP6的C末端在BminOBP6上載其氣體配體的過程中也發(fā)揮了重要作用。

references

[1] 陳世驤, 謝蘊貞. 關于桔大實蠅的學名及其種征. 昆蟲學報, 1955, 5(1): 123-126.

Chen S X, Xie Y Z. Taxonomic notes on the Chinese citrus fly(Chen). Acta Entomologica Sinica, 1955, 5(1): 123-126. (in Chinese)

[2] 龔碧涯, 劉慧, 肖伏蓮, 向敏, 劉娟, 楊水芝, 李先信, 段科平, 熊先福. 粘蟲膠、食物誘芯和懸掛位置對誘殺球誘殺柑橘大實蠅的影響. 應用昆蟲學報, 2019, 56(4): 840-845.

GONG B Y, LIU H, XIAO F L, XIANG M, LIU J, YANG S Z, LI X X, DUAN K P, XIONG X F. The effects of different sticky glues, food lures and hanging positions, on the effectiveness of sticky spheres for trapping adult()(Enderlein). Chinese Journal of Applied Entomology, 2019, 56(4): 840-845. (in Chinese)

[3] XIA Y L, MA X L, HOU B H, OUYANG G C. A review of(Diptera: Tephritidae) in China for the purpose of safeguarding. Advances in Entomology, 2018, 6: 35-61.

[4] 李可, XIA Y L, 樊永亮, 劉同先. 柑橘大實蠅(Enderlein)引誘劑研究概況. 應用昆蟲學報, 2019, 56(3): 426-432.

LI K, XIA Y L, FAN Y L, LIU X T. Recent advances in research on attractants for the Chinese citrus fly,(Enderlein). Chinese Journal of Applied Entomology, 2019, 56(3): 426-432. (in Chinese)

[5] JUSTICE R W, BIESSMANN H, WALTER M F, DIMITRATOS S D, WOODS D F. Genomics spawns novel approaches to mosquito control. Bioessays, 2010, 25(10): 1011-1020.

[6] ELGAR M A, ZHANG D, WANG Q K, WITTWER B, PHAM H T, JOHNSON T L, FREELANCE C B, COQUILLEAU M. Insect antennal morphology: the evolution of diverse solutions to odorant perception. The Jale Journal of Biology and Medicine, 2018, 91(4): 457-469.

[7] LEAL W S. Odorant reception in insects: Roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology, 2013, 58: 373-391.

[8] HALLEM E A, DAHANUKAR A, CARLSON J R. Insect odor and taste receptors. Annual Review of Entomology, 2006, 51: 113-135.

[9] DE BRUYNE M, BAKER T C. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology, 2008, 34(7): 882-897.

[10] VOGT R G, MILLER N E, LITVACK R, FANDINO R A, SPARKS J, STAPLES J, FRIEDMAN R, DICKENS J C. The insect SNMP gene family. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2009, 39(7): 448-456.

[11] 吳帆, 張莉, 邱一蕾, 李紅亮. 昆蟲嗅覺結合蛋白研究進展. 昆蟲學報, 2021, 64(4): 523-535.

WU F, ZHANG L, QIU Y L, LI H L. Research progress of olfactory binding proteins in insects. Acta Entomologica Sinica, 2021, 64(4): 523-535. (in Chinese)

[12] 白鵬華, 王冰, 張仙紅, 王桂榮. 昆蟲氣味受體的研究方法與進展. 昆蟲學報, 2022, 65(3): 364-385.

BAI P H, WANG B, ZHANG X H, WANG G R. Research methods and advances of odorant receptors in insects. Acta Entomologica Sinica, 2022, 65(3): 364-385. (in Chinese)

[13] HOFFMAN S A, ARAVIND L, VELMURUGAN S. Femaleantennae: increased transcript accumulation of the mosquito-specific odorant-binding-protein OBP2. Parasites & Vectors, 2012, 5: 27.

[14] PELOSI P, IOVINELLA I, ZHU J, WANG G R, DANI F R. Beyond chemoreception: diverse tasks of soluble olfactory proteins in insects. Biological Reviews, 2018, 93(1): 184-200.

[15] XU P X. AOBP required for pheromone signaling. Science, 2005, 310(5749): 798-799.

[16] BIESSMANN H, ANDRONPOULOU E, BIESSMANN M R, DOURSI V, DIMITRATOS S D, ELIOPOULOS E, GUERIN P M, LATROU K, JUSTICE R W, KROBER T, MARINOTTI O, TSITOURA P, WOODS D F, WALTER M F. Theodorant-binding protein 1 (AgamOBP1) mediates indole recognition in the antennae of female mosquitoes. PLoS ONE, 2010, 5(3): e9471.

