向日葵染色體核型特征及rDNA 分布分析

馬 琴，王祉諾，琚 銘，秦靈靈，張戰(zhàn)有，張海洋，牛慶杰，苗紅梅

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省油料作物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 白城 137000）

向日葵（Helianthus annuusL.，2n=34）屬菊科（Asteraceae）向日葵屬（Helianthus），是世界上重要的特色優(yōu)質(zhì)油料作物。向日葵又名西番蓮、轉(zhuǎn)日蓮、西番菊和朝陽(yáng)花，原產(chǎn)于北美洲南部和墨西哥北部（30°～40°N）。當(dāng)前全球向日葵種植面積超過(guò)2 300 萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量達(dá)到3 200 萬(wàn)t；我國(guó)年種植向日葵933 萬(wàn)hm2，年產(chǎn)260 萬(wàn)t，其是僅次于油菜和花生的重要油料作物[1-3]。向日葵屬共包括49 個(gè)種和19 個(gè)亞種，染色體組包括二倍體（2n=2x=34）、四倍體（2n=4x=68）和六倍體（2n=6x=102）3類，染色體組特征變化較大[4]。普通向日葵（H.annuusL.）染色體組為二倍體（2n=2x=34），是唯一用于大面積種植的栽培種。相對(duì)于芝麻（2n=26，369 Mb）[5]、胡麻（2n=30，373 Mb）[6]等特色油料作物，向日葵染色體數(shù)目多（2n=34）、基因組大（3.6 Gb）[7]，基因組育種研究難度也較大。

向日葵染色體屬中等染色體類，不同染色體間形態(tài)相似。為揭示向日葵物種特征特性，GEORGIEVA 等[8]采用壓片法對(duì)向日葵的2 個(gè)同源四倍體品種進(jìn)行核型分析發(fā)現(xiàn)，向日葵染色體大小介于3.49～6.54 μm，核型特征為2n=68=14m+10sm+6st+4sat。GEORGIEVA[9]對(duì)向日葵H.salicifolinsA.Pietr 的分析顯示，其核型特征為2n=11sm+4st+2sat。20 世紀(jì)80 年代以來(lái)，我國(guó)相繼開(kāi)展了向日葵核型相關(guān)研究[10-15]。劉惠榮等[10]研究了3 個(gè)栽培種，認(rèn)為不同栽培種向日葵在染色體分組組成、具隨體的染色體數(shù)目等方面均有明顯差異。李懋學(xué)[11]對(duì)向日葵進(jìn)行了核型分析，確定了向日葵的核型公式：2n=34=16m+8sm（4sat）+10st（2sat）。閆素麗等[12]對(duì)內(nèi)葵雜3 號(hào)的三交種和單交種分別進(jìn)行了核型分析，確定了三交種核型：2n=2x=34=32m+2sm（2sat），為1A類型；單交種核型：2n=2x=34=34m（2sat），為1B 類型。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，栽培種向日葵不同種質(zhì)在染色體核型特征上具有較大差異[8-15]。上述研究均采用壓片技術(shù)開(kāi)展向日葵染色體特征分析，染色體形態(tài)和特征受壓片質(zhì)量、染色體形成時(shí)期及基因型的共同影響。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后采用熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)，開(kāi)展向日葵染色體組結(jié)構(gòu)和rDNA 分布特征研究[16-22]。CUELLAR 等[16]選 用HA89 進(jìn) 行rDNA FISH 研 究 發(fā)現(xiàn)，向日葵染色體中共有3 對(duì)染色體帶有45S rDNA雜交信號(hào)，推斷為隨體染色體。SCHRADER 等[19]、高猛等[20]的研究結(jié)果表明，在17 對(duì)染色體中，共有3對(duì)染色體帶有45S rDNA，2對(duì)染色體帶有5S rDNA。但也有報(bào)道認(rèn)為，栽培種向日葵含有4 對(duì)隨體染色體[17-18]。

鑒于染色體制片技術(shù)對(duì)向日葵染色體核型、結(jié)構(gòu)特征及rDNA FISH 信號(hào)分辨率均有不同程度的影響[21-22]，為進(jìn)一步明確栽培種向日葵染色體核型和結(jié)構(gòu)特征，推動(dòng)向日葵細(xì)胞遺傳學(xué)研究進(jìn)程，擬以我國(guó)向日葵主推品種白葵雜6 號(hào)為材料，采用改進(jìn)的酶解去壁低滲法和染色體涂片技術(shù)[21-23]，開(kāi)展向日葵染色體形態(tài)觀察和核型分析。同時(shí)，采用自主建立的高效向日葵FISH技術(shù)，開(kāi)展栽培種向日葵rDNA 分布特征分析，以期為后續(xù)深入開(kāi)展向日葵染色體組結(jié)構(gòu)和物種進(jìn)化研究提供技術(shù)基礎(chǔ)和信息參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

