基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與GEO 基因芯片探討四君子湯與痛瀉要方“同病異治”腹瀉型腸易激綜合征的作用機(jī)制

于官正，李 鴻，涂 星

(1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 恩施 445000)

腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea predominant-irritable bowel syndrome，IBS-D）是一種以腹痛、腹瀉為主要臨床特征的腸道功能紊亂性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與腸上皮屏障通透性升高、內(nèi)臟高敏感性、腦-腸軸功能失調(diào)等相關(guān)[1]。臨床治療IBS-D 常使用解痙、止瀉等藥品，療效單一且價(jià)格昂貴[2]。中醫(yī)認(rèn)為IBS-D 屬于“腹瀉”“下利”等范疇，基本病機(jī)為脾失健運(yùn)、肝郁脾虛等，常采用益氣健脾、疏肝健脾等方法進(jìn)行治療[3]。四君子湯與痛瀉要方為治療IBS-D 的經(jīng)典方，四君子湯以人參為君藥，偏于益氣健脾，痛瀉要方以白術(shù)為君藥，偏于燥濕止瀉，體現(xiàn)了“同病異治”的中醫(yī)特色，但其治療IBS-D 的共性機(jī)制尚不明確[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體上分析中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，與中醫(yī)整體觀念與辨證論治思想相契合，為中醫(yī)學(xué)“同病異治”的觀點(diǎn)的闡述提供有效途徑[5，6]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)四君子湯與痛瀉要方治療IBS-D 潛在共性靶點(diǎn)與通路，擬探究?jī)蓮?fù)方“同病異治”IBS-D 的潛在共性機(jī)制，以期為臨床治療IBS-D 用藥提供理論支撐。

1 資料與方法

1.1 軟件及數(shù)據(jù)庫(kù) Cytoscape（3.7.2）；Java（1.8.0）；Perl 語(yǔ)言（Active Perl 5.30）；R 語(yǔ)言（x64 4.2.1）；Bioconductor 平 臺(tái)（https://www.bioconductor.org，version3.15）；中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/index.php，version2.3）；Gene Expression Omnibus 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)）；STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org/，version 11.5）。各數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索均于2022 年12 月12 日完成。

1.2 篩選疾病差異基因 于GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入diarrhea-predominant irritable bowel syndrome normal，物種選擇“Homo sapiens”進(jìn)行搜索，IBS-D 基因載于GSE6701 芯片，該芯片數(shù)據(jù)由77 個(gè)健康受試者和53 個(gè)IBS-D 患者基因表達(dá)量構(gòu)成[7]。下載該芯片的平臺(tái)文件與探針文件。借助Perl 語(yǔ)言將探針名稱轉(zhuǎn)化為基因名稱并進(jìn)行分組。以健康組和IBS-D 組基因差異倍數(shù)的絕對(duì)值（|logFC|）≥1 且p＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用R 語(yǔ)言分析基因數(shù)據(jù)的差異性，篩選疾病差異基因并繪制火山圖。

1.3 預(yù)測(cè)復(fù)方活性成分及靶點(diǎn) 于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥0.30、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為條件進(jìn)行檢索[8，9]，獲取四君子湯與痛瀉要方的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。運(yùn)用Perl 語(yǔ)言進(jìn)行藥物靶點(diǎn)ID 轉(zhuǎn)化，將靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)為對(duì)應(yīng)的基因名。

1.4 構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 將1.3 獲得的兩復(fù)方作用靶點(diǎn)基因與IBS-D 差異基因繪制Venn 圖，取交集；運(yùn)用Perl 語(yǔ)言呈現(xiàn)出交集基因?qū)?yīng)的活性成分；運(yùn)用Cytoscape 軟件繪制中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治鯷10]。

1.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將1.4 得到的交集基因錄入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“Multiple proteins”，物種選擇“Homo sapiens”，將游離蛋白點(diǎn)隱藏后更新構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過R 語(yǔ)言運(yùn)行腳本及PPI 網(wǎng)絡(luò)TSV 文件，按照基因富集數(shù)目由多至少為條件篩選排名前30的基因?yàn)楹诵幕虿⒗L制圖片。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 通過R 語(yǔ)言中RSQLitec 插件與org.He.eg.db（version3.15）數(shù)據(jù)包對(duì)基因進(jìn)行編碼，再運(yùn)用colorspace、stringi 插件和 DOSE、clusterProfiler、pathview 數(shù)據(jù)包（version3.15），以p＜0.05 為條件進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。GO 富集分析根據(jù)值由小到大篩選每個(gè)板塊排名前10 的條目，不足10 條則分析全部，p值越小，結(jié)果越顯著；KEGG 富集分析同GO 分析條件，分析排名前20 的通路。