[17] ZHANG R B, WANG B, GROSSI G, FALABELLA P, LIU Y, YAN S C, LU J, XI J H, WANG G R. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology, 2017, 27: 55-61.

[18] ZHOU J J, ROBERTSON G, HE X L, DUFOUR S, HOOPER A M, PICKETT J A, KEEP N H, FIELD L M. Characterisation ofodorant-binding proteins reveals that a general odorant-binding protein discriminates between sex pheromone components. Journal of Molecular Biology, 2009, 389(3): 529-545.

[19] LAGARDE A, SPINELLI S, TEGONI M, HE X L, FIELD L, ZHOU J J, CAMBILLAU C. The crystal structure of odorant binding protein 7 fromexhibits an outstanding adaptability of its binding site. Journal of Molecular Biology, 2011, 414(3): 401-412.

[20] SANDLER B H, NIKONOVA L, LEAL W S, CLARDY J. Sexual attraction in the silkworm moth: structure of the pheromone- binding-protein-bombykol complex. Chemistry & Biology, 2000, 7(2): 143-151.

[21] LAUTENSCHLAGER C, LEAL W S, CLARDY J. Coil-to-helix transition and ligand release ofpheromone-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 335: 1044-1050.

[22] GONG Y M, PACE T C S, CASTILLO C, BOHNE C, O’NEILL M A, PLETTNER E. Ligand-interaction kinetics of the pheromone-binding protein from the gypsy moth,: insights into the mechanism of binding and release. Chemistry & Biology, 2009, 16(2): 162-172.

[23] MOHANTY S, ZUBKOV S, GRONENBORN A M. The solution NMR structure ofPBP provides new insight into pheromone recognition by pheromone-binding proteins. Journal of Molecular Biology, 2004, 337(2): 443-451.

[24] ZUBKOV S, GRONENBORN A M, BYEON I J L, MOHANTY S. Structural consequences of the pH-induced conformational switch inpheromone-binding protein: mechanisms of ligand release. Journal of Molecular Biology, 2005, 354(5): 1081-1090.

[25] XU X Z, XU W, RAYO J, ISHIDA Y, LEAL W S, AMES J B. NMR structure of navel orange worm moth pheromone-binding protein (AtraPBP1): implications for pH-sensitive pheromone detection. Biochemistry, 2010, 49(7): 1469-1476.

[26] WOGULIS M, MORGAN T, ISHIDA Y, LEAL W S, WILSON D K. The crystal structure of an odorant binding protein from: evidence for a common ligand release mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 339(1): 157-164.

[27] LEITE N R, KROGH R, XU W, ISHIDA Y, IULEK J, LEAL W S, OLIVA G. Structure of an odorant-binding protein from the mosquitosuggests a binding pocket covered by a pH-sensitive “Lid”. PLoS ONE, 2009, 4(11): e8006.

[28] MAO Y, XU X Z, XU W, ISHIDA Y, LEAL W S, AMES J B, CLARDY J. Crystal and solution structures of an odorant-binding protein from the southern house mosquito complexed with an oviposition pheromone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(44): 19102-19107.

[29] AHMED T, ZHANG T, WANG Z, HE K, BAI S. C-terminus methionene specifically involved in binding corn odorants to odorant binding protein4 in. Frontiers in Physiology, 2017, 8: 62.

[30] LEAL W S, CHEN A M, ISHIDA Y, CHIANG V P, ERICKSON M L, MORGAN T I, TSURUDA J M. Kinetics and molecular properties of pheromone binding and release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(15): 5386-5391.

[31] ZHENG J G, YANG M T, DONG K, ZHANG J B, WANG H L, XIE M J, WU W, ZHANG Y J, CHEN Z Z. Structural insights into the ligand-binding and -releasing mechanism ofpheromone-binding protein PBP1. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(3): 1190.

[32] CHEN J, YANG L, TIAN X L, GUI L Y, WANG F L, ZHANG G H. Functional characterization of two antenna-enriched odorant-binding proteins from(Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology, 2021, 114(6): 2361-2369.

[33] RAMACHANDRAN G N, RAMAKRISHNAN C, SASISEKHARAN V. Stereochemistry of polypeptide chain configurations. Journal of Molecular Biology, 1963, 7: 95-99.

[34] GUEX N, PEITSCH M C. SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb Viewer: an environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, 1997, 18(15): 2714-2723.

[35] SCHWEDE T, KOPP J, GUEX N, PEITSCH M C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Research, 2003, 31(13): 3381-3385.

[36] ZHANG T T, MEI X D, FENG J N, BERG B G, ZHANG Y J, GUO Y Y. Characterization of three pheromone-binding proteins (PBPs) of(Hübner) and their binding properties. Journal of Insect Physiology, 2012, 58(7): 941-948.