油用型向日葵雜交種白葵雜6 號(hào)（H-01A×RHA-K，吉審葵2002001），以自選不育系H-OlA 為母本、恢復(fù)系RHA-K 為父本雜交育成，由吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院向日葵研究所提供。

1.2 根尖細(xì)胞染色體制備

選取健康向日葵成熟種子，用75%乙醇滅菌30 s，以無(wú)菌水沖洗2 次后，用3%次氯酸鈉滅菌15 min。再以無(wú)菌水沖洗6次，播種于鋪有3層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃暗培養(yǎng)至根長(zhǎng)約1.5 cm。

染色體制備參考ZHAO 等[21]、趙瑞紅等[22]的方法，并根據(jù)向日葵根尖組織發(fā)育特性進(jìn)行了改進(jìn)。切取4～5 mm 根尖組織（含分生區(qū)部位），置于0.002 mol/L 的8-羥基喹啉溶液中，21 ℃暗處理6 h。采用固定液（無(wú)水甲醇∶冰乙酸=3∶1）于4 ℃固定1 h 以上。蒸餾水清洗根尖后，切取根尖分生區(qū)（約1 mm），低滲處理20～30 min。然后使用2.5%混合酶液（2.5%纖維素酶和2.5%果膠酶1∶1 混合），37 ℃黑暗條件下酶解2.5 h。使用蒸餾水洗去酶液后，低滲處理20～30 min。隨后，轉(zhuǎn)入固定液（無(wú)水甲醇∶冰乙酸=3∶1），4 ℃固定1 h以上。將處理后的根尖置于預(yù)冷（4 ℃）干凈玻片上，用眼科細(xì)鑷子頭對(duì)準(zhǔn)根尖迅速敲打破碎，制成細(xì)胞懸液；滴加少量固定液，使懸液充分分散于玻片上，自然晾干。采用20×吉姆薩染液染色15 min，流水沖洗，晾干用于染色體觀察。

1.3 核型分析

在DFC 2500（萊卡，德國(guó)）顯微鏡下（10×和40×）觀察染色體。挑取30個(gè)染色體形態(tài)中期、清晰且分散較好的染色體組，在DM6000B顯微鏡（萊卡，德國(guó)）100×油鏡下，進(jìn)行染色體拍照。從質(zhì)量較好的染色體照片中選取5 組，用CW4000 核型分析軟件（萊卡，德國(guó)）測(cè)定供試材料的染色體短臂、長(zhǎng)臂及總長(zhǎng)等參數(shù)。按照李懋學(xué)等[24]的方法計(jì)算核型公式、核型不對(duì)稱系數(shù)、臂比值、染色體相對(duì)組成等核型參數(shù)。采用Microsoft Excel 2020 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并制作核型模式圖[25]。

1.4 rDNA探針制備

45S rDNA 和5S rDNA 探針為寡核苷酸探針，參照已公布的擬南芥保守序列[26-27]合成。序列分別為5′-TCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′（45S rDNA）和5′-CTGATGGGATCCGGTACTTT-3′（5S rDNA），分別在5′端進(jìn)行FAM（羧基熒光素，綠色熒光）和TAMRA（5-羧基四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯，紅色熒光）標(biāo)記，用于FISH分析。

1.5 rDNA FISH雜交

1.5.1 探針制備 將以熒光標(biāo)記標(biāo)記過(guò)的rDNA 探針用無(wú)菌雙蒸水溶解，制備5 ng/μL 雙探針溶液，直接用于染色體FISH雜交。

1.5.2 染色體雜交預(yù)處理 挑選中期、分散較好且無(wú)細(xì)胞質(zhì)背景的染色體玻片，在Nikon 80i熒光顯微鏡（尼康，日本）下，用玻璃刀標(biāo)記出目的染色體位置，同時(shí)記錄顯微鏡坐標(biāo)位置。將染色體玻片浸于45%冰乙酸中30 s，褪去吉姆薩染液，自然晾干。在玻片標(biāo)記區(qū)加70%去離子甲酰胺200 μL，72 ℃變性2.5 min；將變性后玻片依次用70%、85%、100%乙醇（-20 ℃保存）梯度脫水，每次5 min。自然晾干后用于FISH雜交。

