染色質(zhì)調(diào)控因子相關(guān)基因在乳癌預(yù)后評估中的價(jià)值

張蔚然 呂志棟 宋洪明 夏菁 郇喻淇 孔濱

［摘要］ 目的

通過構(gòu)建染色質(zhì)調(diào)控因子（CRs）相關(guān)基因預(yù)后模型，探討CRs相關(guān)基因在乳癌預(yù)后評估中的價(jià)值。

方法 在基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行差異性分析，篩選出CRs相關(guān)的差異基因。采用單因素Cox回歸分析和LASSO回歸方法建立CRs相關(guān)基因預(yù)后模型并進(jìn)行驗(yàn)證。選取30對臨床乳癌及癌旁組織樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）方法對關(guān)鍵CRs相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

結(jié)果 依據(jù)差異性分析結(jié)果建立基于4個(gè)CRs相關(guān)基因（MORF4L1、NCOA4、TTK和JMJD4）的乳癌病人預(yù)后模型，并根據(jù)模型風(fēng)險(xiǎn)評分臨界值將病人分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，生存分析顯示高風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后較差。RT-qPCR結(jié)果顯示，在乳癌組織中MORF4L1、NCOA4的表達(dá)下降，TTK、JMJD4的表達(dá)升高，與差異性分析的結(jié)果相一致。

結(jié)論 基于上述4個(gè)CRs相關(guān)基因的預(yù)后模型可以有效預(yù)測乳癌病人的預(yù)后。

［關(guān)鍵詞］ 乳腺腫瘤；染色質(zhì)調(diào)控因子；列線圖；預(yù)后

［中圖分類號(hào)］ R737.9

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096-5532（2023）06-0814-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.179

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231220.2243.003;2023-12-22 10：17：03

VALUE OF CHROMATIN REGULATOR-RELATED GENES IN EVALUATING THE PROGNOSIS OF BREAST CANCER

ZHANG Weiran， L Zhidong， SONG Hongming， XIA Jing， HUAN Yuqi， KONG Bin

（Department of Diagnosis and Treatment Centre of Breast Diseases， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo construct a prognostic model of chromatin regulator （CR）-related genes， and to investigate the value of CR-related genes in evaluating the prognosis of breast cancer.

MethodsA difference analysis was performed in the Gene Expression Omnibus database to screen for the differentially expressed CR-related genes. Univariate Cox regression analysis and LASSO regression analysis were used to establish and validate the prognostic model based on CR-related genes. A total of 30 pairs of breast cancer tissue samples and adjacent tissue samples were selected， and RT-qPCR was used to verify the expression of key CR-related genes.

ResultsAccording to the results of the difference analysis， a prognostic model of breast cancer patients was established based on four CR-related genes （MORF4L1， NCOA4， TTK， and JMJD4）， and the patients were divided into high- and low-risk groups according to the cut-off value of the risk model. Survival analysis showed that the high-risk group tended to have a poor prognosis. The results of RT-qPCR showed that there were reductions in the expression of MORF4L1 and NCOA4 and increases in the expression of TTK and JMJD4 in breast cancer tissue， which was consistent with the results of the difference analysis.

ConclusionThe prognostic model based on the above four CR-related genes can effectively predict the prognosis of breast cancer patients.

［KEY WORDS］breast neoplasms; chromatin regulators; nomograms; prognosis

表觀遺傳學(xué)主要研究那些不是由DNA序列變化引起的可遺傳性狀，表觀遺傳機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA調(diào)控等。人類基因組編碼了數(shù)以百計(jì)的染色質(zhì)調(diào)控因子（CRs），以組織特異性的方式表達(dá)，并通過改變表觀遺傳修飾在正常生理和疾病中發(fā)揮重要作用。CRs主要包括DNA甲基化劑、組蛋白修飾劑和染色質(zhì)重塑劑［1］。許多因素如突變等可以導(dǎo)致CRs的功能障礙，并顯著影響各種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展［2］。有研究結(jié)果表明，CRs相關(guān)基因在膀胱癌、低級別膠質(zhì)瘤等腫瘤預(yù)后評估中具有重要價(jià)值，并且該研究還建立了有效預(yù)后評估模型［3］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，乳癌已經(jīng)成為世界上女性發(fā)病率最高的腫瘤［4］。然而，目前的診療方法對基于現(xiàn)有4種乳癌亞型的許多病人的預(yù)后評估仍然存在一定局限性［5-6］。CRs相關(guān)基因與乳癌預(yù)后的相關(guān)性的研究報(bào)道較少。本研究通過構(gòu)建CRs相關(guān)基因的預(yù)后模型，探討CRs相關(guān)基因在乳癌預(yù)后評估中的價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 差異基因篩選

