褪黑素防治病毒性疾病的研究進(jìn)展

古慶悅，李鑫森，徐嘉偉，唐玉玲，孟 迪，胡艷欣

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

褪黑素(Melatonin)是一種胺類(lèi)激素，由色氨酸合成，除松果體和視網(wǎng)膜外，在體內(nèi)組織器官，如骨髓、肝臟、胃腸道、皮膚、卵巢、睪丸、胎盤(pán)等中均可合成褪黑素。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素不僅具有晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)作用，還具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，在抗感染、抗腫瘤，以及治療眼部疾病、胃腸道疾病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本文將從褪黑素的抗病毒作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為褪黑素在臨床抗病毒領(lǐng)域的應(yīng)用提供借鑒。

1 褪黑素的合成與代謝

色氨酸首先被轉(zhuǎn)化為5-羥色氨酸，然后脫羧酶脫氧生成5-羥色胺，隨后在芳基烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶催化下轉(zhuǎn)化為乙酰5-羥色胺，最后通過(guò)羥基吲哚O-甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化生成褪黑素。褪黑素具有明顯的晝夜節(jié)律，其晝夜節(jié)律主要是由于芳基烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在夜間的活性顯著增加導(dǎo)致，但Venegas等發(fā)現(xiàn)，在松果體和視網(wǎng)膜以外的組織器官中合成的褪黑素通常沒(méi)有晝夜節(jié)律的變化，且在除松果體以外的組織器官中合成的褪黑素通常不會(huì)釋放進(jìn)入血液循環(huán)中[1]。由松果體合成的褪黑素會(huì)隨著血液進(jìn)入全身循環(huán)中，褪黑素的代謝半衰期較短，通常為20～60 min，肝臟首過(guò)效應(yīng)較大。除了光周期外，溫度、季節(jié)等因素都可影響褪黑素的產(chǎn)生。褪黑素主要通過(guò)羥基化途徑在肝臟中形成6-羥基褪黑素和葡萄糖醛酸共軛化合物，經(jīng)糞便和尿液排出體外。

2 褪黑素的抗病毒作用

大量研究證實(shí)，褪黑素對(duì)人和動(dòng)物的多種病毒性疾病均有良好的防治作用。

2.1 褪黑素與家畜病毒性疾病 傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和豬三角洲冠狀病毒(Porcine delta coronavirus,PDCoV)等都屬于豬腸道冠狀病毒，可引起仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水等臨床癥狀，迄今為止尚未找到有效的治療藥物，嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)。2021年，Zhai等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可在感染早期有效抑制體外細(xì)胞系中上述3種病毒的mRNA和蛋白表達(dá)，在感染后1 h加入褪黑素可使病毒感染水平下降90%以上[2]。

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)俗稱(chēng)兔瘟，可引起急性肝衰竭(Acute liver failure,AHF)。San-Miguel等通過(guò)腹腔注射20 mg/(kg·bw)褪黑素降低兔肝臟中RHDV mRNA的表達(dá)[3]。褪黑素一方面可抑制RHDV感染引起的肝細(xì)胞自噬的發(fā)生[3]，另一方面還可濃度依賴(lài)性地抑制RHDV感染誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，減少肝細(xì)胞中凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的激活[4]。此外，褪黑素還有助于肝臟的修復(fù)，Laliena等發(fā)現(xiàn)褪黑素對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的分泌以及肝細(xì)胞的修復(fù)起到促進(jìn)作用[5]。

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染可損傷奶牛肝、腦、腎、腸、肺等組織器官，引起神經(jīng)癥狀，導(dǎo)致繁殖能力和產(chǎn)奶量的下降，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大損失。Wang等使用佐劑中含30 mg/mL褪黑素的重組亞單位疫苗免疫小鼠，可以有效提升攻毒保護(hù)效果，降低各組織中BVDV的抗原量，減輕BVDV造成的組織損傷，提升脾臟中CD3+和CD4+淋巴細(xì)胞的數(shù)量[6]。

水貂阿留申病是危害毛皮動(dòng)物的三大疾病之一，是由阿留申水貂病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)感染引起的自身免疫性疾病。Ellis等將含2.7 mg褪黑素的硅膠芯片植入2個(gè)AMDV陽(yáng)性水貂養(yǎng)殖場(chǎng)的水貂體內(nèi)，水貂的自然死亡率分別由3.5%和8.3%降低至0%和3.1%[7]。

2.2 褪黑素與人獸共患病毒性疾病 新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起，目前在全球范圍內(nèi)還未得到有效的控制。Zhou等通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析病毒—宿主相互作用以及藥物靶點(diǎn)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)褪黑素可間接作用于ACE2等多個(gè)冠狀病毒的靶點(diǎn)[8]。Jehi等針對(duì)11 672名出現(xiàn)呼吸道癥狀或者其他高風(fēng)險(xiǎn)因素的患者的臨床調(diào)查顯示，529名有褪黑素服用史的患者的COVID-19陰性率為97.0%(513/529)，顯著高于無(wú)褪黑素服用史的患者的陰性率(92.8%，10 341/11 143)[9]。