1.5.3 rDNA 雜交 在玻片標(biāo)記區(qū)加7 μL 的rDNA探針工作混合液（含3.5 μL 的45S rDNA 和3.5μL 的5S rDNA 探針），加上蓋片，封膠；37 ℃黑暗雜交4 h以上。

1.5.4 信號(hào)檢測(cè) 室溫避光下，采用2×SSC 浸泡玻片；洗去蓋片后，用含0.1%SDS 的2×SSC 浸洗3 次，每次5 min；蒸餾水沖洗1 遍后避光晾干。在玻片標(biāo)記區(qū)滴入4 μL含4 μg/mL DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）的Vectashield H1000（抗熒光淬滅封片劑）溶液復(fù)染，加蓋片置于Nikon 80i熒光顯微鏡下。根據(jù)坐標(biāo)記錄找到標(biāo)記的目的染色體，在冷光源CCD下進(jìn)行雜交信號(hào)觀察和圖像采集。采用Spot Rtke 4.1軟件進(jìn)行圖像合成；利用Adobe Photoshop CS5軟件對(duì)圖像進(jìn)行亮度和對(duì)比度調(diào)整。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體形態(tài)觀察

為揭示向日葵栽培種染色體特征，采用改良的酶解去壁低滲法進(jìn)行向日葵染色體涂片，獲得了分散良好的中期染色體相（圖1）。從圖1 可以看出，向日葵根尖各細(xì)胞中有34 條染色體，各染色體清晰，體態(tài)較為相似。在DM6000B 顯微鏡（萊卡，德國(guó)）100×油鏡下，可清晰看到，白葵雜6 號(hào)染色體組中共有6 條（隨體）染色體，即3 對(duì)染色體帶有隨體（圖中黃色箭頭）。

2.2 核型分析

為明確向日葵栽培種核型特征，選取5 張清晰的染色體中期圖片，使用CW4000 軟件進(jìn)行核型特征統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，向日葵白葵雜6 號(hào)的染色體數(shù)目為34 條。染色體長(zhǎng)度介于3.87～5.37 μm。染色體臂比值大于2 的染色體數(shù)量為0，最長(zhǎng)染色體與最短染色體的比值為1.39。核型公式為2n=2x=34=32m+2M，表明向日葵染色體的著絲點(diǎn)位置均位于中部（m）或正中部（M）。染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為16M2+18M1，表明向日葵染色體為中長(zhǎng)（M2）和中短染色體（M1），各染色體長(zhǎng)度之間存在不同程度的差異。樣本核型不對(duì)稱系數(shù)根據(jù)李懋學(xué)等[24]的方法（AS.K=長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)×100%）計(jì)算后為50.51%，核型屬于1A 類型。從核型對(duì)稱性看，向日葵樣本的染色體核型為最對(duì)稱核型。

表1 栽培種向日葵白葵雜6號(hào)核型參數(shù)Tab.1 Karyotype parameters of cultivated sunflower Baikuiza No.6

隨后，依據(jù)表1 數(shù)據(jù)及rDNA FISH 結(jié)果繪制出了白葵雜6 號(hào)染色體的標(biāo)準(zhǔn)模式圖（圖2）。染色體編號(hào)按染色體總長(zhǎng)順序排列（隨體長(zhǎng)度不計(jì)算在內(nèi)）。在白葵雜6 號(hào)樣本的34 條體細(xì)胞染色體中，共有32 條染色體為中部著絲點(diǎn)染色體（m），2 條染色體為正中部著絲點(diǎn)染色體（M）。6 條染色體帶有45S rDNA，分別分布在第5、9、13 對(duì)染色體上（標(biāo)記綠色）。2 對(duì)染色體上帶有5S rDNA，分別分布在第5、7對(duì)染色體上（標(biāo)記紅色）。

圖2 栽培種向日葵白葵雜6號(hào)核型模式圖Fig.2 Karyotype diagram of cultivated sunflower Baikuiza No.6

