基于生物信息學方法構(gòu)建肝細胞癌SNHG17-miRNA-CDK4預后預測模型

劉建東 韓翠云 鐘敬濤 徐慧榮

［摘要］ 目的

探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）小核仁RNA宿主基因17（SNHG17）在肝細胞癌（HCC）發(fā)生發(fā)展中的作用。

方法 利用基因表達譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫，分析HCC中SNHG17的表達及其與生存的關(guān)系；利用基因表達綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行驗證，使用GEO2R、lnCAR和Metascape軟件分析SNHG17相關(guān)性基因、構(gòu)建可視化網(wǎng)絡并進行GO和KEGG富集分析。根據(jù)通路利用多個GEO數(shù)據(jù)集篩選出細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）；利用數(shù)據(jù)庫平臺StarBase、miRBD以及HMDD篩選出同時以SNHG17和CDK4為靶基因的microRNA（miRNA）。

結(jié)果 lncRNA SNHG17在HCC中的表達顯著上升（P＜0.05），其表達高的病人預后顯著變差（P＜0.05）。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，SNHG17與核蛋白復合物以及細胞周期相關(guān)。篩選出高度相關(guān)基因CDK4并篩選出以SNHG17和CDK4為靶標的miRNAs。

結(jié)論 SNHG17在HCC中表達增高，并可通過結(jié)合多種miRNA發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA的功能，對CDK4發(fā)揮調(diào)控作用。

［關(guān)鍵詞］ 癌，肝細胞；RNA，長鏈非編碼；微RNAs；細胞周期蛋白依賴激酶4；預后；計算生物學

［中圖分類號］ R730.261；R342.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0850-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.204

［網(wǎng)絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1606.005;2024-01-05 20：16：24

ESTABLISHMENT OF A PROGNOSTIC PREDICTION MODEL FOR HEPATOCELLULAR CARCINOMA BASED ON SNHG17-MIRNA-CDK4 AND BIOINFORMATICS METHODS

LIU Jiandong， HAN Cuiyun，ZHONG Jingtao， XU Huirong

（Department of Emergency Medicine， Qilu Hospital of Shandong University， Jinan 250000， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the role of the long non-coding RNA （lncRNA） small nucleolar RNA host gene 17 （SNHG17） in the development and progression of hepatocellular carcinoma （HCC）.

MethodsGEPIA database was used to analyze the expression of SNHG17 in HCC and its association with survival; the data in GEO database were used for validation; GEO2R，lnCAR， and Metascape were used to analyze SNHG17-related genes， construct a visualized network， and perform GO and KEGG enrichment analyses. Based on related pathways， multiple GEO datasets were used to screen for CDK4， and StarBase，miRBD， and HMDD database platforms were used to obtain the microRNAs （miRNAs） targeting both SNHG17 and CDK4.

ResultsThere was a significant increase in the expression of lncRNA SNHG17 in HCC （P<0.05）， and the patients with high SNHG17 expression tended to have a poorer prognosis （P<0.05）. GO and KEGG enrichment analyses showed that SNHG17 was associated with nuclear protein complex and cell cycle. The highly related gene CDK4 was obtained， as well as the miRNAs targeting SNHG17 and CDK4.

ConclusionThere is an increase in the expression of SNHG17 in HCC， and SNHG17 can play the role of competitive endogenous RNA by binding to a variety of miRNAs， thereby exerting a regulatory effect on CDK4.

［KEY WORDS］carcinoma， hepatocellular; RNA， long noncoding; miRNAs; cyclin-dependent kinase 4; prognosis; computational biology

肝細胞癌（HCC）作為最常見的惡性腫瘤之一，已成為全球死亡率第二高的腫瘤［1］。由于HCC在確診時往往已經(jīng)處于晚期，并且由于遠處轉(zhuǎn)移和術(shù)后復發(fā)等因素，HCC病人的預后很差［2-3］。因此，探究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找與HCC發(fā)生有關(guān)的新型生物標志物對HCC病人的早期診斷和治療十分重要。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200個核苷酸的無蛋白質(zhì)編碼能力的RNA，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。小核仁RNA宿主基因17（SNHG17）是新發(fā)現(xiàn)的位于20q11的lncRNA，在多種腫瘤中表達上調(diào)，發(fā)揮癌基因的功能［5-7］。相