委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒(Venezuelan equine encephalomyelitis virus,VEEV)是一種蚊媒病毒，可引起人、馬屬動(dòng)物、嚙齒類(lèi)動(dòng)物等的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞耗竭甚至死亡。褪黑素可延長(zhǎng)VEEV感染小鼠的存活時(shí)間，提升小鼠存活率，降低腦和血液中的病毒水平[10,11]。Bonilla等將褪黑素的使用濃度由250 μg/(kg·bw)提升至1 000 μg/(kg·bw)后，可將VEEV感染小鼠攻毒后6 d的存活率由55%提升至84%[10]。褪黑素可抑制VEEV感染小鼠大腦組織細(xì)胞的凋亡，降低大腦和血清中亞硝酸鹽水平，從而減輕腦部損傷[11]。

A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)可以感染人、豬、雞等多種動(dòng)物，引起呼吸系統(tǒng)疾病。高致病性A型流感病毒誘導(dǎo)的過(guò)度免疫反應(yīng)會(huì)引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，表現(xiàn)為肺組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，使患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征和呼吸衰竭。Huang等研究發(fā)現(xiàn)，大劑量的褪黑素可以顯著提升H1N1感染小鼠的存活率并緩解肺部的病理?yè)p傷，抑制TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎性因子的產(chǎn)生，促進(jìn)IL-10、TGF-β等抗炎因子的產(chǎn)生[12]。

人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)可引起獲得性免疫缺陷綜合征，該疾病的發(fā)生與單核細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生IL-2、IL-12等細(xì)胞因子導(dǎo)致的Th1細(xì)胞應(yīng)答受阻有關(guān)[13,14]。Nunnari等對(duì)77名1型人體免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染者的血清褪黑素水平分析發(fā)現(xiàn)，HIV-1感染者血清IL-12水平與褪黑素水平存在正相關(guān)性，血清中褪黑素水平與HIV-1 RNA水平具有負(fù)相關(guān)性，與體內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量存在正相關(guān)性，其中，C期感染者的血清褪黑素水平顯著低于A期和B期感染者[14]。Lissoni等對(duì)11名患者進(jìn)行臨床研究發(fā)現(xiàn)，低劑量IL-2與褪黑素協(xié)同使用可增加患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞的數(shù)量[15]。

2.3 褪黑素與人類(lèi)病毒性疾病 呼吸道合胞體病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)的致病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，是最常見(jiàn)的引起兒童下呼吸道感染的病因之一。連續(xù)3 d每日2次預(yù)防性給予5 mg/(kg·bw)褪黑素可緩解由RSV感染導(dǎo)致的急性肺氧化損傷，降低感染小鼠肺組織中一氧化氮(Nitric oxide,NO)和羥自由基(Hydroxyl radical,·OH)水平，將谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)恢復(fù)至正常水平[16]。

1型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)會(huì)引起患者口腔、面部感染以及腦炎。Edgar等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)宿主的晝夜節(jié)律受到破壞時(shí)HSV-1的復(fù)制會(huì)顯著增加[17]，提示宿主體內(nèi)的褪黑素水平可能在HSV-1感染中發(fā)揮了重要作用。Nunes等進(jìn)行了一項(xiàng)臨床單盲試驗(yàn)，將褪黑素聯(lián)合SB-73制劑(有效成分主要為鎂離子、PO4-、棕櫚油酸、亞油酸)給藥，與傳統(tǒng)單純皰疹病毒治療藥物阿昔洛韋進(jìn)行對(duì)比研究，在145名患者中，95.7%的褪黑素聯(lián)合SB-73制劑受試患者癥狀完全消失，癥狀持續(xù)時(shí)間的中位數(shù)為2 d，85.3%的阿昔洛韋受試患者癥狀完全消失，癥狀持續(xù)時(shí)間的中位數(shù)為4.9 d；相較于阿昔洛韋受試患者出現(xiàn)腹瀉、頭痛、惡心等不良反應(yīng)，褪黑素聯(lián)合SB-73制劑受試患者僅出現(xiàn)嗜睡的不良反應(yīng)[18]。

3 褪黑素的抗病毒機(jī)制

褪黑素可通過(guò)直接影響病毒的復(fù)制、調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)、抵抗病毒感染造成的氧化損傷等方面發(fā)揮抗病毒作用。

3.1 抑制病毒增殖 研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以通過(guò)影響病毒粒子的感染過(guò)程直接抑制病毒的復(fù)制。Morchang等研究發(fā)現(xiàn)，在登革熱病毒(Dengue virus，DENV)攻毒前或攻毒同時(shí)進(jìn)行褪黑素處理均無(wú)法影響病毒的增殖，但在攻毒后2～14 h進(jìn)行褪黑素處理，病毒滴度顯著下降，細(xì)胞中DENV RNA和NS1蛋白表達(dá)顯著減少[19]。Zhai等發(fā)現(xiàn)，褪黑素盡管不能直接殺滅TGEV、PEDV、PDCoV病毒粒子，也不能影響病毒粒子粘附于細(xì)胞，但可以使內(nèi)化效率降低60%以上[2]。