在基因綜合表達(dá)（GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的GSE42568數(shù)據(jù)集以及GSE45255數(shù)據(jù)集中分別下載基因表達(dá)譜和臨床信息進(jìn)行分析。其中GSE42568數(shù)據(jù)集包含104例原發(fā)乳癌樣本和17例正常乳腺組織樣本，GSE45255數(shù)據(jù)集包含139例原發(fā)乳癌樣本。從既往研究中獲得870個(gè)CRs相關(guān)基因［7］。這些mRNA表達(dá)譜通過對應(yīng)的R包進(jìn)行歸一化處理。以|logFC|＞1且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用R軟件的limma包進(jìn)行差異分析篩選CRs相關(guān)差異基因。

1.2 功能分析

采用clusterProfiler軟件包對CRs相關(guān)差異基因進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋分析（包括分子功能、生物過程和細(xì)胞成分）以及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析。FDR＜0.05和P＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著富集。

1.3 基因預(yù)后模型構(gòu)建和驗(yàn)證

通過單因素Cox回歸分析篩選出預(yù)后價(jià)值最高的12個(gè)基因，使用glmnet R包，通過LASSO回歸從12個(gè)最佳預(yù)后基因中篩選出4個(gè)關(guān)鍵基因構(gòu)建預(yù)后模型。預(yù)后預(yù)測模塊的工作流程如下：①以GSE42568數(shù)據(jù)集為訓(xùn)練集，將其隨機(jī)分為內(nèi)部訓(xùn)練集和內(nèi)部測試集，在內(nèi)部訓(xùn)練集中采用LASSO回歸方法建立模型；②在內(nèi)部測試集和外部測試集（GSE45255數(shù)據(jù)集）中測試模型預(yù)測預(yù)后的能力；③采用Hmisc R包計(jì)算預(yù)后模型的一致性指數(shù)（c指數(shù)）；④循環(huán)1 000次，選擇預(yù)后模型的條件為內(nèi)部訓(xùn)練集、內(nèi)部測試集和外部測試集的c指數(shù)均大于0.7，且內(nèi)部測試集和外部測試集的c指數(shù)平方和最大。風(fēng)險(xiǎn)評分計(jì)算公式：風(fēng)險(xiǎn)評分=（Coef1×mRNA1表達(dá)）+（Coef2×mRNA2表達(dá)）+…+（Coefn×mRNAn表達(dá)）。其中Coef為對應(yīng)的模型系數(shù)。根據(jù)模型風(fēng)險(xiǎn)評分的臨界值將乳癌病人分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，使用survival R軟件包通過Kaplan-Meier曲線評估乳癌病人的生存期，使用survivalROC R軟件包通過時(shí)間相關(guān)受試者工作特征（ROC）曲線分析評估模型預(yù)測預(yù)后能力。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測關(guān)鍵基因表達(dá)

選取在青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療乳癌病人的乳癌組織標(biāo)本30例，以相應(yīng)癌旁組織作為對照。病人納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性女性乳癌病人；②臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他原發(fā)腫瘤或有其他原發(fā)腫瘤病史病人；②病理資料不全病人。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有病人均對研究知情同意。

使用TRIzol試劑（Takara，Kusatsu，Japan）提取組織標(biāo)本總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，南京，中國）合成cDNA。目標(biāo)序列用SYBR-Green試劑（Vazyme，南京，中國）進(jìn)行擴(kuò)增。采用2ΔΔCt方法計(jì)算各基因在乳癌及癌旁組織中的相對定量表達(dá)。RT-qPCR引物及其序列見表1。

1.5 模型預(yù)后預(yù)測能力評估

采用臨床相關(guān)性分析，評估模型風(fēng)險(xiǎn)評分與年齡、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（Her2）、腫瘤分級、T分期、淋巴結(jié)狀態(tài)等臨床因素的相關(guān)性。采用單因素和多因素Cox回歸分析評估年齡、ER、PR、Her2、腫瘤分級、T分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、模型風(fēng)險(xiǎn)評分是否為乳癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

1.6 列線圖構(gòu)建及驗(yàn)證

根據(jù)單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果，基于乳癌獨(dú)立預(yù)后因素相關(guān)指標(biāo)建立列線圖，用以評估乳癌病人3年和5年的生存率。通過c指數(shù)和校正曲線驗(yàn)證列線圖預(yù)測預(yù)后的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件（版本4.1.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 CRs相關(guān)差異基因的篩選