關(guān)研究顯示，SNHG17過表達通過競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）網(wǎng)絡調(diào)控肺腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖和遷移［8-9］。然而，SNHG17在HCC中的表達水平及其臨床意義研究較少。本研究利用生物信息學方法分析SNHG17在HCC中的表達水平及其對生存的影響，并通過基因表達綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集信息的深度挖掘預測靶基因細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4），為后期SNHG17在HCC中的功能研究提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 SNHG17在HCC中的表達及生存分析

本文研究利用基因表達譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析TCGA HCC數(shù)據(jù)集中SNHG17在癌與癌旁組織中表達水平差異，分析SNHG17表達與病人總生存期（OS）和無病生存期（DFS）的相關(guān)性，以及SNHG17表達與腫瘤分級之間的關(guān)系。

1.2 SNHG17在癌和癌旁組織中表達驗證

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載HCC的臨床數(shù)據(jù)，對GSE36376、GSE14520數(shù)據(jù)集中SNHG17在癌與癌旁組織中的表達水平進行驗證。

1.3 SNHG17相關(guān)靶基因生物學功能及通路分析本文利用lnCAR數(shù)據(jù)庫（https：//lncar.renlab.

org/）分析GEO數(shù)據(jù)集中與SNHG17相關(guān)的基因并構(gòu)建可視化網(wǎng)絡，利用Metascape平臺（https：//metascape.org/gp/index.html#main/step1）進行靶基因的GO和KEGG 富集分析。

1.4 SNHG17及其下游靶基因CDK4相關(guān)性分析

采用韋恩圖取交集的方法在不同GEO數(shù)據(jù)集中取得高度相關(guān)的基因的交集，參考基因富集通路挑選出最有意義的靶基因CDK4。同時在GEPIA數(shù)據(jù)庫中采用Perarson相關(guān)性分析進行驗證。

1.5 CDK4基因在HCC中的表達及預后分析

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析CDK4在癌與癌旁組織中的表達水平，分析CDK4表達與病人OS和DFS的相關(guān)性，以及與腫瘤分級之間的關(guān)系。

1.6 與SNHG17和CDK4相互作用miRNA的篩選及其調(diào)控關(guān)系分析

通過StarBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）、miRBD（http：//www.mirdb.org/）篩選可能同時結(jié)合SNHG17和CDK4的miRNA，并分析SNHG17、miRNA和CDK4之間的調(diào)控關(guān)系。利用HMDD v3.0（http：//www.cuilab.cn/hmdd）檢索并分析與HCC有關(guān)的miRNA，通過StarBase進行Perarson相關(guān)性分析，以進一步證實SNHG17通過miRNA發(fā)揮對CDK4的調(diào)控。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組之間比較采用雙尾未配對的t檢驗或配對的t檢驗，通過Kaplan-Meier曲線檢驗SNHG17和CDK4表達對 HCC病人的影響，并使用對數(shù)值檢驗分析了病人的OS和DFS。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)? 果

2.1 HCC組織中SNHG17的表達水平及與病人生存情況的相關(guān)性

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫TCGA數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)， HCC中SNHG17表達量明顯增高（P<0.001），且與HCC的分級密切相關(guān)，與低級別HCC（Stage Ⅰ/Ⅱ）相比較，高級別HCC（Stage Ⅲ/Ⅴ）組織中SNHG17表達明顯升高（P<0.01）。見圖1A、B。 SNHG17表達水平也與HCC病人的OS和DFS高度相關(guān)，與SNHG17表達水平較高的病人相比較，SNHG17表達較低的病人的OS和DFS時間延長（P<0.05）。見圖1C、D。同樣地，與來自GEO的RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE36376、GSE14520中的正常組織相比，HCC組織中SNHG17的表達明顯上調(diào)（P<0.01）。見圖1E、F。