3.2 免疫調(diào)節(jié)作用 褪黑素可直接影響免疫器官的重量和免疫細(xì)胞的數(shù)量。Haldar等通過(guò)連續(xù)60 d皮下注射褪黑素使倉(cāng)鼠胸腺、脾和腸系膜淋巴結(jié)的重量增加，胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)中胸腺細(xì)胞的密度增加，并提高了外周血中白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)[20]。褪黑素對(duì)禽類(lèi)的免疫器官也能起到相似的效果，注射褪黑素能增加雞外周血中白細(xì)胞總數(shù)，還能顯著提升T細(xì)胞和B細(xì)胞的活性以及異嗜性細(xì)胞的吞噬能力[21]。

褪黑素對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用主要通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的分泌實(shí)現(xiàn)。褪黑素可增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原遞呈能力，增加MHC Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)，促進(jìn)IL-1和TNF-α的釋放。使用褪黑素治療的VEEV感染小鼠的血清中IFN-γ水平顯著提高，IL-1β水平是感染后未治療小鼠的8倍[22]。有趣的是，褪黑素可有效地抑制先天免疫反應(yīng)的放大，中和高表達(dá)的促炎因子，因此在機(jī)體發(fā)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”等過(guò)度的炎癥反應(yīng)時(shí)，褪黑素又表現(xiàn)出抗炎的作用。褪黑素可緩解由脂多糖誘導(dǎo)引起的急性肺損傷中出現(xiàn)的肺充血、肺水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，降低肺組織中IL-1β以及外周血中IL-8的水平[23]。在人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)陽(yáng)性患者宮頸黏液中，IL-6和IL-8的升高與褪黑素的濃度降低有關(guān)[24]。在RSV感染時(shí)，褪黑素治療可顯著抑制小鼠血清中TNF-α的產(chǎn)生[16]。在使用含褪黑素的BVDV疫苗免疫后，感染小鼠體內(nèi)促炎相關(guān)因子IL-1β和IL-6水平顯著降低，IFN-α和IFN-β等抗病毒相關(guān)細(xì)胞因子水平顯著升高[6]。

3.3 抗氧化作用 自由基是機(jī)體新陳代謝的產(chǎn)物，免疫細(xì)胞在吞噬異物的過(guò)程中會(huì)通過(guò)自由基機(jī)制將其清除。但當(dāng)炎癥反應(yīng)過(guò)強(qiáng)時(shí)，·OH、次氯酸(Hypochlorous acid,HOCl)、亞硝酸根陰離子(ONOO-)等自由基可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生極大的氧化損傷作用，氧化應(yīng)激損傷是造成病毒感染時(shí)組織器官損傷的重要原因之一。褪黑素是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，不僅能直接清除包含·OH、ONOO-、NO在內(nèi)的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)，對(duì)SOD、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶的活性具有增強(qiáng)作用，還能提高GSH的合成，從而增強(qiáng)機(jī)體抵抗自由基損傷的能力[25]。褪黑素可抑制急性肺損傷時(shí)一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)的活性[26]，抑制RSV感染時(shí)ROS和RNS的升高，提升SOD和GSH的活性[16]。

褪黑素的抗氧化作用還表現(xiàn)為通過(guò)維持線粒體的穩(wěn)態(tài)對(duì)細(xì)胞凋亡以及自噬進(jìn)行調(diào)控。NaveenKumar等發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過(guò)提升內(nèi)源性谷胱甘肽的水平維持中性粒細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的平衡，從而抑制由于氧化應(yīng)激引起的中性粒細(xì)胞的凋亡[26]。Ouyang等發(fā)現(xiàn)，褪黑素可改善線粒體功能障礙，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而抑制柯薩奇病毒B3引起心肌細(xì)胞的凋亡[27]。在激活自噬方面，褪黑素表現(xiàn)出不同的功能，San-Miguel等發(fā)現(xiàn)，在RHDV感染時(shí)褪黑素對(duì)細(xì)胞的自噬和凋亡均起到抑制作用[3]，但Jeong等發(fā)現(xiàn)，在朊病毒感染以及其他神經(jīng)退行性疾病中，褪黑素可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的發(fā)生保護(hù)線粒體功能和預(yù)防神經(jīng)毒性造成的損傷[28]。

4 展望

褪黑素由于其具有的抗氧化損傷和免疫調(diào)節(jié)功效受到了廣泛關(guān)注，是一種潛在的輔助治療藥物。目前，關(guān)于褪黑素在新型冠狀病毒肺炎方面的臨床研究已有10余項(xiàng)正在進(jìn)行中[29]。相比于傳統(tǒng)藥物，褪黑素具有易于合成、安全性高的特點(diǎn)，有研究顯示，在動(dòng)物試驗(yàn)中給予高達(dá)800 mg/(kg·bw)褪黑素的情況下仍未見(jiàn)任何急性毒性效應(yīng)[30]。深入探究褪黑素使用適應(yīng)癥、劑量、時(shí)機(jī)、持續(xù)時(shí)間等可為病毒感染性疾病的治療開(kāi)辟新思路。