2 結(jié)果

2.1 篩選疾病差異基因 運(yùn)行R 語(yǔ)言以|logFC|≥1 且p＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)GSE6701 芯片所載數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，得到健康組與IBS-D 組差異基因2642 個(gè)，上調(diào)基因與下調(diào)基因分別為1033、1609 個(gè)，見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖

2.2 預(yù)測(cè)復(fù)方活性成分及靶點(diǎn) 于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為條件對(duì)四君子湯與痛瀉要方所有成分進(jìn)行篩選，得到四君子湯活性成分136 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)229 個(gè)；痛瀉要方活性成分43 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)129 個(gè)。

2.3 構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)行Perl 語(yǔ)言進(jìn)行藥物靶點(diǎn)ID 轉(zhuǎn)化，將剔重后的四君子湯與痛瀉要方活性成分作用靶點(diǎn)基因與IBS-D 差異基因繪制Venn圖，取交集。四君子湯、痛瀉要方與IBS-D 交集基因分別為33、26 個(gè)，兩復(fù)方作用靶點(diǎn)基因與IBS-D 差異基因的交集基因共36 個(gè)；包含23 個(gè)共性基因，10個(gè)四君子湯優(yōu)勢(shì)交集基因；3 個(gè)痛瀉要方優(yōu)勢(shì)交集基因，見圖2。運(yùn)用Perl 語(yǔ)言呈現(xiàn)出交集基因的活性成分，運(yùn)用Cytoscape 軟件繪制中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，得到310 條邊（表示復(fù)方活性成分與疾病靶點(diǎn)基因之間的相互作用），144 個(gè)結(jié)點(diǎn)（表示四君子湯與痛瀉要方活性成分和疾病靶點(diǎn)基因），見圖3。

圖2 四君子湯、痛瀉要方作用靶點(diǎn)基因與IBS-D 差異基因Venn 圖

圖3 四君子湯與痛瀉要方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將2.3 所得的36 個(gè)交集基因錄入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。通過R 語(yǔ)言根據(jù)基因富集數(shù)目篩選排名前30 的基因?yàn)楹诵幕?，繪制圖片，見圖4。

圖4 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與PPI 網(wǎng)絡(luò)核心基因

2.5 GO 通路富集分析 運(yùn)行R 語(yǔ)言設(shè)置p＜0.05 對(duì)痛瀉要方與IBS-D 交集基因進(jìn)行GO 富集分析，獲得功能條目273 條，包含BP 243 條，CC 8 條，MF 22條，涉及脂多糖反應(yīng)、活性氧反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、羧酸結(jié)合、單羧酸結(jié)合等生物功能；同法分析四君子湯與IBS-D交集靶點(diǎn)，獲得功能條目385 條，其中BP 345 條，CC 1 條，MF 39 條，涉及調(diào)節(jié)激素水平、脂多糖反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、羧酸結(jié)合、單羧酸結(jié)合等生物功能，見圖5。其中，脂多糖反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、羧酸結(jié)合、單羧酸結(jié)合等為兩復(fù)方治療IBS-D 潛在共性生物學(xué)事件。

圖5 痛瀉要方及四君子湯GO 富集功能分析條形圖

2.6 KEGG 通路富集分析 運(yùn)行R 語(yǔ)言以p＜0.05 為條件對(duì)四君子湯與IBS-D 交集基因進(jìn)行KEGG 富集分析，共得到功能條目64 條，涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、膀胱癌、化學(xué)致癌作用-受體激活、AGERAGE 等信號(hào)通路；同法分析痛瀉要方與IBS-D 交集靶點(diǎn)，共得到KEGG 功能條目54 條，涉及化學(xué)致癌作用-受體激活、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、類固醇激素生物合成、AGE-RAGE 等通路，見圖6。涉及化學(xué)致癌作用-受體激活、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、AGERAGE 等信號(hào)通路為兩復(fù)方治療IBS-D 潛在共性調(diào)控信號(hào)通路。

