芝麻素對氧糖剝奪損傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的作用及機制

陳淑君 何佳林 萬芪

［摘要］ 目的 探討芝麻素（SSM）是否通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/核因子-紅細胞樣2相關(guān)因子2（Nrf2）信號通路對氧糖剝奪（OGD）損傷的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

方法 原代培養(yǎng)SD大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元8 d后，構(gòu)建體外腦缺血模型。采用CCK-8法檢測不同濃度SSM對神經(jīng)元存活率的影響，采用免疫印跡法檢測最適作用濃度SSM處理后磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-Akt）、Akt、Nrf2、血紅素氧化酶-1（HO-1）蛋白表達水平。

結(jié)果 與Control組相比，OGD組神經(jīng)元存活率下降，不同濃度的SSM處理均可增加OGD損傷后神經(jīng)元的存活率（F=35.93，P<0.01），以25 μmol/L的SSM作用最明顯。各組氧化應激相關(guān)蛋白p-Akt、Nrf2、HO-1表達差異有統(tǒng)計學意義（F=23.47～32.21，P<0.01）。與OGD組相比，OGD+SSM組p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達量均顯著上調(diào)（P<0.05）；與OGD+SSM組相比，OGD+SSM+LY294002組p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白上調(diào)均被抑制（P<0.05）。各組Akt比較差異無顯著性（P>0.05）。

結(jié)論 SSM通過激活PI3K/Akt/Nrf2信號通路，提高OGD損傷后神經(jīng)元的存活率，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

［關(guān)鍵詞］ 芝麻脂素；大腦皮質(zhì)；神經(jīng)元；腦缺血；神經(jīng)保護

［中圖分類號］ R338.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0791-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.189

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231230.1152.001;2024-01-03 10：07：27

EFFECT OF SESAMIN ON CORTICAL NEURON INJURY INDUCED BY OXYGEN-GLUCOSE DEPRIVATION IN RATS AND RELATED MECHANISM

CHEN Shujun， HE Jialin， WAN Qi

（Institute of Neuroregeneration & Neurorehabilitation， Qing-

dao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate whether sesamin （SSM） exerts a neuroprotective effect on rat cortical neurons with oxygen-glucose deprivation （OGD） injury through the phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B （Akt）/nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） signaling pathway.

MethodsPrimary cortical neurons of Sprague-Dawley rats were cultured for 8 days to construct an in vitro model of cerebral ischemia. CCK-8 assay was used to observe the effect of different concentrations of SSM on the viability of neurons， and Western blotting was used to measure the protein expression levels of phosphorylated Akt （p-Akt）， Akt， Nrf2， and heme oxygenase-1 （HO-1） after treatment with the optimal concentration of SSM.

ResultsCompared with the Control group， the OGD group had a significant reduction in the viability of neurons， and SSM treatment at different concentrations could increase the viability of neurons after OGD injury （F=35.93，P<0.01）， with the most obvious effect at the concentration of 25 μmol/L. There were significant differences between groups in the expression levels of the oxidative stress-rela-

ted proteins p-Akt， Nrf2， and HO-1 （F=23.47-32.21，P<0.01）. Compared with the OGD group， the OGD+SSM group had significantly upregulated protein expression of p-Akt， Nrf2， and HO-1 （P<0.05）， and compared with the OGD+SSM group， the OGD+SSM+LY294002 group had inhibited upregulation of p-Akt， Nrf2， and HO-1 proteins （P<0.05）. There was no significant difference in Akt between groups （P>0.05）.

ConclusionSSM plays a neuroprotective role by activating the PI3K/Akt/Nrf2 signaling pathway and increasing the viability of neurons after OGD injury.