2.3 染色體FISH雜交分析

為進(jìn)一步確定向日葵隨體染色體數(shù)量和rDNA分布特征，選用植物通用的45S rDNA 和5S rDNA 序列（擬南芥），合成、制作了rDNA FISH 雜交探針，并進(jìn)行了雙色熒光標(biāo)記。借助于自主構(gòu)建的高效向日葵染色體雙色FISH原位雜交技術(shù)，進(jìn)行了白葵雜6 號(hào)染色體的45S 和5S rDNA FISH 雜交（圖3）。結(jié)果表明，共有3 對(duì)染色體顯示有45S rDNA 雜交信號(hào)（圖3b）。與鏡下觀察到的隨體染色體數(shù)目一致。有2對(duì)染色體帶有5S rDNA雜交信號(hào)（圖3c）。

進(jìn)一步進(jìn)行了圖片合成處理（圖3d）。可以看出，3 組45S rDNA 的雜交信號(hào)均位于染色體的短臂末端（綠色）；5S rDNA 雜交信號(hào)位于染色體短臂端部（紅色）。雜交信號(hào)位置顯示，有1 對(duì)染色體（第5對(duì)）同時(shí)出現(xiàn)5S rDNA 和45S rDNA 雜交信號(hào)。比較上述帶有rDNA 的4 對(duì)染色體，發(fā)現(xiàn)45S rDNA 和5S rDNA 在不同染色體上的雜交信號(hào)強(qiáng)度及雜交位置存在一定的差異（圖3d）。因此，rDNA FISH 可以用于區(qū)分特異染色體對(duì)。

圖3 栽培種向日葵白葵雜6號(hào)45S rDNA和5S rDNA雜交位點(diǎn)及分布Fig.3 Hybridization loci and chromosome distribution of 45S and 5S rDNAs in sunflower Baikuiza No.6

3 結(jié)論與討論

本研究采用自主構(gòu)建的向日葵染色體涂片法和高效雙色染色體FISH技術(shù)，分析了栽培種向日葵白葵雜6 號(hào)的染色體核型和rDNA 分布特征。白葵雜6 號(hào)染色體為中等染色體，長(zhǎng)度介于3.87～5.37 μm。核型公式為2n=2x =34=32m+2M。絕大部分染色體著絲點(diǎn)集中在中部區(qū)域，核型為1A，屬最對(duì)稱核型。在17 對(duì)染色體中，3 對(duì)染色體（第5、9、13 對(duì)染色體）攜帶有45S rDNA，熒光信號(hào)分布在染色體短臂末端；2 對(duì)染色體（第5、7 對(duì)染色體）攜帶有5S rDNA，熒光信號(hào)分布在染色體短臂端部；1對(duì)染色體（第5 對(duì)染色體）同時(shí)攜帶有45S rDNA 和5S rDNA。45S rDNA 和5S rDNA 在4 對(duì)染色體上的雜交信號(hào)差別明顯，可以用于區(qū)分特異染色體對(duì)。

染色體核型研究是分析物種染色體組數(shù)量、形態(tài)及結(jié)構(gòu)變異特征的基礎(chǔ)，是探尋物種起源與進(jìn)化關(guān)系的重要依據(jù)[28-31]。為制作高質(zhì)量染色體制片，確保核型分析質(zhì)量，本研究借鑒了去壁低滲法[21-23]，將改良的染色體涂片方法用于向日葵染色體制片和核型分析。與傳統(tǒng)的卡寶品紅染色及壓片技術(shù)方法[12-14]相比，采用改良涂片法較易捕獲處于中期相的向日葵染色體樣本。在平邑甜茶、燕麥、薔薇屬物種等染色體研究中，去壁低滲法因優(yōu)于壓片法被推薦使用[32-34]。本研究鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)向日葵樣本制片中，染色體形態(tài)清晰，各染色體分散較開(kāi)，自然舒展，便于觀察和統(tǒng)計(jì)。3對(duì)隨體染色體形態(tài)好，特征明顯。以往報(bào)道顯示，栽培種向日葵染色體長(zhǎng)度介于3.07～8.13 μm[9-15]。本研究采用改良的涂片法制備出了高質(zhì)量向日葵染色體制片，染色體長(zhǎng)度介于3.87～5.37 μm，屬于中等染色體。與常規(guī)制片技術(shù)測(cè)定結(jié)果相比，改良涂片法制備下的各染色體長(zhǎng)度之間的差異不明顯，染色體形態(tài)完整、清晰，隨體染色體可見(jiàn)，染色體大小均等，更適于核型分析和FISH雜交研究。