[37] LIU Z, LIANG X F, XU L, KEESEY I W, LEI Z R, SMAGGHE G, WANG J J. An antennae-specific odorant-binding protein is involved inolfaction. Frontiers in Ecology and Evolution, 2020, 8: 63.

[38] LEAL W S. Duality monomer-dimer of the pheromone-binding protein from. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 268(2): 521-529.

[39] DAMBERGER F F, MICHEL E, ISHIDA Y, LEAL W S, WüTHRICH K. Pheromone discrimination by a pH-tuned polymorphism of thepheromone-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(46): 18680-18685.

[40] VAN DER GOOT F G, GONZáLEZ-MA?AS J M, LAKEY J H, PATTUS F. A ‘molten-globule’ membrane-insertion intermediate of the pore-forming domain of colicin A. Nature, 1991, 354(6352): 408-410.

[41] WANG J, MURPHY E J, NIX J C, JONES D N M.odorant binding protein 22 selectively binds fatty acids through a conformational change in its C-terminal tail. Scientific Reports, 2020, 10(1): 3300.

[42] ZIEMBA B P, MURPHY E J, EDLIN H T, JONES D N M. A novel mechanism of ligand binding and release in the odorant binding protein 20 from the malaria mosquito. Protein Science, 2013, 22: 11-21.

[43] GONG Y M, TANG H, BOHNE C, PLETTNER E. Binding conformation and kinetics of two pheromone-binding proteins from the Gypsy mothwith biological and nonbiological ligands. Biochemistry, 2010, 49(4): 793-801.

Interaction Mechanisms BetweenOdorant-Binding Protein BminOBP6 and Its Ligands

YANG Ling1, TIAN XiaoLi2, GUI LianYou1, WANG FuLian1, ZHANG GuoHui1*

1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei

【】To explore the recognition mechanisms of BminOBP6 and its ligands, a C terminus-truncated BminOBP6 (TOBP6) was constructed in this study. Subsequently, the binding affinities of TOBP6 and the wild type protein BminOBP6 to 1-undecanol and (+)-limonene under different pH conditions were determined.【】3D structure of BminOBP6 was built by homology modeling through the online software SWISS MODEL. Based on the established BminOBP6 3D model, the C terminus sequence after sixth-helix of BminOBP6 was determined. This C terminus sequence is the sequence that will be removed from BminOBP6 in the subsequent study. Specific primers were designed to amplify the encoding sequence of BminOBP6 C terminus- truncated mutant TOBP6. Then the recombinant expression vector pET-32a/was constructed. Recombinant expression vectors pET-32a/and pET32a/that has been made before in our lab were transformed intocells BL21 (DE3) to express the TOBP6 and BminOBP6 recombinant proteins, respectively. Fluorescence competitive binding assays were conducted to determine the binding affinities of TOBP6 and BminOBP6 to 1-undecanol and (+)-limonene under different pH (7.4 and 5.0) conditions.【】Amino acid sequence alignments revealed that BminOBP6 shared 62.6% identity withCquiOBP1, and thus the 3D structure of CquiOBP1 was used as the template in the homology modeling of BminOBP6. The 3D structure of BminOBP6 indicated that the C terminus sequence after6 of BminOBP6 is a sequence of 8 amino acid residues (D117-P124). Based on this result, the encoding sequence of TOBP6 was cloned and its recombinant expression vector pET-32a/was built. Recombinant expression vectors pET-32a/and pET32a/were then transformed intocells BL21 (DE3) to express the TOBP6 and BminOBP6 recombinant proteins, respectively. The fluorescence competitive binding results showed that the binding affinity of BminOBP6 to 1-undecanol and (+)-limonene was quite strong at pH 7.4, the Kivalues were 6.89 and 9.50 μmol·L-1, respectively. However, when the pH decreased to 5.0, BminOBP6 completely lost its binding capacity to 1-undecanol and exhibited an obvious decrease in binding to (+)-limonene (the Kivalue increased from 9.50 μmol·L-1to 31.26 μmol·L-1). The binding affinity of TOBP6 to 1-undecanol and (+)-limonene was completely abolished regardless of pH conditions.【】Changes in pH have a significant effect on the ligand binding and release of BminOBP6, and the C terminus of BminOBP6 is crucial for BminOBP6 to bind its ligands.

; odorant-binding protein (OBP); homology modeling; C terminus; prokaryotic expression; fluorescence competitive binding

2022-12-10；

2023-01-17

國家自然科學基金面上項目（31972274）、湖北省高等學校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊項目（T2022009）

楊嶺，E-mail：202071666@yangtzeu.edu.cn。通信作者張國輝，E-mail：guohuizhang@yangtzeu.edu.cn

（責任編輯 岳梅）