從既往文獻(xiàn)中獲得了870個(gè)CRs相關(guān)基因，在GSE42568和GSE45255數(shù)據(jù)集中取交集，得到707個(gè)共同基因。對GSE42568數(shù)據(jù)集中全部104例乳癌組織標(biāo)本和17例正常乳腺組織標(biāo)本進(jìn)行共同基因的差異性分析，共篩選出168個(gè)CRs相關(guān)差異基因，其中上調(diào)基因136個(gè)，下調(diào)基因32個(gè)（圖1）。

2.2 功能分析

采用GO和KEGG富集分析，探討168個(gè)CRs相關(guān)差異基因的潛在生物學(xué)功能及信號(hào)通路。GO分析結(jié)果顯示：在生物過程水平，差異基因在組蛋白修飾、肽基賴氨酸修飾、染色質(zhì)組織、組蛋白甲基化和組蛋白賴氨酸甲基化方面顯著富集；在分子功能水平，差異基因在轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子活性、組蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共抑制因子活性、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性和轉(zhuǎn)錄共激活因子活性中顯著富集；在細(xì)胞成分水平，差異基因在甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體、組蛋白去乙酰化酶復(fù)合體、PcG蛋白復(fù)合體和異染色質(zhì)中顯著富集。這些結(jié)果表明，差異基因的功能主要富集于組蛋白修飾相關(guān)功能。KEGG通路分析結(jié)果表明，差異基因主要參與賴氨酸降解、Notch信號(hào)通路、細(xì)胞周期、病毒生命周期-HIV-1、胰高血糖素信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)以及病毒致癌相關(guān)通路（圖2）。

2.3 構(gòu)建CRs相關(guān)基因預(yù)后模型并驗(yàn)證其效力

采用單因素Cox回歸分析CRs相關(guān)差異基因的預(yù)后價(jià)值，以P＜0.005為標(biāo)準(zhǔn)，共獲得12個(gè)最佳預(yù)后基因（圖3A）。再使用LASSO回歸分析成功構(gòu)建了包含4個(gè)基因（MORF4L1、NCOA4、TTK和JMJD4）的預(yù)后模型。風(fēng)險(xiǎn)評分=（-0.556 4×MORF4L1表達(dá)）+（-0.088 5×NCOA4表達(dá)）+（0.048 4×TTK表達(dá)）+（0.279 8×JMJD4表達(dá)）。低、高風(fēng)險(xiǎn)組風(fēng)險(xiǎn)評分的最佳臨界值為0.156。生存分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組病人的預(yù)后明顯較差（圖3B、C），提示風(fēng)險(xiǎn)評分與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。時(shí)間依賴的ROC曲線分析顯示，在GSE42568數(shù)據(jù)集中模型預(yù)測乳癌病人1、3、5年生存率的ROC曲線曲線下面積（AUC）分別為0.794、0.784和0.837（圖3D），表明模型具有良好的預(yù)測預(yù)后能力。在GSE45255數(shù)據(jù)集中使用相同的方法進(jìn)行驗(yàn)證，所得的結(jié)果與GSE42568數(shù)據(jù)集結(jié)果相一致，時(shí)間依賴性ROC曲線分析顯示，模型預(yù)測病人1、3、5年生存率的AUC分別為0.780、0.716和0.730，證實(shí)模型具有良好的預(yù)后預(yù)測能力。

2.4 乳癌組織中關(guān)鍵基因表達(dá)的驗(yàn)證

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，乳癌組織中MORF4L1和NCOA4的表達(dá)顯著降低，TTK和JMJD4的表達(dá)顯著增高，與差異性分析結(jié)果相一致（圖4）。

2.5 風(fēng)險(xiǎn)評分和臨床參數(shù)相關(guān)性分析

箱線圖分析結(jié)果顯示，不同腫瘤分級、T分期、淋巴結(jié)狀態(tài)和乳癌分子亞型病人風(fēng)險(xiǎn)評分比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5），其中G3、T2-3以及三陰性乳癌病人的風(fēng)險(xiǎn)評分較高（P＜0.05）。但年齡＞60歲及≤60歲乳癌病人的風(fēng)險(xiǎn)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 模型預(yù)后預(yù)測能力評估

單因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評分、ER、PR、Her2和淋巴結(jié)狀態(tài)與乳癌病人的生存期相關(guān)（圖6A）。多因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評分和淋巴結(jié)狀態(tài)是乳癌病人的獨(dú)立預(yù)后因素（圖6B），表明該預(yù)后模型具有良好的預(yù)后預(yù)測能力。

2.7 列線圖構(gòu)建及驗(yàn)證

根據(jù)Cox回歸分析結(jié)果，構(gòu)建一個(gè)包含淋巴結(jié)狀態(tài)和風(fēng)險(xiǎn)評分的列線圖，以圖形化的方式評估乳癌病人3、5年的生存概率（圖7A）。該列線圖的c指數(shù)為0.826 5，3年和5年校正曲線表明該列線圖預(yù)測結(jié)果與實(shí)際觀察結(jié)果之間具有良好的一致性（圖7B、C）。