［KEY WORDS］sesamin; cerebral cortex; neurons; brain ischemia; neuroprotection

缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)致死和致殘的主要原因之一［1］。其最常見的發(fā)病機制是大腦中動脈短暫性閉塞，再通后活性氧（ROS）自由基過量生成，通過氧化應激造成不同程度的腦損傷［2］。因此，具有抗氧化性質(zhì)的化合物可以減輕由氧化應激引起的腦損傷［3］。芝麻素（SSM）是一種抗氧化劑，具有抗氧化和抗炎的作用，它通過減輕氧化應激和抑制神經(jīng)炎癥來提供神經(jīng)保護［4-7］。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路在調(diào)控氧化應激中發(fā)揮重要作用，許多化合物可能通過上調(diào)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-Akt）來減輕缺血性損傷［8-9］。核因子-紅細胞樣2相關(guān)因子2（Nrf2）是Akt發(fā)揮神經(jīng)保護作用的下游關(guān)鍵因子并參與調(diào)節(jié)氧化應激，調(diào)節(jié)ROS和抗氧化基因的表達［10-11］。Nrf2被激活后，轉(zhuǎn)位到細胞核，啟動血紅素氧化酶-1（HO-1）等多種抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，從而減輕氧化應激損傷［12-13］。目前仍然不清楚SSM能否通過調(diào)控PI3K/Akt/Nrf2信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究通過制備大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪（OGD）模型對此進行探討，以期為腦卒中提供一種潛在的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 孕18 d的健康成年雌性SD大鼠，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物合格證號SCXK（魯）20190003，飼養(yǎng)于青島大學醫(yī)學部實驗動物中心。本實驗經(jīng)青島大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 實驗試劑 Neurobasal Medium、多聚賴氨酸（10×）、glutaMax（100×）、2.5 g/L胰蛋白酶溶液、B-27 Supplement均購自Gibco公司；胎牛血清購自四季青公司；青霉素-鏈霉素（100×）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；Nrf2抗體、HO-1抗體均購自Abcam公司；β-actin抗體、p-Akt抗體、Akt抗體均購自CST公司；兔二抗、鼠二抗均購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、苯甲基磺酰氟（0.1 mol/L）、蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）、D-Hanks溶液、磷酸鹽緩沖液、SSM均購自北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；RIPA裂解液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；LY294002購自MCE公司，先使用DMSO溶解后再用培養(yǎng)液稀釋至工作濃度（DMSO體積分數(shù)≤0.001）；ECL發(fā)光液購自美國Milipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 準備10 cm培養(yǎng)皿若干，倒入D-Hanks溶液后置于冰盒上備用。用異氟烷氣體麻醉健康SD大鼠（孕18 d），以體積分數(shù)0.75乙醇消毒后脫頸處死，在無菌環(huán)境中取出胎鼠并置于備好的培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下剝離胎鼠大腦皮質(zhì)后暫存于含DMEM培養(yǎng)液的15 mL離心管中。全部剝離結(jié)束后，將離心管置于離心機中，以1 000 r/min離心5 min，取出離心管，吸棄上清，加入0.5 g/L胰蛋白酶溶液1 mL，吹打均勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化20 min，然后按1∶1的比例加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化?；旌弦航?jīng)70 μm細胞濾網(wǎng)過濾后以1 000 r/min離心10 min，吸棄上清，加入神經(jīng)元培養(yǎng)液，反復緩慢吹打，待均勻懸浮后進行細胞計數(shù)。最后將細胞接種于提前6 h用稀釋的多聚賴氨酸（1×）包被的孔板中，此后每間隔3 d更換1次神經(jīng)元培養(yǎng)液。神經(jīng)元培養(yǎng)液按照Neurobasal Medium∶B-27 Supplement（50×）∶青霉素-鏈霉素雙抗（100×）∶glutaMax（100×）=100∶2∶1∶1的比例配制。細胞48孔板接種密度為3×105/cm2，6孔板接種密度為20×105/cm2。

