犬腺病毒研究進(jìn)展

廖均樂，孫春艷，劉彩紅，崔寧寧，劉玉秀，田克恭, 張?jiān)S科

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046 ； 2. 國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000 ；3. 天津市乖乖寵物醫(yī)院，天津 河?xùn)| 300000)

犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)分為2個(gè)血清型，犬腺病毒1型(Canine adenovirus 1，CAV-1)主要引起犬急性敗血性肝炎，熊和狐貍腦炎；犬腺病毒2型(Canine adenovirus 2，CAV-2)主要引起犬科動(dòng)物傳染性喉氣管炎和傳染性腹瀉等。CAV是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物腺病毒屬中致病性強(qiáng)、感染動(dòng)物廣的雙股DNA病毒之一，該病毒在全世界范圍內(nèi)普遍存在，給當(dāng)今犬養(yǎng)殖業(yè)及相關(guān)毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益造成重大損失，并危害動(dòng)物健康，引起了世界各國的高度重視。本文從犬腺病毒的生物學(xué)特性、流行病學(xué)、致病機(jī)制、臨床癥狀和病理變化、疫苗研究進(jìn)展等方面進(jìn)行概述，從而對(duì)腺病毒有更加全面的認(rèn)識(shí)和了解，為深入研究犬腺病毒提供參考。

1 犬腺病毒生物學(xué)特征

1.1 分類 1925年Green等[1]首次從患有腦炎的狐貍中發(fā)現(xiàn)CAV-1，直到1962年，Dithfield等[2]從暴發(fā)傳染性喉氣管的患犬中分離獲得CAV，初期認(rèn)為該分離株是CAV-1的弱毒株，后經(jīng)證實(shí)為CAV-2[3-7]。CAV-1和CAV-2均屬于腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬，二者在抗原和基因上緊密相關(guān)，核苷酸同源性為75%[8,9]，CAV-1和CAV-2在血凝性和病毒的組織嗜性方面有明顯區(qū)別，CAV-1和CAV-2均可凝集人“O”型紅細(xì)胞和白化病毒大鼠的紅細(xì)胞，同時(shí)CAV-1還可以凝集豚鼠和雞的紅細(xì)胞，但CAV-2不能凝集豚鼠和雞的紅細(xì)胞[10]。CAV-1主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中增殖，CAV-2主要在呼吸道上皮和腸上皮內(nèi)進(jìn)行復(fù)制[11-13]。

1.2 病毒的形態(tài)特征和理化特性 CAV是一種雙鏈無囊膜的DNA病毒，直徑為80 nm左右，呈二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，其基因組長30～31 kb，呈線狀盤曲于衣殼之中，根據(jù)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)間可將其分為E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4和L1～5區(qū)等，分別編碼纖維蛋白、五鄰體、六鄰體和衣殼等結(jié)構(gòu)蛋白。其中犬腺病毒E1區(qū)為病毒復(fù)制必需區(qū)，E1區(qū)缺失后的重組CAV載體必須在特殊的工程細(xì)胞中或非缺失的腺病毒輔助下才能復(fù)制增殖；而在 E3 區(qū)插入外源基因構(gòu)建的CAV載體為復(fù)制非依賴型載體，該載體在體內(nèi)各器官和細(xì)胞中均能自動(dòng)復(fù)制和表達(dá)外源蛋白，被廣泛應(yīng)用于診斷抗原制備、蛋白特征和載體疫苗的研究[14]。

CAV抵抗力較強(qiáng)，能抵抗熱、干燥等極端條件，且對(duì)乙醚、膽酸鹽、氯仿等脂溶劑皆不敏感。CAV在4 ℃可存活6～9個(gè)月，在-20 ℃仍保持活性并長期存活，56 ℃加熱可使其喪失活性。在極度寒冷的地區(qū)，糞便中的CAV仍可保持活性長達(dá)200 d左右。CAV的適宜pH為2～5，在pH小于2或大于10的環(huán)境中均不穩(wěn)定，但其可在適宜pH的胃腸道中繼續(xù)保持活性。

2 犬腺病毒流行病學(xué)

CAV-1感染范圍廣，除了可以感染狐貍和犬外，還可以感染狼、黑熊、貉、負(fù)鼠、山狗和臭鼬，其中負(fù)鼠、貉、狼、山狗和臭鼬臨床表現(xiàn)出肝炎癥狀，黑熊則發(fā)生腦炎，該病毒感染給犬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，同時(shí)對(duì)自然物種的多樣性帶來巨大的危害[15]。犬肝炎的主要傳染源包括患病動(dòng)物和發(fā)病后恢復(fù)健康的動(dòng)物。病毒可通過眼鼻分泌物、尿液、糞便等排出體外，且在康復(fù)動(dòng)物的尿液中排毒時(shí)間可長達(dá)半年，污染飼料、用具以及周圍環(huán)境等。不同品種、日齡、性別的犬都可感染發(fā)病，其中1歲以下的動(dòng)物發(fā)病最為嚴(yán)重，尤其是剛剛斷乳的幼仔，可發(fā)生急性感染。