3 討? 論

乳癌作為女性最常見的癌癥，具有較高的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率與死亡率［8-9］?；贓R、PR以及Her2的乳癌分子分型對治療指導(dǎo)以及預(yù)后評估具有較高的準(zhǔn)確性，但該分型仍然存在不足［10］。CRs相關(guān)基因的異常表達(dá)參與了許多乳癌相關(guān)生物學(xué)過程，但其在乳癌中的預(yù)后價(jià)值尚有待研究。

本研究首先通過GSE42568數(shù)據(jù)集篩選了168個(gè)在乳癌與正常乳腺組織中差異表達(dá)的基因，并對差異基因進(jìn)行富集分析。GO分析結(jié)果顯示，差異基因的功能主要富集于組蛋白修飾。既往有文獻(xiàn)報(bào)道，異常的組蛋白乙?；揎椗c乳癌的DNA修復(fù)、凋亡、代謝、轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)［11］；組蛋白修飾劑被認(rèn)為是有前途的治療靶點(diǎn)，組蛋白修飾抑制劑西達(dá)苯胺聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑和免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以重塑乳癌腫瘤免疫微環(huán)境，提高藥物的抗腫瘤活性［12］。KEGG富集分析結(jié)果表明，CRs相關(guān)差異基因主要富集于與組蛋白翻譯后修飾相關(guān)的信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及基因轉(zhuǎn)錄過程［13-14］。

本研究進(jìn)一步構(gòu)建了基于4個(gè)CRs相關(guān)基因（MORF4L1、NCOA4、TTK和JMJD4）的預(yù)后模型，根據(jù)模型風(fēng)險(xiǎn)評分臨界值將病人分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，并全面分析模型預(yù)后預(yù)測能力。分析預(yù)測模型與臨床參數(shù)的關(guān)系結(jié)果顯示，腫瘤分期高、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人風(fēng)險(xiǎn)評分較高，Luminal亞型、Her2過表達(dá)亞型和三陰性亞型風(fēng)險(xiǎn)評分依次升高。既往有臨床研究顯示，Luminal亞型乳癌腫瘤級別低，病人生存率高，預(yù)后最佳，而三陰性乳癌具有增殖率高、侵襲性高、早期復(fù)發(fā)的特點(diǎn)［15-16］。上述結(jié)果表明，較高的風(fēng)險(xiǎn)評分提示乳癌較差的預(yù)后。本研究單因素、多因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評分和淋巴結(jié)狀態(tài)是乳癌的獨(dú)立預(yù)后因素，進(jìn)一步證實(shí)了該模型的臨床應(yīng)用價(jià)值和預(yù)后預(yù)測能力。

本研究篩選了4個(gè)基因構(gòu)建預(yù)后模型。差異分析顯示，MORF4L1和NCOA4在乳癌組織中的表達(dá)顯著降低，TTK和JMJD4在乳癌組織中的表達(dá)顯著增高。進(jìn)一步通過臨床樣本驗(yàn)證4個(gè)基因在乳癌組織中的表達(dá)水平，所得結(jié)果與差異分析結(jié)果相一致。既往研究表示，MORF4L1是NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的一部分，作用于DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程，在乳癌起始和進(jìn)展中起保護(hù)作用［17-19］。NCOA4在乳癌免疫喚醒中具有重要作用，其低表達(dá)提示膽管癌、結(jié)腸腺癌和腎透明細(xì)胞癌預(yù)后較差［20-22］。TTK是一種能夠磷酸化蘇氨酸/絲氨酸和酪氨酸的雙特異性蛋白激酶，在乳癌組織中表達(dá)水平較高，其過表達(dá)與乳癌腫瘤大小、TNM分期和Ki-67指數(shù)呈正相關(guān)，提示預(yù)后不良［23-25］。JMJD4是一種C4賴氨酸羥化酶，被認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄終止、胚胎干細(xì)胞維持和胚胎發(fā)育中發(fā)揮廣泛的作用，其高表達(dá)是透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌及結(jié)腸癌病人的獨(dú)立預(yù)后因素［26-29］。上述結(jié)果表明，這4個(gè)關(guān)鍵基因可能成為乳癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

總之，本研究構(gòu)建了一個(gè)基于4個(gè)CRs相關(guān)基因的預(yù)后模型，經(jīng)驗(yàn)證該模型可以有效評估乳癌病人的生存預(yù)后。

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（本文編輯 馬偉平）