1.2.2 實驗分組 為了探討不同濃度SSM對OGD損傷神經(jīng)元存活率的影響，實驗分為Control組、OGD組、OGD+不同濃度（1、5、25、50、75 μmol/L）SSM組。為了探討最適濃度SSM對OGD損傷神經(jīng)元p-Akt、Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達的影響，實驗分為Control組（A組）、OGD組（B組）、OGD+SSM組（C組）、OGD+SSM+LY294002組（D組），25 μmol/L SSM和20 μmol/L LY294002在復氧時加入。

1.2.3 OGD損傷模型制備 提取的原代神經(jīng)元培養(yǎng)8 d后進行OGD損傷模型制備，制備方法參照相關(guān)文獻［14］。Control組神經(jīng)元加入含糖細胞外液后置于37 ℃正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，OGD組及其他處理組神經(jīng)元加入等體積無糖細胞外液后置于厭氧箱（溫度37 ℃，含體積分數(shù)0.01 O2+體積分數(shù)0.94 N2+體積分數(shù)0.05 CO2）中進行培養(yǎng)，1.5 h后均更換為正常神經(jīng)元培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)箱中復糖復氧6 h。

1.2.4 CCK-8法檢測神經(jīng)元存活率 復糖復氧時加入不同濃度（1、5、25、50、75 μmol/L）SSM，24 h后檢測神經(jīng)元的存活率，更換神經(jīng)元培養(yǎng)液并加入10%體積的CCK-8溶液，37 ℃避光孵育2～4 h，用酶標儀測定450 nm波長下的吸光度，以此反映細胞存活率。

1.2.5 免疫印跡法檢測氧化應激相關(guān)蛋白的表達

各組在復糖復氧6 h時提取細胞蛋白，所有操作均在冰上進行。用RIPA裂解液裂解細胞后將其刮取至離心管中，在4 ℃下以12 000 r/min離心10～15 min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度，用裂解液和上樣緩沖液配平，100 ℃預變性10 min，冷卻后于-80 ℃保存。配制100 g/L的10孔SDS聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離每孔8 μg的蛋白，以300 mA、90 min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。膜用含50 g/L脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜，所用一抗包括p-Akt抗體、Akt抗體、β-actin抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體（均1∶2 000稀釋）。次日以TBST溶液洗滌3次，每次10 min，加二抗室溫孵育1 h后重復洗滌3次，用ECL發(fā)光液顯影。相同或相近分子量的蛋白經(jīng)膜洗脫再生后重新孵育。用Image J軟件定量分析蛋白條帶的灰度值，蛋白的表達水平以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值表示。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)? 果

2.1 不同濃度SSM對OGD損傷神經(jīng)元存活率的影響

Control組、OGD組以及OGD+不同濃度（1、5、25、50、75 μmol/L）SSM組的神經(jīng)元存活率分別為（90.62±4.73）%、（46.63±3.72）%、（57.64±6.97）%、（60.90±6.63）%、（65.12±6.73）%、（57.53±

4.68）%和（58.55±4.64）%（n=6）。與Control組相比，OGD組神經(jīng)元存活率下降，不同濃度的SSM處理均可增加OGD損傷后神經(jīng)元的存活率（F=35.93，P<0.01），其中以25 μmol/L的SSM作用最明顯。

2.2 SSM對OGD損傷后神經(jīng)元氧化應激相關(guān)蛋白表達的影響

免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，各組氧化應激相關(guān)蛋白p-Akt、Nrf2、HO-1的表達差異有統(tǒng)計學意義（F=23.47～32.21，P<0.01）。與OGD組相比較，OGD+SSM組p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白的表達量均顯著上調(diào)（P<0.05）；與OGD+SSM組相比較，OGD+SSM+LY294002組p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白上調(diào)均被抑制（P<0.05）。各組Akt比較差異無顯著性（P>0.05）。見圖1、表1。

3 討? 論

卒中占全球死亡人數(shù)的9%，是繼缺血性心臟各組p-Akt、Nrf2、HO-1表達比較，F(xiàn)=23.47～32.21，P<0.01。與A組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與B組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與C組比較，#P<0.05，##P<0.01。