CAV-2主要感染幼犬、狐貍、狼等，引起喉氣管炎、肺炎等。4月齡以下的幼犬感染尤為嚴(yán)重，常與犬瘟熱病毒、波氏桿菌混合感染，引起犬窩咳，在冬季發(fā)病最為明顯。

當(dāng)今各個(gè)國家和地區(qū)都有CAV感染的發(fā)生，其中感染導(dǎo)致犬傳染性肝炎最為普遍，傳播最廣[15]。

3 犬腺病毒致病機(jī)制

CAV-1從鼻咽和口腔黏膜進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，然后在免疫器官中增殖，如扁桃體和腸系膜淋巴結(jié)等，隨后進(jìn)入血液中經(jīng)血液循環(huán)在機(jī)體內(nèi)廣泛散播，造成毒血癥，同時(shí)對(duì)體內(nèi)各種靶細(xì)胞造成感染，如肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和多種組織器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞。犬感染CAV-1后肝臟損害最為嚴(yán)重，可出現(xiàn)變性、壞死等退行性變化或慢性肝炎；腎臟可長期排毒，最初CAV-1在腎小球的血管內(nèi)皮細(xì)胞中增殖，引起蛋白尿，隨后CAV-1在腎小管上皮細(xì)胞中增殖，病毒的持續(xù)存在引起局灶性的間質(zhì)性腎炎，據(jù)估計(jì)，大約70%的康復(fù)動(dòng)物會(huì)發(fā)生這種腎炎[16]。在發(fā)病后期，感染犬眼部可發(fā)生短暫的角膜水腫(藍(lán)眼)、葡萄膜炎，偶爾會(huì)導(dǎo)致永久性的眼睛失明[17]。

CAV-2主要感染非纖毛支氣管上皮細(xì)胞，鼻黏膜、咽和扁桃囊窩的上皮細(xì)胞，氣管和支氣管的黏膜細(xì)胞以及2型肺泡上皮細(xì)胞[13]。CAV-2主要感染呼吸道上皮細(xì)胞，引起輕度和急性的上呼吸道癥狀，偶爾出現(xiàn)急性陣發(fā)性咳嗽，主要是由于與其他呼吸道病毒或細(xì)菌合并感染所致。CAV-2還可感染腸道上皮細(xì)胞，引起犬消化道疾病，如嘔吐和腹瀉[18]。由于CAV-2通過黏膜和空氣傳播，其可在缺乏免疫力的犬群中迅速散播。

4 臨床癥狀和病理變化

CAV-1感染可分為最急性、急性和慢性3種類型。自然條件下感染犬的潛伏期一般為6～9 d，人工感染的潛伏期為2～6 d，在感染初期可能表現(xiàn)為最急性型，感染犬在沒有表現(xiàn)任何臨床癥狀的情況下即發(fā)生死亡。急性型病犬初步癥狀為體溫升高(高于40 ℃)，其次精神不振、食欲廢絕、嘔吐、眼鼻分泌物增多，嚴(yán)重者在感染后3～6 d死亡，剖檢瀕死犬可見其血液凝固不良；康復(fù)犬在病程發(fā)展的后期會(huì)出現(xiàn)腹部腫大，觸診腹部疼痛并有波動(dòng)感，可視黏膜黃染，牙齦等處有明顯出血點(diǎn)；患犬在恢復(fù)期會(huì)出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)“藍(lán)眼”，一般持續(xù)2～3 d后自行恢復(fù)。慢性型病例大部分在感染后期發(fā)生，患犬僅出現(xiàn)輕微體溫升高，食欲時(shí)好時(shí)壞，腹瀉、便秘也可發(fā)生，大部分不會(huì)出現(xiàn)死亡，但是生長發(fā)育會(huì)受影響，且有可能長期排毒。流涎、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀在患犬中很少見，但是會(huì)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管損傷[19,20]。CAV-1能夠在許多不同的器官中復(fù)制，出現(xiàn)的臨床癥狀取決于病毒復(fù)制的靶組織。

CAV-2感染犬造成傳染性喉氣管炎的病例，潛伏期為5～6 d，臨床癥狀表現(xiàn)為患犬體溫持續(xù)性升高，有的會(huì)超過40 ℃，隨后出現(xiàn)噴嚏、干咳或濕咳、精神不振和沉郁、食欲廢絕、干嘔或嘔吐、肌肉顫抖、呼吸困難、流漿液或膿性鼻液和膿性或水樣眼分泌物等。CAV-2易與犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和支氣管敗血波氏桿菌等病原混合感染，引起“犬窩咳”，混合感染犬通常會(huì)預(yù)后不良。