2.2 GEO數(shù)據(jù)集中SNHG17靶基因的功能富集分析

通過lnCAR平臺分析GEO的RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE14520，得到與SNHG17相關(guān)靶基因共200個（r>0.50或<-0.50）并構(gòu)建基因相關(guān)性網(wǎng)絡。見圖2A。利用Metascape平臺分析200個相關(guān)性靶基因，GO生物過程分析發(fā)現(xiàn)基因主要集中在核蛋白的復合體生成、mRNA的翻譯以及核蛋白的組裝。見圖2B。KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，排名第一的是與細胞周期相關(guān)的通路。見圖2C。對GEO的RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE36376、GSE14520相關(guān)靶基因分析取交集找到36個共同靶基因，其中CDK4以促進HCC細胞的G1/S轉(zhuǎn)變調(diào)控細胞周期的信號通路［10］。同時我們用GEPIA的Perarson相關(guān)性分析進行驗證，結(jié)果顯示在TCGA數(shù)據(jù)集中CDK4與SNHG17的表達呈高度相關(guān)（P<0.01）。見圖2D。

2.3 HCC中CDK4表達與生存時間關(guān)系

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫TCGA數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，HCC中的CDK4表達明顯增高（P<0.001）。見圖3A。CDK4表達與人種、性別、年齡、體質(zhì)量無關(guān)（P>0.05）。見圖3B～E。與高級別和高分期的病人相比，部分低級別和低分期病人CDK4的表達量降低（P<0.05）。見圖3F、G。CDK4水平也與HCC病人的OS和DFS高度相關(guān)，與CDK4表達水平較高的病人相比，CDK4表達較低的病人的OS和DFS延長（P<0.001）。見圖3H、I。

2.4 SNHG17-miRNA-CDK4調(diào)控模型中miRNA的篩選

在多種腫瘤中，SNHG17可以作為ceRNA發(fā)揮“分子海綿“作用，吸附miRNA，調(diào)控下游靶基因的表達。我們通過StarBase、miRBD預測HCC中與SNHG17和CDK4結(jié)合的miRNA并取交集，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-335-5p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-506-3p可以同時結(jié)合SNHG17和CDK4。見圖4。

3 討? 論

SNHG家族通過多種分子調(diào)控機制參與HCC

的發(fā)生發(fā)展過程［11］。例如，SNHG1通過吸附miR-377-3p促進HCC進展和轉(zhuǎn)移［12］；SNHG3可直接結(jié)合miR-128從而促進CD151表達，激活上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)通路的表達，促進HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移［13］；SNHG5高表達解除了miR-26a-5p對糖原合成酶激酶3β的抑制作用，從而促進了

HCC的發(fā)生［14］；SNHG17在多種腫瘤中表達上調(diào)并促進癌癥進展［15-16］。然而，SNHG17在HCC中的功能和機制的相關(guān)研究較少。本研究利用生物信息學技術(shù)分析顯示，SNHG17在HCC組織中的表達顯著高于癌旁正常肝組織，并且SNHG17高表達與HCC病人較短的OS和DFS顯著相關(guān)，提示SNHG17可能在HCC中發(fā)揮癌基因功能，調(diào)控HCC的發(fā)生發(fā)展。對GSE14520數(shù)據(jù)集進行進一步分析結(jié)果表明，與SNHG17相關(guān)的基因高度富集在細胞周期相關(guān)通路上，在TCGA數(shù)據(jù)集以及不同的GEO數(shù)據(jù)集中同時發(fā)現(xiàn)CDK4的表達水平與SNHG17顯著相關(guān)。

CDK4蛋白是一種由CDK4基因編碼的廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸激酶。在有絲分裂原刺激下，細胞周期蛋白D（CyclinD）與激活的CDK4組成CDK4-CyclinD復合物，對于細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換至關(guān)重要，在癌細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。例如，復制蛋白A1作為潛在的癌基因通過CDK4/CyclinD途徑促進腫瘤增殖，從而在HCC中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］。本研究系統(tǒng)分析了CDK4在TCGAHCC數(shù)據(jù)集中的表達水平，并分析了其與腫瘤分期分級及病人種族、年齡、性別、體質(zhì)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CDK4是HCC獨立預后因素，在HCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本文生信分析結(jié)果顯示，HCC組織SNHG17-miRNA-CDK4預后預測模型的構(gòu)建，為SNHG17在HCC中的機制研究提供了重要的參考。然而，由于本研究樣本量較少，因此該結(jié)果需進一步通過大樣本研究證實。

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（本文編輯 牛兆山）