本研究分析確定白葵雜6號(hào)的染色體主要由中部著絲粒型染色體和正中部著絲粒型染色體組成，染色體較對(duì)稱，結(jié)果與閆素麗等[12]、劉惠榮等[10]等報(bào)道的栽培種向日葵核型特征較為一致。向日葵屬不同種在染色體數(shù)目、核型、結(jié)構(gòu)特征等方面具有多樣性[8，17]。GEORGIEVA 等[8]研究了向日葵2 個(gè)不同種的染色體核型，確定H.brisutus和H.decapetalus均含有4 對(duì)隨體染色體。SUHAILEH[35]觀察了4 個(gè)向日葵品種，確定栽培種向日葵具3對(duì)隨體染色體。

隨體染色體被認(rèn)為是富含核糖體DNA（45S rDNA）的染色體。45S rDNA 是串聯(lián)的多基因家族，在植物進(jìn)化過(guò)程中保守性很強(qiáng)[36]。45S rDNA 通常存在于隨體染色體上，在一些非隨體染色體上的拷貝數(shù)較少[37]。因此，可以利用隨體數(shù)量和位置輔助判斷物種的染色體倍性和進(jìn)化[38]。另一方面，5S rDNA 的位點(diǎn)數(shù)量和分布則多與染色體倍性相關(guān)。45S 和5S rDNA 可以用于植物染色體特別是微小染色體組的區(qū)分和鑒別[39]。針對(duì)栽培種向日葵，已報(bào)道的隨體染色體數(shù)目在0～4 對(duì)。李懋學(xué)[11]觀察發(fā)現(xiàn)，向日葵（未標(biāo)明種屬）有1 對(duì)隨體染色體。劉惠榮等[10]觀察了3 個(gè)向日葵樣本，認(rèn)為阿爾及利亞第6、16 對(duì)染色體為隨體染色體，北葵15 的第6、13、16 對(duì)染色體為隨體染色體，市售材料僅第6 對(duì)染色體為隨體染色體。CUELLAR 等[16]、CECCARELLI等[18]、SCHRADER 等[19]觀察向日葵自交系HA89，均確定該材料具有3 對(duì)隨體染色體。閆素麗等[12]和高猛等[20]的研究表明，內(nèi)葵雜3 號(hào)三交種和單交種各具有1對(duì)隨體。丁海燕等[13]在龍葵雜10號(hào)中未發(fā)現(xiàn)有隨體現(xiàn)象。馬軍等[14-15]在龍葵雜8 號(hào)中未發(fā)現(xiàn)有隨體現(xiàn)象，而在油用矮大頭中發(fā)現(xiàn)2 對(duì)隨體（第7、15號(hào)染色體）。

近年來(lái)，為探明染色體類型和隨體染色體數(shù)目，先后在小麥[40-41]、芝麻[21]、黃花菜[42]、葫蘆科植物[43]、班茅[44]等多種復(fù)雜植物及小染色體植物上開(kāi)展了rDNA 定位和染色體組特征分析。針對(duì)向日葵二倍體野生種和栽培種，WILSONBM 等[45]開(kāi)展了45S rDNA 位點(diǎn)分析，確定二倍體野生種H.debilis、H.praecox和H.nuttallii（2n=34）中有2 對(duì)染色體帶有45S rDNA。栽培種（H.annuus）含有3 對(duì)45S rDNA主要雜交位點(diǎn)和1 對(duì)較弱rDNA 位點(diǎn)。SCHRADER等[19]和CUELLAR 等[16]分別開(kāi)展的染色體rDNA雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5S rDNA 雜交信號(hào)出現(xiàn)在2 對(duì)向日葵染色體的短臂末端，其中1 對(duì)較強(qiáng)，另1 對(duì)較弱。此外，有1 對(duì)5S rDNA 雜交信號(hào)同時(shí)出現(xiàn)在了隨體染色體上，并與45S rDNA 雜交信號(hào)的位置接近[19]。本研究結(jié)果證實(shí)，栽培種向日葵含有3對(duì)隨體染色體。在17 對(duì)染色體中，共4 對(duì)染色體帶有rDNA，不同染色體上的雜交信號(hào)強(qiáng)度和位置有一定差異。該結(jié)果與高猛等[20]、SCHRADER 等[19]以及CUELLAR 等[16]的分析結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，本研究采用的高效染色體制備技術(shù)和FISH 技術(shù)，其研究結(jié)果可靠，可為后續(xù)向日葵染色體組學(xué)研究，推進(jìn)向日葵野生種利用、遠(yuǎn)緣雜交育種和基因組育種進(jìn)程提供技術(shù)基礎(chǔ)和信息參考。