CAV-1剖檢變化主要是肝臟發(fā)黃，腫大質(zhì)脆，切面外翻且表面呈顆粒狀；膽囊壁增厚，出血、水腫，膽汁黏稠；脾臟淤血腫大，腹腔有白色或淡黃色透明腹水，少數(shù)會(huì)有淡黃色膠凍樣物質(zhì)；胸腺、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)等出現(xiàn)充血；組織病理學(xué)觀察可見肝細(xì)胞及竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞中有大量的嗜酸性核內(nèi)包涵體，竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞和枯否氏細(xì)胞腫脹，竇狀隙擴(kuò)張淤血；脾臟淤血、出血，淋巴細(xì)胞壞死；膽囊黏膜上皮細(xì)胞大量壞死；腎臟髓質(zhì)淤血，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死；淋巴結(jié)髓質(zhì)大量出血，皮質(zhì)部分淋巴細(xì)胞壞死、崩解等；有的患犬肺臟會(huì)出現(xiàn)局部肺泡隔增寬，其內(nèi)血管淤血、出血等。

CAV-2剖檢變化主要有肺臟膨脹不全、充血，發(fā)生大面積實(shí)變；支氣管淋巴結(jié)充血；喉頭出現(xiàn)出血點(diǎn)或有黏液。組織病理學(xué)觀察可見壞死性支氣管肺炎，肺泡II型上皮細(xì)胞增生，肺泡隔增寬，肺泡腔內(nèi)有大量脫落細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞性滲出物，且上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)核內(nèi)包涵體[17]；喉頭和氣管黏膜上皮細(xì)胞大量脫落至管腔內(nèi)，大量中性粒細(xì)胞浸潤。

5 疫苗研究進(jìn)展

疫苗的使用大大減少了犬傳染性肝炎的發(fā)生，最先開發(fā)并投入使用的是CAV-1滅活疫苗，但該疫苗需要多次反復(fù)接種[21]，隨后CAV-1弱毒苗應(yīng)用于市場，其免疫保護(hù)效果較好，但是經(jīng)過一段時(shí)間的推廣和使用，部分接種過CAV-1弱毒疫苗的犬眼部、腎臟都發(fā)生了病變，造成短暫的“藍(lán)眼”[13]。由于CAV-2和CAV-1具有交叉保護(hù)性，CAV-2弱毒苗可抵抗CAV-1和CAV-2的感染，且能規(guī)避CAV-1弱毒疫苗的缺點(diǎn)，因此目前世界上均采用CAV-2弱毒疫苗用于預(yù)防由CAV-1引起的傳染性肝炎。

在不存在母源抗體的情況下，單劑量皮下或肌內(nèi)注射CAV-2弱毒苗能夠抵抗CAV-1和CAV-2的感染，然而8～10周齡犬存在母源抗體，因此在免疫第1針后，間隔3～4周需加強(qiáng)免疫第2針。CAV-2弱毒苗采用滴鼻的方式接種，能夠降低母源抗體的干擾，但是會(huì)引起犬輕微的呼吸道癥狀[15]。CAV-2相關(guān)疫苗通常在基礎(chǔ)免疫程序完成后，每年需加強(qiáng)免疫1次[22,23]。疫苗的使用能降低發(fā)病率，但犬接種疫苗后仍感染CAV的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[24-26]。而且有報(bào)道指出，狐貍在接種CAV-2相關(guān)疫苗后出現(xiàn)多灶性壞死性支氣管肺炎，經(jīng)檢測是由CAV-2引起的，且分離株與疫苗株同源性為100%[27]。雖然文獻(xiàn)中并未提到疫苗株存在毒力返強(qiáng)，但CAV-2相關(guān)疫苗是減毒的活疫苗，仍需注意毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。

6 展望

隨著經(jīng)濟(jì)的迅速增長和人民消費(fèi)水平的普遍提高，我國已成為養(yǎng)犬?dāng)?shù)量居世界第三的國家，城市養(yǎng)犬?dāng)?shù)量達(dá)2 000余萬只，同時(shí)我國也是山狼、狐貍、負(fù)鼠、熊的主要棲息地。疫苗對(duì)于動(dòng)物病毒性疾病的防控、寵物新興產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、野生動(dòng)物的繁衍和生態(tài)的發(fā)展均起著重要作用。目前，我國用以預(yù)防犬腺病毒的疫苗產(chǎn)品由于毒株背景不清以及在細(xì)胞上傳代次數(shù)較多，免疫原性和安全性均難以保證。此外，我國某些地區(qū)養(yǎng)殖場的犬按照疫苗免疫程序免疫犬四聯(lián)活疫苗后仍會(huì)出現(xiàn)咳嗽等臨床癥狀，經(jīng)檢驗(yàn)為CAV-2感染，分析原因可能是由于國外疫苗株與國內(nèi)野毒株的同源性不高，也有可能是由于疫苗中CAV-2出現(xiàn)毒力返強(qiáng)，確切原因仍需進(jìn)一步研究，但是這一現(xiàn)象應(yīng)引起高度重視。應(yīng)根據(jù)目前我國犬腺病毒的流行情況，分離出具有代表性的野毒株，馴化出適合國內(nèi)使用的弱毒株，從而研發(fā)疫苗在我國推廣使用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，對(duì)CAV-2的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等方面有了更深入的了解，相信研發(fā)出穩(wěn)定、安全、有效的犬腺病毒相關(guān)國產(chǎn)疫苗指日可待。