病之后的第二大死因，其特點是致死率和致殘率高［15］。目前卒中的治療方法有限，有效和安全的藥物仍有待開發(fā)［16］。從機制上來講，卒中涉及能量衰竭［17］、鈣超載［18］、興奮性氨基酸毒性［19］、線粒體損傷［20］、氧化應激和炎癥反應等多種復雜的病理生理過程。

氧化應激被認為是缺血性腦損傷發(fā)病的關(guān)鍵機制之一，并伴隨著凋亡、炎癥等其他病理變化［21］。

近年來，氧化應激被認為是ROS增加與機體抗氧化保護系統(tǒng)失平衡，越來越多的研究結(jié)果表明，抑制氧化應激有助于控制疾病的進展［22-23］。在正常的生理條件下，Nrf2與細胞質(zhì)中的天然抑制劑Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1結(jié)合，以保持活性的穩(wěn)定性［24］。PI3K/Akt信號通路被激活會導致Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1釋放并激活Nrf2，隨后，激活的Nrf2移位到細胞核，結(jié)合啟動子區(qū)的抗氧化反應元件序列，啟動包括HO-1和NQO1在內(nèi)的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄［25-26］，轉(zhuǎn)錄生成的抗氧化分子通過各種酶催化反應保護細胞免受氧化應激損害［27］。

SSM以其抗氧化和抗炎特性而聞名［28］，可通過抑制炎癥和氧化應激改善大鼠腎毒性［29-30］，通過抑制ROS誘導的成骨細胞凋亡保護股骨頭從而避免發(fā)生骨壞死［31］，通過降低離子鈣結(jié)合適配器分子1、環(huán)氧合酶2等炎癥和氧化應激標記物在缺血性腦損傷小鼠模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用［32］。本研究旨在探討SSM在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元OGD損傷中是否具有神經(jīng)保護作用。結(jié)果顯示，與Control組相比較，OGD損傷顯著降低了神經(jīng)元存活率，而不同濃度的SSM均能夠提高OGD損傷后的神經(jīng)元存活率，并在25 μmol/L時達到峰值，驗證了SSM的神經(jīng)保護作用。近期有研究顯示，在潰瘍性結(jié)腸炎中，給予SSM后，小鼠結(jié)腸組織的相關(guān)癥狀得到顯著改善，并且觀察到激活的Akt和增強的Nrf2信號，表明該保護作用與Akt/Nrf2信號通路有關(guān)［33］。PI3K/Akt信號通路激活后可以調(diào)節(jié)神經(jīng)退行性疾病、卒中等多種疾病［34］，并且在氧化應激中發(fā)揮重要作用［35］。Nrf2在調(diào)控ROS中起關(guān)鍵作用，能夠維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，也是治療卒中和炎癥相關(guān)疾病的潛在靶點［36-37］。在腦卒中的機制研究中，已證實有多種藥物通過介導PI3K/Akt/Nrf2信號通路保護神經(jīng)元免受氧化應激損傷［38-40］。本研究采用P13K/Akt信號通路抑制劑LY294002來探討SSM是否也能通過上述通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。結(jié)果顯示，SSM能夠上調(diào)OGD損傷后p-Akt以及Nrf2蛋白的表達，進而促進下游抗氧化蛋白HO-1的表達，隨著LY294002抑制Akt的磷酸化，Nrf2的激活也被抑制。這表明SSM的神經(jīng)保護作用依賴于PI3K/Akt/Nrf2信號通路。

綜上，在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元OGD損傷中SSM可以通過介導PI3K/Akt/Nrf2信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，這為缺血性腦損傷的治療開辟了新的視角，提供了潛在的治療策略。但本研究未探討單獨給予SSM是否影響p-Akt、Akt、Nrf2、HO-1的表達，同時本研究僅初步探討了SSM在細胞層面的作用及可能的信號機制，未進一步檢測NQO1等其他氧化應激蛋白的變化趨勢，這些不足有待在今后的研究中加以改進。

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（本文編輯 馬偉平）