圖6 四君子湯與痛瀉要方KEGG 富集分析氣泡圖

3 討論

近年來，隨著生活環(huán)境的改變及心理壓力增加，IBS-D 在我國(guó)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給患者及社會(huì)醫(yī)療行業(yè)帶來沉重壓力[11]。中醫(yī)辨證論治IBS-D獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，認(rèn)為肝郁脾虛證、脾虛濕盛證等為IBS-D的主要證型，其中以肝郁脾虛證最為多見。四君子湯與痛瀉要方是治療IBS-D 的經(jīng)典方，四君子湯始載于宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草組成，具有補(bǔ)中益氣、健脾和胃之功，善治脾虛濕盛證[12]。痛瀉要方始載于《景岳全書》，由炒白術(shù)、炒白芍、陳皮、防風(fēng)組成，具有疏肝健脾、止痛止瀉之功，善治肝郁脾虛證[13]。雖有大量文獻(xiàn)對(duì)四君子湯及痛瀉要方單獨(dú)治療IBS-D 的機(jī)制進(jìn)行研究，但對(duì)二者“同病異治”發(fā)揮作用的共性機(jī)制鮮有報(bào)道。

本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基礎(chǔ)上篩選出四君子湯與痛瀉要方活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，其中可作用于IBS-D 的靶點(diǎn)分別有33、26 個(gè)，共36 個(gè)，包括23 個(gè)共性靶點(diǎn)，這與中藥復(fù)方干預(yù)疾病具有多成分、多靶點(diǎn)的特性相吻合[14]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)四君子湯可通過脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、膀胱癌、AGE-RAGE 等信號(hào)通路來調(diào)節(jié)激素水平、脂多糖反應(yīng)、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、單羧酸結(jié)合等生物功能發(fā)揮治療IBS-D 的作用；痛瀉要方可通過化學(xué)致癌作用-受體激活、類固醇激素生物合成、AGE-RAGE 等通路調(diào)節(jié)脂多糖反應(yīng)、活性氧反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、單羧酸結(jié)合等生物功能發(fā)揮抗IBS-D 的作用，這與中藥復(fù)方多通路治病的特征一致[15]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)[16，17]，IBS-D 的發(fā)病與腦腸互動(dòng)失衡紊亂、免疫功能失常、內(nèi)臟敏感性升高、腸道菌群失衡及腸道黏膜屏障損傷等因素密切相關(guān)，表明可從調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)粘膜屏障、改變腸道運(yùn)動(dòng)等方面來改善IBS-D，為其臨床治療提供了新思路。有文獻(xiàn)報(bào)道[18，19]，四君子湯可以通過改善腸道運(yùn)動(dòng)功能、保護(hù)腸道黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群、干預(yù)細(xì)胞增殖及凋亡等發(fā)揮抗IBS-D 的作用，與本研究挖掘出的四君子湯抗IBS-D 主要生物學(xué)功能和通路相符。痛瀉要方治療IBS-D 涉及腸道病理生理多個(gè)方面。本研究結(jié)果顯示，其治療IBS-D 所涉及的通路中，腸道感覺功能及炎癥反應(yīng)發(fā)揮了主要作用，還可以適當(dāng)調(diào)節(jié)精神心理。痛瀉要方的有效成分可通過多通路及功能來降低內(nèi)臟敏感性、改善腸道運(yùn)動(dòng)等。同時(shí)，IBS-D患者多表現(xiàn)為焦慮、抑郁，中醫(yī)稱之為肝氣郁結(jié)，肝郁脾虛。研究發(fā)現(xiàn)[20]，IBS-D 肝郁脾虛者多存在腦腸互動(dòng)紊亂，痛瀉要方可調(diào)暢情志、條達(dá)肝氣，調(diào)節(jié)腦腸肽來恢復(fù)腦腸互動(dòng)、胃腸功能，降低內(nèi)臟敏感性，保護(hù)腸黏膜屏障，發(fā)揮治療IBS-D 的作用，與本研究預(yù)測(cè)出的痛瀉要方治療IBS-D 所涉及的主要生物學(xué)功能和通路相符。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘發(fā)現(xiàn)調(diào)控化學(xué)致癌作用-受體激活、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE 等信號(hào)通路及脂多糖反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、羧酸結(jié)合、單羧酸結(jié)合等生物功能可能為四君子湯與痛瀉要方治療IBS-D 潛在共性生物學(xué)事件。本研究尚有不足之處，未開展相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，后期需開展更多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。